In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine
8 januari 2016
Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.
Het algemene doel van bioluminescente beeldvorming is om in vivo functionele calciumtransienten, een proxy voor activiteit, voor langere perioden en in diepe hersenstructuren te beeldvormen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals hoe de basale activiteit van de vliegenhersenen eruitziet tijdens de slaap. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen excitatie vereist met behulp van uw laser.
Dit stelt iemand in staat om calciumtransienten dieper in het weefsel te beeldvormen, en voor een langere periode zonder fotobleken en toxiciteit, in vergelijking met klassieke calciumbeeldvorming. Deze methode kan inzicht geven in de basale hersenactiviteit in drosophila, en kan ook worden gebruikt met andere modelorganismen, zoals de muis. Om te beginnen, bereid de drosophila melanogaster lijn van belang voor, en de experimentele oplossingen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.
Vervolgens, anesthesieer een enkele drosophila door het gedurende twee minuten over te brengen naar een glazen glas op ijs. Vervolgens, verplaats de vlieg naar een gekoelde petrischaal, en gebruik een paar pincetten om de vlieg voorzichtig in een 1000 microliter pipettepunt te plaatsen, bijgesneden zodat het punt op een hoek van ongeveer 35 graden staat. Gebruik een borstel om voorzichtig elke vlieg te duwen en uit te lijnen, zodat het hoofd volledig voorbij de rand van de punt is, en de dorsale regio gedeeltelijk blootgesteld is.
Vervolgens, breng voorbereide tandlijm aan van het hoofd tot aan de rand van de pipettepunt. Wees extra voorzichtig om de kruin van het hoofd te vermijden. Het lijmen van het hoofd is cruciaal omdat het veiligstellen in de juiste positie essentieel is voor succesvolle dissectie en beeldvorming.
Bovendien, zal slecht lijmen leiden tot lekkage van de ringer-oplossing en de dood van het monster vóór beeldvorming. Plaats vervolgens de pipettepunt, met de bevestigde vlieg, door het gat in de opnamekamer, en druk voorzichtig om het op zijn plaats te bevestigen. Gebruik vervolgens een voorbereide siliconenlijm om de platte kant van de kamer te bevestigen waar deze de pipettepunt ontmoet om lekkages te voorkomen.
Bevestig een stuk tap boven het profusiekanaal, de korte rand, en breid uit naar de achterkant van de kamer. Plaats vervolgens de kamer met de vlieg onder de microscoop en zet de fluorescentielamp aan. Pipet vervolgens een milliliter ringer-oplossing in de kamer.
Gebruik een fijn chirurgisch mes om parallelle incisies te maken van de achterkant van het vliegshoofd naar de antenneregio aan beide kanten. Snijd vervolgens langs de rand van het oog, en maak een loodrechte incisie boven de antenne die de vorige incisies verbindt. Maak een laatste incisie aan de achterkant van het hoofd, en gebruik vervolgens een paar fijne, scherpe pincetten om het cuticel te verwijderen.
Grijp voorzichtig en verwijder eventueel blootgesteld ademhalingsweefsel tot de hersenen en de fluorescerende paddenstoelvormige lichaam duidelijk zichtbaar zijn. Gebruik vervolgens ultrascherpe pincetten om voorzichtig het neurale epitheelweefsel dat de hersenen bedekt vast te grijpen en te knijpen om het te verwijderen en het toe te staan om door de coelenterazine te dringen. Gebruik een pipette om het weefsel twee keer te wassen met een milliliter ringer-oplossing om eventueel resterend puin uit de dissectie te verwijderen, en plaats vervolgens het monster in een donkere doos.
Pipet vervolgens een milliliter ringer-oplossing, die vijf micromolar benzyl-coelenterazine bevat, in de kamer. Sluit de doos en incubeer het monster gedurende minimaal twee uur op kamertemperatuur. Begin met het inschakelen van de microscoop op de computer.
Koel ook de camera af tot min 80 graden Celsius. Stel vervolgens het afvoersysteem in en pas de omgevingscontroles aan op 20 graden Celsius. Open vervolgens de fotonbeeldvormer, maak een nieuwe map aan en noem de eerste opname.
Stel vervolgens het profusiesysteem in door het kaliumchloride, nicotine en ringer-oplossing toe te voegen aan hun respectieve reservoirs. Pas de stroomsnelheid aan zodat elke oplossing ontlast bij twee milliliter per minuut. Plaats vervolgens het monster op de montage onder de microscoop en pas de vergroting aan op 5X.
Voer vervolgens de profusiebuis in door het kanaal via de punctie. Stel de microscoop in op de fluorescentiemodus, en breng vervolgens de paddenstoelvormige lichamen in het centrum en in focus. Zodra de paddenstoelvormige lichamen in focus zijn, verander de vergroting naar 20X.
Centreer het beeld opnieuw en pas de focus aan. Positioneer vervolgens het afvoerapparaat boven de afvoerpool en pas de hoogte van de afvoershunt aan, zodat de punt net boven de afvoerpool ligt. Spoel vervolgens het monster gedurende 30 seconden met ringer-oplossing om te controleren op voldoende afvoer.
Trek ten slotte de schild neer om het apparaat af te sluiten van enig buitenlicht. Gebruik het geautomatiseerde systeem in het fotonbeeldvormerprogramma om fijne aanpassingen aan de focus te maken, en neem een referentiefluorescentiebeeld van de paddenstoelvormige lichamen. Pas de fotonsnelheid aan op de gewenste opnamesnelheid, wat overal van één beeld elke 50 milliseconden tot één per seconde, of meer, kan zijn.
Selecteer vervolgens de fotonmodus en open de sluiter. Voer vervolgens het genotype, geslacht, leeftijd en monstersnummer in de logboekvermeldingen in. Pas de positie van de regio-interesboxen aan boven de kelk, de cellichamen en de mediale lobben aan door op de boxen te klikken en ze naar de gewenste positie te slepen terwijl u controle vasthoudt.
Nu, neem baselinewaarden op gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten. Draai vervolgens de schakelaar om de stroom van nicotine te beginnen. Tegelijkertijd, druk op enter en voeg een opmerking toe om aan te geven dat de stroom van nicotine is begonnen.
Na één min
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert een nieuwe bioluminescente beeldtechniek voor in vivo functionele beeldvorming van calciumtransiënten. De methode maakt gebruik van een GFP-aequorine-construct dat bindt aan Ca2+ en licht uitzendt, waardoor langdurige beeldvorming in diepe hersenstructuren mogelijk is zonder dat laser-excitatie nodig is.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurobiologie
- Calcium-imaging
- Bioluminescentie-imaging
Achtergrond
- Calciumtransiënten dienen als indicatoren voor neuronale activiteit.
- Traditionele calcium-imagingtechnieken kunnen fotobleken en toxiciteit veroorzaken.
- Het in beeld brengen van diepe hersenstructuren is uitdagend met conventionele methoden.
- Het begrijpen van basale hersenactiviteit is essentieel voor neurobiologisch onderzoek.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor langetermijnbeeldvorming van calciumtransiënten.
- Het mogelijk maken van beeldvorming in diepe hersenregio's.
- Het verkrijgen van inzicht in de basale activiteit van de vliegenhersenen tijdens de slaap.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een GFP-aequorine gefuseerd construct.
- Voorbereiding van Drosophila melanogaster lijnen voor beeldvorming.
- Experimentele oplossingen zoals beschreven in het protocol.
- In vivo beeldvorming zonder laserstroomexcitatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle langetermijnbeeldvorming van calciumtransiënten in Drosophila.
- Vermogen om diepe hersenstructuren te bereiken zonder fotobleken.
- Inzichten in de basale activiteit van de vliegenhersenen.
- Potentiële toepasbaarheid op andere modelorganismen, zoals muizen.
Conclusies
- De bioluminescente beeldvormingstechniek biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van klassieke methoden.
- Deze methode kan ons begrip van neurobiologische processen verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek toepassen op diverse modelorganismen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Bioluminescente calcium-imaging met GFP-aequorine maakt langdurige functionele beeldvorming in diepe weefsels in vivo mogelijk zonder laser-excitatie, waardoor belangrijke beperkingen zoals fotobleken en toxiciteit bij traditionele calcium-imaging worden ondervangen. Deze benadering ondersteunt de aanhoudende monitoring van neuronale activiteit in complexe neurale circuits, wat een maatstaf biedt voor basale en gestimuleerde hersentoestanden die relevant zijn voor neurofarmacologie en targetvalidatie. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van calciumdynamiek over langere perioden mogelijk te maken, wat mechanisch de-risking in de vroege ontdekkingsfase faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door calciumtransiënten te meten als een directe proxy voor neuronale activatie in reactie op farmacologische stimuli.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via aanhoudende imaging met een hoge temporele resolutie van intracellulaire calciumfluxen in genetisch gedefinieerde neurale populaties.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetengagement en padmodulatie door zowel binnenwaartse calciumtransiënten als calciumsignalen uit interne voorraden over tijd vast te leggen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert stabiele, transgene biologische systemen (bijv. Drosophila, muis) met gerichte GFP-aequorine-expressie voor consistente, reproduceerbare calciumfluxmetingen.
- Kwantitatieve output: Levert read-outs op basis van fotonaantallen die kinetische analyse mogelijk maken van agonist-geïnduceerde responsen, zoals op nicotine of kaliumchloride, ter ondersteuning van dosis-respons- en EC50-bepalingen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met perfusiesystemen en geautomatiseerde foton-imagingplatformen, waardoor gestandaardiseerde screening van verbindingen over meerdere genotypen en condities mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert de studie van leer- en geheugencircuits (bijv. de mushroom bodies in Drosophila) waarbij calciumsignalering betrokken is bij cognitieve functies en neuropsychiatrische stoornissen.
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale beeldvorming mogelijk, van basisactiviteit via farmacologische uitdaging tot herstel, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in preklinische pipelines ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in het targetmechanisme door blootstelling aan verbindingen te koppelen aan real-time, kwantificeerbare calciumdynamiek in intact neuraal weefsel.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows als functionele readout na target-engagement, waarmee een brug wordt geslagen tussen biochemische assays en fenotypische screening door real-time, activiteitsgebaseerde validatie van neurale target-modulatie te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door calciumresponsen op neuromodulatoren (bijv. nicotine) in gedefinieerde hersenregio's in beeld te brengen, waardoor targets die betrokken zijn bij synaptische signalering kunnen worden gede-riskt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve calciumfluxgegevens via fotontelling, wat vergelijking van de effectiviteit en werkingsduur van verbindingen over experimentele groepen mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert tellingssnelheidscurves en area-under-curve metrieken waarmee teams de responsmagnitude, kinetiek en herstel tussen condities kunnen vergelijken, wat structurele activiteitsrelatie (SAR) analyse ondersteunt.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door beeldvorming mogelijk te maken in geconserveerde circuits (bijv. mushroom bodies) die betrokken zijn bij gedragsmatige output, met toepasbaarheid op mammaliaanse modellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar beeldvormingsplatform voor longitudinale studies, waardoor de noodzaak voor herhaalde modelpreparatie afneemt en standaardisatie over projecten heen wordt ondersteund.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door directe observatie van calcium-gemedieerde neuronale activiteit mogelijk te maken zonder storende fototoxiciteit of bleaching-artefacten.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en standaardisatie via genetisch gecodeerde reporters en gecontroleerde perfusiesystemen, waardoor variabiliteit tussen runs en laboratoria wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het leveren van aanhoudende functionele gegevens met een hoge resolutie, wat uitval in een laat stadium door onverwachte effecten in het neurale netwerk vermindert.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van kwantitatieve calciumresponsprofielen, wat de kapitaalefficiëntie bij leadoptimalisatie ondersteunt.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in genetische modelsystemen (bijv. GAL4/UAS in Drosophila) en moleculaire biologie voor de generatie en validatie van transgene lijnen.
- Afhankelijk van infrastructuur voor fotondetectie, waaronder gekoelde camera's (-80°C), foton-imagingsystemen en perfusiesystemen voor oplossingsuitwisseling.
- Maakt standaardisatie van de coelenterazine-lading, incubatietijden en baseline-registratieprotocollen noodzakelijk om de vergelijkbaarheid tussen monsters te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het overdragen van de aanpak naar andere soorten (bijv. muis vs. vlieg) vanwege verschillen in de penetratie van de bloed-hersenbarrière en de toediening van cofactoren.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van donkere-kamercondities tijdens de fotondetectie en zorgvuldige hantering van coelenterazine, dat lichtgevoelig is en verse bereiding vereist.
