Name: Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer F-actine puncta kwantificeren in rat corticale neuronen met immunocytochemie en fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar synaptische integriteit en plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DA013137, DA031604 en HD043680. Gedeeltelijke ondersteuning werd verleend door een NIH T32-opleidingssubsidie in biomedisch-gedragswetenschappen.

Alle dieren protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van South Carolina (assurance nummer: A3049-01) goedgekeurd. 1. Lage-dichtheid Embryonale neuronale Cultuur <ol><li> Voorbereiding voor primaire corticale neuron cultuur <ol><li> oplossingen: <ol><li> Bereid Poly-L-lysine voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg van poly-L-lysine in 10 ml Boraatbuffer. </li><li> Bereid werkoplossing door verdunning 1 ml poly-L-lysine De in 49 ml boraatbuffer. </li><li> Bereid boraatbuffer, pH 8,4 door te beginnen met 395 ml dH 2 O en vervolgens het toevoegen van alle ingrediënten (1,24 g boorzuur + 1,9 g Borax). Stel de pH tot 8,4 met 1 M NaOH. Pas tot 400 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap. </li><li> Bereid HBSS oplossing, pH 7,2 door te beginnen met 445 ml dH 2 O en het toevoegen van alle andere bestanddelen (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Stel de pH tot 7,2 met 1 N HCl, bring tot 500 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap. </li><li> Bereid plating medium: DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum. Filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap. </li><li> Bereid compleet groeimedium: Aan 50 ml Neurobasal medium, voeg de supplementen (500 ui GlutaMax (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50X) + 500 ui van antibiotica Antimycoticum-oplossing (100x) + 100 pl 7,5% natriumbicarbonaat. filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap. </li></ol></li><li> Twee dagen voor cultuur: <ol><li> Coat twaalf 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml Poly-L-Lysine werkoplossing en houdt onder de motorkap O / N. </li></ol></li><li> Een dag voor de cultuur: <ol><li> Lege bekledingsmiddel van de gerechten en spoel af met DDH 2 O. Laat gerechten te drogen voor een uur onder de motorkap. </li><li> Bereid plating medium (DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (10% van de totale oplossing). Pipetteer 2 ml medium inelke schotel en incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2. Let op: Het is belangrijk om plastic cultuur gerechten te vermijden bij het ​​kweken. Het gebruik van glazen bodem gerechten (voor omgekeerde microscopen) of dekglaasjes (voor staande microscopen) levert scherpe en heldere beelden. Vergeleken met een plastic bodem gerecht, de glazen bodem schaal voorkomt ongewenste tinten of schittering tijdens fluorescentie microscopie. </li></ol></li></ol></li><li> Celkweek protocol: <ol><li> Put gekoelde HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm petrischaaltjes, tang, schaar, 50 ml buizen, en 15 ml buizen onder UV-licht in de kap. </li><li> Euthanaseren zwangere rat met dodelijke inhalatie van 5% sevofluraan onder de motorkap buiten cultuur kamer. </li><li> Steriliseren met 70% EtOH, tent de huid van de onderbuik behulp van een tang tijdens het snijden van de staart in het midden van abdominale cavity.Open de baarmoeder met een schaar de placenta bloot. </li><li> Verwijder 8-10 E18 foetussen. Place 8-10 foetussen in petrischaaltjes met HBSS oplossing. </li><li> Houd de achterkant van het hoofd van de foetus met een tang en gebruik schaar om het hoofd van het lichaam scheiden. Plaats het in een andere petrischaal gevuld met 5-7 ml van HBSS. Transfer gerecht te capuchon. </li><li> Vul twee extra 100 mm petrischaal met koud HBSS. </li><li> Peel opzij schedel, en schep de hersenen in een nieuwe petrischaal gevuld met HBSS. </li><li> Gebruik scherp gebogen tang, aparte cerebellum en de hersenstam van de hersenen, vervolgens over te dragen hersenen om een ​​nieuwe petrischaal met koud HBSS erin. </li><li> Gebruik een pincet te beveiligen, scheiden de hemisferen met gebogen pincet. hersenvliezen te verwijderen; isoleren frontale cortex en de overdracht stukken in gemarkeerd 15 ml centrifugebuizen. </li><li> Vul de 15 ml buis met 2 ml verse HBSS en voeg 20 ul trypsine EDTA (10x geconcentreerd mengsel met 0,5% trypsine en 5,3 mM EDTA.) Aan elk 15 ml buis. </li><li> Incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Zwenk buis om de paar minuten, niet toestaan ​​dat de afwikkeling. </li><li> After 10-15 min, gebruik glazen pipet om oude HBSS te verwijderen en tweemaal spoelen met nieuwe HBSS. </li><li> Dompel in trypsineremmer (1 mg / ml, 2 mg trypsine-remmer in 2 ml HBSS), meng goed en laat het zitten 5 min. Was tweemaal met verse HBSS. </li><li> Het gebruik van glazen pipet met rubberen bol, fijnstampen hersenen stukken 10-15 keer heel langzaam om zo bubbles.Triturate voorkomen dat opnieuw met een gekalibreerde pipet en een steriel tip met een gereduceerde tip diameter heel langzaam tot homogeen. </li><li> Overdracht gedissocieerde cellen op gewenste dichtheid vooraf bereide gecoate kweekschalen (50 cellen / mm2). Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Na 24 uur werd vervangen DMEM / F12 medium met vers gemaakte volledige groei serumvrij Neurobasaal medium. </li><li> Handhaaf de cellen te allen tijde in een 5% CO2 / 95% kamerlucht bevochtigde incubator gedurende ten minste 12-14 dagen voor de experimenten. Supplement de cellen elke 5-6 dagen met vers Neurobasal medium vervangen ongeveer 50% van het oude medium. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescerende Labeling en Immunocytochemie Opmerking: De immunofluorescentie labeling van primaire corticale celkweken werd in glazen bodem 35 mm celcultuurschalen uitgevoerd met een werkvolume van 1 ml. <ol><li> Het glazen bodem schaal tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS). </li><li> Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Behandel cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een F-actine specifieke kleurstof, AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40, 25 gl Phalloidin in 1 ml PBS). </li><li> Spoel de cellen tweemaal met PBS en geblokkeerd met 10% normaal geit serum bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. </li><li> Verdun de kippen polyklonale anti-MAP2 antilichaam (1: 2500) in PBS met 2% normaal geit serum en geïncubeerd O / N bij 4 oC </li><li> Na incubatie, spoelen in PBS twee keer. </li><li> Verdun de secundaire antilichaam (Alexa Red 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG (1: 500) met 2% normaal geit serum en incubeer gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Spoelen met PBS en voeg 10 pl / schotel van Hoechst kleurstof. </li><li> Incubeer 3 min bij RT en wassen met PBS twee keer. Opmerking: De gelabelde cellen klaar voor stap 3 (F-actine puncta tellen). </li><li> Preserve cel monster met 100 ui antifade reagens als afdekproces middel en houden bij 4 ° C in het donker voor de lange termijn opslag. Opmerking: Phalloidin is relatief stabiel in PBS bij 4 ° C in het donker tot 1 week en fluorescentie kan worden geconserveerd met antifade afdekken reagentia. Echter, optimale afbeeldingen verkregen 1-3 dagen na kleuring sinds Phalloidin kan beginnen uit te verspreiden met langdurige opslag. </li></ol> 3. F-actine Puncta Counting <ol><li> Schakel fluorescentiemicroscoop en over te schakelen naar 20 × doelstelling. Open microscoop software, en het opzetten van programma van 1280 × 960 pixels beeldformaat, en 0,17 um / pixel resolutie bij 1 × zoom. </li><li> Acquire beelden van co-gelabelde F-actine / MAP2 neuronen onder groene (495 nm) / rood (613 nm) fluorescerende kanalen. </li><li> Kies 5 Green (F-actine) / Rood (MAP2) immunolabeled / blauw (Hoechst) fluorescerende beelden van individuele neuron met duidelijk omschreven dendritische priëlen. </li><li> Identificeer de F-actine rijke structuren in tweede orde dendritische segment (lengte range 25-75 pm) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. </li><li> Draai het geselecteerde gebied van beelden naar een horizontale niveau. Kopiëren en plakken als nieuwe afbeelding. </li><li> Aftrekken van de achtergrond van afbeeldingen, met een consistente dient voor elk gerecht. </li><li> Tel de felgroene F-actine puncta en traceren van de lengte van de geselecteerde dendritische segment handmatig door getrainde onafhankelijke waarnemers. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet-bestand. </li><li> Bereken de dichtheid door het totale F-actine gelabeld puncta (N) door de lengte (L) van de MAP2 gemerkte dendrieten. Express-gegevens als het aantal F-actin puncta per 10 micrometer van dendriet Opmerking: Puncta (size ≤1.5 pm) van F-actine fluorescentie met een piekintensiteit van ten minste 50% boven het gemiddelde intensiteit van kleuring in de dendritische as werden in elke geselecteerde dendritische segment. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren. Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duideli...

Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software. Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1. Niet-specifieke binding van Phalloidin verwaarloosbaar, waardoor minimale achtergrond tijdens cellulaire beeldvorming. Phalloidin is veel kleiner dan antilichamen die typisch zou worden gebruikt om cellulaire eiwitten te labelen voor fluorescentiemicroscopie, die zorgt voor veel intenser etikettering van F-actine met falloïdine. Zo kunnen gedetailleerde beelden van F-actine lokalisatie in neuronenverkregen door het gebruik van gelabelde Phalloidin. Phalloidin (F-actine) kleuring van neuronale dendrieten genereert discrete &quot;hot spots&quot; of heldere &quot;puncta&quot;, die een verscheidenheid van dendritische structuren, met inbegrip van volwassen stekels, niet-stekelige synapsen 2 en onvolwassen stekels vertegenwoordigen. Onrijpe stekels onder dunne filopodia en sommige vormen van patch morfologie, en kunnen de inleiding van spinogenesis 3 vertegenwoordigen. Onrijpe stekels en niet-stekelige flarden missen PSD95 4. Veranderingen in de productie van F-actine leiden tot latere wijzigingen in niet alleen stekels, maar ook extra dendritische structuren, waardoor Phalloidin een belangrijk instrument voor het onderzoeken van synaptodendritic integriteit 5-7. In het algemeen is het aantal Phalloidin-positieve (F-actine) puncta weerspiegelen een evenwicht tussen actieve synapsen (prikkelende en remmende), actine dynamiek en stabiliteit synaps 8. Hoewel het belangrijk dieper specifieke types synapsen (dwz excitatoire stekels), wanneer het doel van de behandeling is niet bekend moet eerst de algemene integriteit van verschillende dendritische structuren te schatten. Aangezien F-actine is een belangrijke component van spines en andere structuren, waaronder remmende synapsen, een veranderde aantal F-actine puncta kan synaptopathy duiden. Dit synaptopathy kan dan verder worden onderzocht voor meer specifieke aanpassingen. Onze kwantificatie methode voor het opsporen van meerdere synaptische typen / structuren levert een totale raming van dendritische synaptische veranderingen (stijgingen en dalingen) na verschillende experimentele behandelingen.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglas</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic solution</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Chicken polyclonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements softwarepakket</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E invertede fluorescente computergestuurde microscoop&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;m Nalgene nylon membraanfilter</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van draadvormige actine (f-actine) puncta in rat corticale neuronen

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo&#39;s worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &amp;# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.

In de huidige methoden, moeten we eerst cultuur rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten, die ons in staat stelt om de dendrieten van individuele neuronen te identificeren. In figuur 1, de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden tonen de morfologische veranderingen in de ontwikkeling foetale rat corticale neuronen op dag 4, 6, 10, 14, 21 en 27 in vitro. Merk op dat de lengte en het aantal dendrieten toenemen rijping va...

Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Het algemene doel van deze kwantificering van filamenteus actine-puncta in gekweekte neuronen is het introduceren van een nuttige methode voor het bestuderen van de integriteit en cognitiviteit van synaptische structuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen over spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een gedetailleerd protocol biedt voor primaire neuronale kweek, gevolgd door de identificatie en kwantificering van F-actine-puncta.Wanneer het beoogde doel onbekend is, is het noodzakelijk om de algemene integriteit van de ratia fundantric-structuren te schatten. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van neuronale schade veroorzaakt door drugs van misbruik zoals cocaïne, en HIV-toxische eiwitten zoals tat en JP 120. Coat twee dagen voor het opzetten van de cultuur 12 glazen bodemschalen van 35 millimeter met twee milliliters Poly-L lysine-werkoplossing. Bewaar de schalen vervolgens 's nachts in de zuurkast om de steriliteit te waarborgen.Gooi de volgende dag het coatingmiddel weg en spoel de schalen af met dubbel gedestilleerd water. Laat de schalen één uur drogen onder de zuigkast. Breng vervolgens twee milliliters platingmedium over naar elke schaal.Incubeer de schalen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Plaats op de dag van de kweek de geoogste hersenen in een petrischaal met koud HBSS. Fixeer vervolgens de hersenen met een pincet en gebruik de gebogen pincet om de hemisferen te scheiden en de hersenvliezen te verwijderen.Isoleer de frontale cortices en breng de stukken over in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg twee milliliters vers HBSS en 20 microliters trypsine EDTA toe aan de buis en incubeer de neurale weefsels gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur, waarbij u elke paar minuten voorzichtig zwenkt.Gebruik aan het einde van de incubatie een glazen pipet om alle oude HBSS af te zuigen. Spoel de cortices vervolgens twee keer met verse HBSS. Dompel het weefsel na de tweede wasbeurt onder in trypsinremmer.Meng goed en laat het monster vijf minuten rusten bij kamertemperatuur. Was de weefsels vervolgens twee keer met vers HBSS. Gebruik nu een glazen pipet met een rubberen ballon om de hersenfragmenten zeer langzaam 10 tot 15 keer te tritureren.Tritureer vervolgens de weefselsuspensie zeer langzaam opnieuw met een gekalibreerde pipet die is voorzien van een steriele tip met een gereduceerde diameter. Wanneer de oplossing homogeen is, worden de cellen met de juiste dichtheid uitgeplaat in de vooraf gecoate kweekschaaltjes voor een incubatie van een nacht in de celkweekincubator. Vervang na 24 uur het plaatmedium door vers bereid compleet groeiserumvrij narrow basal medium.Plaats de cellen vervolgens gedurende ten minste 12 tot 14 dagen terug in de celkweekincubator. Plating met een lage dichtheid is belangrijk om de individuele neuronen te kunnen visualiseren. Bovendien is het neuronale basismedium essentieel om de proliferatie van astrocyten binnen de celculturen te minimaliseren.Om de cellen te labelen voor immunocytochemie, was eerst de glazen kweekschaal twee keer met PBS. Fixeer de cellen vervolgens met vier procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten met PBS.Permeabiliseer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten met 0,1% Triton X 100 in PBS en label ze bij kamertemperatuur met een F-actine-specifieke kleuring. Spoel de cellen na 20 minuten twee keer af met PBS en blokkeer eventuele aspecifieke celoppervlakkleuring met 10% normaal geiten serum. Label de cellen aan het einde van de incubatie gedurende de nacht bij vier graden Celsius met een kippen polyklonaal anti-map twee antilichaam.Spoel de cellen de volgende ochtend twee keer met PBS en label ze met het juiste secundaire antilichaam. Na twee uur bij kamertemperatuur worden de cellen opnieuw met PBS gespoeld en gedurende drie minuten bij kamertemperatuur gelabeld met 10 microliters huxs. Was de cellen vervolgens nog twee keer met PBS en conserveer ze met 100 microliters anti-fade reagens.Zet binnen drie dagen na deze kleuring de fluorescentiemicroscoop aan en selecteer het 20 X objectief. Stel vervolgens in de microscopiesoftware de pixelafmetingen van de afbeelding in op 1600 bij 1200 en de beeldresolutie van 0,17 micron per pixel op 1 X zoom. Plaats de schaal met cellen op de tafel van de microscoop.En leg beelden vast van de co-gelabelde F-actine Map2-neuronen onder de groene en rode fluorescentiekanalen. Wanneer alle beelden zijn verkregen, selecteer dan vijf beelden van individuele neuronen in de groene, rode en blauwe kanalen met duidelijk gedefinieerde dendritische vertakkingen. Gebruik vervolgens continue Map2-immunofluorescentie om de F-actinerijke structuren in de dendritische segmenten van de tweede orde te identificeren.Roteer het geselecteerde gebied van de afbeeldingen horizontaal. Kopieer en plak vervolgens het gebied als een nieuwe afbeelding. Trek daarna de achtergrondfluorescentie van de afbeelding af en gebruik de software om het aantal heldergroene F-actine puncta te tellen.Gebruik getrainde onafhankelijke waarnemers om de lengte van de geselecteerde dendritische segmenten te meten. Exporteer vervolgens de aantallen puncta en de gegevens over de lengte van de dendritische segmenten naar een spreadsheetbestand. Zorg ervoor dat waarnemers F-actin posture puncta meerekenen met een roze fluorescentie-intensiteit van ten minste 50% boven de gemiddelde kleurintensiteit in de dendritische schacht van elk geselecteerd segment.Bereken tot slot de dichtheid volgens de formule, waarbij de gegevens worden uitgedrukt als het aantal F-actin-puncta per tien micron dendriet. Hier tonen differential interference contrast-beelden de morfologische veranderingen die zijn waargenomen in ontwikkelende foetale corticale neuronen van ratten op dag 4 tot 27 en vitro. Let op de toename in lengte en aantal van de dendrieten naarmate de gekweekte primaire ratneuronen rijpen.Omdat phalloïdine-labeling van F-actine zeer snel verloopt, is het mogelijk om de integriteit van het synapto-dendritische netwerk visueel in te schatten voordat men overgaat tot de immunocytochemische antilichaamlabeling. Map2 kleurt de intacte dendrieten, wat bevestigt dat de F-actine puncta zich op de neuronale dendrieten bevinden en niet gelokaliseerd zijn in andere cellen, zoals astrocyten. In beelden met een hoge resolutie kunnen F-actine-rijke structuren worden waargenomen, waaronder filopodia, spine-uitstulpingen en F-actine patches.In dit experiment om de door HIV 1 tat geïnduceerde synapto-dendritische schade te beoordelen, onthulde Map2-kleuring minder dendritische vertakkingen en verminderd F-actine in corticale neuronen van ratten na de behandeling met HIV 1 tat. F-actine puncta nemen inderdaad toe of af als reactie op de experimentele behandeling. Zo vertoonden de F-actine-positieve puncta een significante toename in dichtheid in dit experiment wanneer de gekweekte neuronen werden behandeld met de niet-competitieve NMDA-receptorantagonist memantine.Daarentegen leidde behandeling met een combinatie van methamphetamine en HIV1 tat tot een significant verlies van de F-actine puncta. Nadat er beelden met hoge resolutie zijn gemaakt van de met coëline gelabelde F-actine Map2 neuronen, moeten twee getrainde waarnemers segmenten van de dendrieten van de tweede orde selecteren voor analyse van de puncta-dichtheden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappelijke research.Niet alleen voor de monitoring van acute synaptopathie, maar ook voor de studie van synaptisch herstel en experimentele neurale restauratieprocessen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een betrouwbare methode ontwikkelt voor het meten van de synaptische integriteit van het neurale dendritische netwerk.

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Een methode om te visualiseren en te kwantificeren F-actine weerhaken eindigt in neuronale groei kegels wordt beschreven. Na het kweken neuronen op glas dekglaasjes worden cellen gepermeabiliseerd met een saponine-bevattende oplossing. Dan, een korte incubatie met de saponine buffer met rhodamine-actine bevat fluorescerende actine op gratis actine prikkeldraad eindigt.

Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones

This video demonstrates the procedure for fluorescently staining rat cortical neurons for microscopy. It targets F-actin and dendritic proteins to analyze structural integrity and calculate F-actin density, which is crucial for studying neuronal function and health.

Quantification of Filamentous Actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

Leer F-actine puncta kwantificeren in rat corticale neuronen met immunocytochemie en fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar synaptische integriteit en plasticiteit.

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Meer video's verkennen