Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Het algemene doel van deze kwantificering van filamenteus actine-puncta in gekweekte neuronen is het introduceren van een nuttige methode voor het bestuderen van de integriteit en cognitiviteit van synaptische structuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen over spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een gedetailleerd protocol biedt voor primaire neuronale kweek, gevolgd door de identificatie en kwantificering van F-actine-puncta.

Wanneer het beoogde doel onbekend is, is het noodzakelijk om de algemene integriteit van de ratia fundantric-structuren te schatten. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van neuronale schade veroorzaakt door drugs van misbruik zoals cocaïne, en HIV-toxische eiwitten zoals tat en JP 120. Coat twee dagen voor het opzetten van de cultuur 12 glazen bodemschalen van 35 millimeter met twee milliliters Poly-L lysine-werkoplossing. Bewaar de schalen vervolgens 's nachts in de zuurkast om de steriliteit te waarborgen.

Gooi de volgende dag het coatingmiddel weg en spoel de schalen af met dubbel gedestilleerd water. Laat de schalen één uur drogen onder de zuigkast. Breng vervolgens twee milliliters platingmedium over naar elke schaal.

Incubeer de schalen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Plaats op de dag van de kweek de geoogste hersenen in een petrischaal met koud HBSS. Fixeer vervolgens de hersenen met een pincet en gebruik de gebogen pincet om de hemisferen te scheiden en de hersenvliezen te verwijderen.

Isoleer de frontale cortices en breng de stukken over in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg twee milliliters vers HBSS en 20 microliters trypsine EDTA toe aan de buis en incubeer de neurale weefsels gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur, waarbij u elke paar minuten voorzichtig zwenkt.

Gebruik aan het einde van de incubatie een glazen pipet om alle oude HBSS af te zuigen. Spoel de cortices vervolgens twee keer met verse HBSS. Dompel het weefsel na de tweede wasbeurt onder in trypsinremmer.

Meng goed en laat het monster vijf minuten rusten bij kamertemperatuur. Was de weefsels vervolgens twee keer met vers HBSS. Gebruik nu een glazen pipet met een rubberen ballon om de hersenfragmenten zeer langzaam 10 tot 15 keer te tritureren.

Tritureer vervolgens de weefselsuspensie zeer langzaam opnieuw met een gekalibreerde pipet die is voorzien van een steriele tip met een gereduceerde diameter. Wanneer de oplossing homogeen is, worden de cellen met de juiste dichtheid uitgeplaat in de vooraf gecoate kweekschaaltjes voor een incubatie van een nacht in de celkweekincubator. Vervang na 24 uur het plaatmedium door vers bereid compleet groeiserumvrij narrow basal medium.

Plaats de cellen vervolgens gedurende ten minste 12 tot 14 dagen terug in de celkweekincubator. Plating met een lage dichtheid is belangrijk om de individuele neuronen te kunnen visualiseren. Bovendien is het neuronale basismedium essentieel om de proliferatie van astrocyten binnen de celculturen te minimaliseren.

Om de cellen te labelen voor immunocytochemie, was eerst de glazen kweekschaal twee keer met PBS. Fixeer de cellen vervolgens met vier procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten met PBS.

Permeabiliseer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten met 0,1% Triton X 100 in PBS en label ze bij kamertemperatuur met een F-actine-specifieke kleuring. Spoel de cellen na 20 minuten twee keer af met PBS en blokkeer eventuele aspecifieke celoppervlakkleuring met 10% normaal geiten serum. Label de cellen aan het einde van de incubatie gedurende de nacht bij vier graden Celsius met een kippen polyklonaal anti-map twee antilichaam.

Spoel de cellen de volgende ochtend twee keer met PBS en label ze met het juiste secundaire antilichaam. Na twee uur bij kamertemperatuur worden de cellen opnieuw met PBS gespoeld en gedurende drie minuten bij kamertemperatuur gelabeld met 10 microliters huxs. Was de cellen vervolgens nog twee keer met PBS en conserveer ze met 100 microliters anti-fade reagens.

Zet binnen drie dagen na deze kleuring de fluorescentiemicroscoop aan en selecteer het 20 X objectief. Stel vervolgens in de microscopiesoftware de pixelafmetingen van de afbeelding in op 1600 bij 1200 en de beeldresolutie van 0,17 micron per pixel op 1 X zoom. Plaats de schaal met cellen op de tafel van de microscoop.

En leg beelden vast van de co-gelabelde F-actine Map2-neuronen onder de groene en rode fluorescentiekanalen. Wanneer alle beelden zijn verkregen, selecteer dan vijf beelden van individuele neuronen in de groene, rode en blauwe kanalen met duidelijk gedefinieerde dendritische vertakkingen. Gebruik vervolgens continue Map2-immunofluorescentie om de F-actinerijke structuren in de dendritische segmenten van de tweede orde te identificeren.

Roteer het geselecteerde gebied van de afbeeldingen horizontaal. Kopieer en plak vervolgens het gebied als een nieuwe afbeelding. Trek daarna de achtergrondfluorescentie van de afbeelding af en gebruik de software om het aantal heldergroene F-actine puncta te tellen.

Gebruik getrainde onafhankelijke waarnemers om de lengte van de geselecteerde dendritische segmenten te meten. Exporteer vervolgens de aantallen puncta en de gegevens over de lengte van de dendritische segmenten naar een spreadsheetbestand. Zorg ervoor dat waarnemers F-actin posture puncta meerekenen met een roze fluorescentie-intensiteit van ten minste 50% boven de gemiddelde kleurintensiteit in de dendritische schacht van elk geselecteerd segment.

Bereken tot slot de dichtheid volgens de formule, waarbij de gegevens worden uitgedrukt als het aantal F-actin-puncta per tien micron dendriet. Hier tonen differential interference contrast-beelden de morfologische veranderingen die zijn waargenomen in ontwikkelende foetale corticale neuronen van ratten op dag 4 tot 27 en vitro. Let op de toename in lengte en aantal van de dendrieten naarmate de gekweekte primaire ratneuronen rijpen.

Omdat phalloïdine-labeling van F-actine zeer snel verloopt, is het mogelijk om de integriteit van het synapto-dendritische netwerk visueel in te schatten voordat men overgaat tot de immunocytochemische antilichaamlabeling. Map2 kleurt de intacte dendrieten, wat bevestigt dat de F-actine puncta zich op de neuronale dendrieten bevinden en niet gelokaliseerd zijn in andere cellen, zoals astrocyten. In beelden met een hoge resolutie kunnen F-actine-rijke structuren worden waargenomen, waaronder filopodia, spine-uitstulpingen en F-actine patches.

In dit experiment om de door HIV 1 tat geïnduceerde synapto-dendritische schade te beoordelen, onthulde Map2-kleuring minder dendritische vertakkingen en verminderd F-actine in corticale neuronen van ratten na de behandeling met HIV 1 tat. F-actine puncta nemen inderdaad toe of af als reactie op de experimentele behandeling. Zo vertoonden de F-actine-positieve puncta een significante toename in dichtheid in dit experiment wanneer de gekweekte neuronen werden behandeld met de niet-competitieve NMDA-receptorantagonist memantine.

Daarentegen leidde behandeling met een combinatie van methamphetamine en HIV1 tat tot een significant verlies van de F-actine puncta. Nadat er beelden met hoge resolutie zijn gemaakt van de met coëline gelabelde F-actine Map2 neuronen, moeten twee getrainde waarnemers segmenten van de dendrieten van de tweede orde selecteren voor analyse van de puncta-dichtheden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappelijke research.

Niet alleen voor de monitoring van acute synaptopathie, maar ook voor de studie van synaptisch herstel en experimentele neurale restauratieprocessen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een betrouwbare methode ontwikkelt voor het meten van de synaptische integriteit van het neurale dendritische netwerk.