Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo's
6 juni 2016
Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.
Het algemene doel van dit protocol is om verlies- en winst-van-functie manipulaties te gebruiken om fase-specifieke moleculen te identificeren die de differentiatie van de binnenste celmassa van muizenembryo's tijdens de pre-implantatie regelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijke vraag over de vroege celbestemming in de basis van de ontwikkelingsbiologie, evenals in de stamcelbiologie, dierkunde en reproductieve biotechnologie, zoals dierlijk klonen. Het belangrijkste doel van deze techniek is dat de fase-specifieke receptor, en er zijn liganden om de expressie van alleen embryonaal stamcel-specifieke factor tijdens de embryo-ontwikkeling te verbeteren.
Dit protocol werd ontwikkeld in samenwerking met meerdere laboratoria. Dus het demonstreren van het proces zal mijn samenwerking zijn, professor Sang Jin Lee, en zijn afstudeerstudent, Yong Il Cho. 18 tot 20 uur na de laatste injectie, offer de zwangere vrouwtjes op door verstikking met koolstofdioxide gevolgd door cervicale dislocatie.
Open vervolgens de achterkant en knip met fijne schaar door de binnenste laag. Zoek en pak de baarmoederhoorns met fijne pincetten en trek ze voorzichtig uit de lichaamsholte, samen met de baarmoeder, eileider, eierstok en vetkussens. Snijd vervolgens het gebied tussen de eileider en de eierstok met fijne schaar.
Positioneer vervolgens de pincetten opnieuw en knip de baarmoeder dicht bij de eileider, waarbij ten minste één centimeter van het bovenste deel van de baarmoeder aan de eileider blijft. Breng nu de eileiderampulla over in de met mineraaloliekoper bedekte M16 druppel media op een 35 millimeter petrischaal bij kamertemperatuur. Bundel de eileiders van verschillende muizen in dezelfde schaal.
Na het voorbereiden van de ene CC-seringnaald, zoals aangegeven in het tekstprotocol, gebruik fijne pincetten om het uiteinde van de eileider vast te houden en in te brengen. Prik vervolgens voorzichtig en pers de cumulusmassa uit de mediadruppelfas. Herstel onder een stereomicroscoop de 2-PN-embryo's samen met omringende cumulusmassa's, met behulp van een steriele glazen pipet, en breng ze over in een nieuwe petrischaal.
Ontbind vervolgens de cumuluscellen door de weefsels te baden in één milliliter hyaluronidase-oplossing. Bewaar nu de schaal bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot 10 minuten. De volgende stap is het ontdoen van de embryo's.
Gebruik de glazen pipet om de badoplossing voorzichtig te laten stromen om de cumuluscellen los te maken van de omringende embryo's. Was vervolgens de ontdoende embryo's met 30 tot 50 milliliter vers PBS per embryo. Voer deze wassing drie keer uit.
Breng nu de embryo's over in een 35 millimeter plastic schaal met M16 plus BSA en bewaar ze in een bevochtigde incubator gedurende maximaal vier uur vóór de micro-injectie. Voor de micro-injectie, was de ontdoende 2-PN-embryo's kortstondig met één milliliter vers M16. Breng vervolgens de embryo's in oplossing over in een centrifugeerbuis en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 1.000 Gs.
Breng nu elk embryo over in een kweekschaal met 20 tot 30 microliters M16-media. Dit maakt de pronuclei zichtbaar. Bedek de media met een dunne laag minerale olie en bewaar de embryo's bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide gedurende één tot twee uur.
Bereid ondertussen met een mechanische trekker de injectiepipetten en houdpipetten voor van boorsiliaatglazen capillaire buizen. Gebruik vervolgens een microgrinder en een microforge om de injectiepipetten met stompe uiteinden te fabriceren en polijst ze tot openingen van twee micron breed. De lengte van het punt moet minder dan 500 micron zijn.
Fabriceer op dezelfde manier houdpipetten door stompe uiteinden te maken en hun openingen te polijsten tot een binnendiameter van 20 micron en een buitendiameter van 100 micron. Laad nu de injectiepipetten met minimaal 200 nanoliter plasmide-oplossing met een concentratie van één microgram DNA per microliter. Monteer vervolgens de injectiepipet in een gemotoriseerde micromanipulator.
Stel vervolgens de injector in op pulsbul-ih-ses van ongeveer 10 picoliter. Voor de micro-injectie, zet de embryo's vast met behulp van negatieve druk van de houdpipet. Breng vervolgens de punt van de injectiepipet naast de celmembraan net boven een van de pronuclei.
Prikt vervolgens het celmembraan, duwt verder in de pronucleus en maakt de 10 picoliter injectie. Na de micro-injectie, verzamelt u de geïnjecteerde embryo's en wast ze drie keer met vers M16-media. Elke wassing kan minder dan een minuut duren.
Ga vervolgens verder met het kweken van de embryo's door M16-media te bedekken met een druppel minerale olie om verdamping te voorkomen en plaats elk embryo op een plastic kweekschaal op een druppel M16-media. Observeer elke 24 uur de embryo's met behulp van een confocale laser-scanning microscoop met 488 nanometer of 555 nanometer DIC-optiek bij 200x vergroting. Neogenin wordt tijdelijk tot expressie gebracht tijdens de vroege ontwikkelingsstadia van pre-implantatie.
Het verschijnt al in het 2-cellig stadium en duurt tot het vroege morulastadium. De expressie ervan is voornamelijk ruimtelijk beperkt tot de buitenkant van cellen. Neogenin-expressieniveaus werden gemanipuleerd door middel van micro-injectie van 2-PN-zygoten met neogenin cDNA-vectoren, of vectoren die korte haakjes RNA tegen neogenin bevatten.
RFP en GFP werden geco-expresseerd als indicatoren. Het resulterende neogenin-expressieniveau werd bevestigd door zowel immunofluorescentie als door immunoblotting. Er waren geen grove morfologische verschillen in zowel de neogenin-verlies als de neogenin-winst-embryo's, noch ontwikkelden ze zich anders tot het blastocyststadium.
De ICM-ontwikkeling was echter minder uitgesproken in neogenin-verlies-embryo's, zoals bepaald door Oct drie en vier positieve ICM-cellen. Er waren ook meer Oct drie en vier positieve ICM-cell
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een verlies- en functieverliesmethode om neogenin te identificeren als een stadiumspecifieke receptor die trophectoderm en inner cell mass differentiatie in pre-implantatie muis-embryo's beïnvloedt. De techniek beoogt vroege celbestemmingsbeslissingen in de ontwikkelings- en stamcelbiologie te verduidelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Stamcelbiologie
- Reproductieve biotechnologie
Achtergrond
- Het begrijpen van vroege celbestemmingsbeslissingen is cruciaal in de ontwikkelingsbiologie.
- Neogenin wordt voorgesteld als een sleutelreceptor in embryodifferentiatie.
- Dit onderzoek heeft implicaties voor dierlijke klonen en reproductieve technologieën.
- Het protocol werd ontwikkeld in samenwerking met meerdere laboratoria.
Doel van de studie
- Om stadiumspecifieke moleculen te identificeren die inner cell mass differentiatie controleren.
- Om de expressie van embryonale stamcel-specifieke factoren tijdens de ontwikkeling te verbeteren.
- Om bij te dragen aan het begrip van vroege embryonale ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Verlies- en functieverliesmanipulaties.
- Injectie van specifieke liganden om receptorexpressie te verhogen.
- Samenwerking met experts op het gebied voor protocolontwikkeling.
- Gebruik van kooldioxidevergiftiging voor humane slachting van proefpersonen.
Hoofdresultaten
- Identificatie van neogenin als een significante receptor in embryodifferentiatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode in het manipuleren van celbestemming.
- Inzichten in de rol van specifieke factoren in vroege embryonale ontwikkeling.
- Samenwerking leverde een robuust protocol op voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van vroege embryonale differentiatie.
- Bevindingen kunnen het begrip van stamcelbiologie en reproductieve technologieën verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om aanvullende receptoren en factoren te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct loss- and gain-of-function manipulation in preimplantation mouse embryos enables precise interrogation of early cell fate determinants, supporting mechanistic de-risking in developmental and stem cell biology. This approach enhances predictive confidence in target validation for genes implicated in lineage specification, informing risk-adjusted decisions at the discovery and preclinical interface. The protocol's reproducibility and quantitative outputs position it as a reusable capability for portfolio-wide evaluation of stage-specific developmental regulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes involved in early embryonic lineage commitment.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the impact of specific gene perturbations on cell fate outcomes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for developmental and regenerative medicine programs.
Screening & Assay Development
- Establishes validated embryonic systems for downstream screening of gene function and pathway modulation.
- Delivers quantitative, reproducible readouts via immunofluorescence and molecular assays.
- Prepares robust platforms for evaluating additional stage-specific genes or modulators in early development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for understanding developmental disorders and stem cell differentiation.
- Provides continuity from discovery-stage gene function interrogation to preclinical validation of developmental targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate genes with demonstrated roles in lineage specification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting hypothesis-driven target validation and mechanistic studies in embryonic development.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing for gene function in cell fate determination.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for comparative analysis of gene perturbations.
- Analytics: Enables immunofluorescence, immunoblotting, and RT-PCR quantification of lineage markers.
- Translational Research: Bridges early mechanistic insights to preclinical models of developmental regulation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reproducible workflow for evaluating multiple candidate genes across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation for developmental regulators.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation and quantification workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritization of targets with validated mechanistic roles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and triage of candidate genes in early development pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo microinjection and quantitative molecular assays.
- Demands access to specialized instrumentation, including micromanipulators and confocal microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of injection, culture, and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different model organisms or developmental stages.
- Practical limitations include technical skill requirements and embryo viability post-manipulation.
