Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in Arabidopsis Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Het algemene doel van deze voorbereiding van anatomische dwarsdoorsneden is om de relatieve kristallen en cellulose-accumulatie op cellulair niveau te kwantificeren, waardoor directe vergelijkingen mogelijk worden tussen de verschillende weefsels in de primaire Arabidopsis-wortel. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van plantenfysiologie en -ontwikkeling te beantwoorden, zoals hoe de cellulaire samenstelling van een bepaald celtype van invloed is op de groei van een heel orgaan. Na het steriliseren van Arabidopsis-zaad volgens het tekstprotocol, spreidt u de steriele zaden uit op platen met 0,8% planten-agar en 0,5XM-medium.

Wickel de platen met parafilm en bedek ze met aluminiumfolie. Bewaar de platen een tot vier dagen bij 4 graden Celsius om een uniforme kieming te bevorderen. Breng de platen vervolgens over naar een groeikamer die geschikt is voor het kweken van Arabidopsis-zaailingen, waarbij de platen verticaal worden geplaatst om wortelgroei bovenop het agar-medium te behouden. Bereid Richardson's oplossing volgens het tekstprotocol. Filter deze vóór gebruik door een door een spuit aangedreven 0,22 micron PVD-filtereenheid.

Bereid vervolgens onder een chemische kap 50 milliliter fixeermiddel door 38 ml van 0,5M natriumcacodylaat te combineren met 2,5 ml glutaaraldehyde. Voeg vervolgens 100 microliters van Richardson's oplossing toe aan de fixeeroplossing om de definitieve fixeeroplossing te genereren. Gebruik een vooraf gemarkeerde plaat en plaats 2 tot 3 ml van de definitieve fixeeroplossing in de putjes, zodat de oplossing de zaailingen volledig bedekt.

Gebruik plastic pincetten om voorzichtig maximaal 10 zaailingen in elk putje over te brengen. Gebruik parafilm om de platen te verzegelen voordat ze in het donker worden bewaard bij 4 graden Celsius voor minimaal één nacht en maximaal één week. Gebruik pincetten om de gefixeerde zaailingen te dehydrateren en breng ze over in de putjes van nieuwe gemarkeerde zes-putjes platen die toenemende concentraties ethanol bevatten voor de hier vermelde tijden.

Bereid infiltratiemedium voor in een kleine glazen fles door de inhoud van een zak Historesin Activator te mengen met 50 ml basisvloeibare hars. Plaats een magneet en roer de oplossing 20 minuten op een roerplaat. Vul de gelabelde putjes van een zes-putjes plaat met 2 tot 3 ml infiltratiemedium.

Als de zaailingen volledig gedehydrateerd zijn, gebruikt u pincetten om ze over te brengen van de 95% ethanol-oplossing naar het infiltratiemedium, waarbij u ervoor zorgt dat ze volledig door het medium worden bedekt. Bewaar de monsters bij 4 graden Celsius gedurende minimaal vier dagen om maximale penetratie in de plantweefsels te garanderen. Om blokken te bereiden, plaatst u kleine etiketten, met potlood gemarkeerd met de naam van het monster, in elke put van de inbeddingsvormen.

Bereid beddende medium voor door 1 ml verharder toe te voegen aan 15 ml infiltratiemedium. Vul met ongeveer 200 microliters beddende medium de helft van elk putje in de mal. En gebruik een stuk overheadfilm om de mal te bedekken met extra 1 ml aan elke kant.

Incubeer de mallen op kamertemperatuur gedurende minimaal twee uur om gedeeltelijke polymerisatie mogelijk te maken. Bereid vervolgens een extra batch beddende medium en houd deze lekker om polymerisatie te voorkomen terwijl de wortelpunten in de mal worden gerangschikt. Voeg beddende medium toe aan een kleine plaat en plaats een zaailing in een medium.

Gebruik onder een dissectief microscoop een scalpel om elke wortelpunt te snijden en plaats deze vervolgens heel voorzichtig in de mal, ongeveer 2 tot 3 mm van de rand van de mal, verticaal voor dwarsdoorsneden of horizontaal voor lengtedoorsneden. Nadat het weefsel is gerangschikt, gebruik beddende medium om de mal volledig te vullen en bedek deze met een overheadfilm. Incubeer vervolgens op kamertemperatuur gedurende minimaal twee uur. Plaats de blokken in een droogkast met droog silicagel en laat ze een nacht op kamertemperatuur.

Gebruik een mesmaker uitgerust met een diamantschaaf om glazen messen van glasstaven te maken, door de glasweg in een vierkant te snijden en vervolgens het vierkant diagonaal te snijden om twee messen te produceren. Controleer of beide messen scherpe randen hebben. Monteer een blok in een houder.

Vervolgens verwijdert u met een enkelzijdig industrieel mes het overtollige blokmateriaal tot op één mm van de wortelpunt om een piramidevorm te verkrijgen. Snijd het gevormde blok in plakken van 2 tot 3 micron breed en breng de plakken over naar een gemarkeerde glazen plaat. Voeg vervolgens waterdruppels toe op de plakken.

Het is belangrijk om secties te bereiden die uniform van breedte zijn om de variabiliteit van geanalyseerde gegevens te minimaliseren. Plaats de glazen platen op de hitteblokken ingesteld op lage temperatuur totdat het water verdampt. Om platen voor bekijken onder een gepolariseerd microscoop voor te bereiden, verdunt u Richardson's oplossing tot 2% van de oorspronkelijke oplossing en gebruikt u ongeveer 1 ml om de plakken te bedekken.

Plaats vervolgens de monsters gedurende 5 seconden op de hitteblok en gebruik gedestilleerd water om ze te wassen. Na het drogen van de platen op de hotplate, observeert u de plakken onder een dissectief microscoop en gebruikt u een marker om de achterkant van een plaat te markeren om de positie van de plakken van belang aan te geven. Voeg 100 microliters montagemedium toe voordat u de plaat bedekt met de dekglas.

Beeld op en analyseer volgens het tekstprotocol. Hier wordt een dwarsdoorsnede van de primaire Arabidopsis-wortel getoond met radiale organisatie van de samenstellende cellen en weefsels, inclusief niet-haarcellen, haarcellen en cortex. Deze confocale afbeelding toont BRI1-GFP-expressie in niet-haarcellen in een BRI1-mutante achtergrond die de unidirectionele expansie van aangrenzende cellen en de groei van de hele wortel remt.

Zoals hier te zien is, vertoonden lengtedoorsneden van de wortels verkregen uit wild type en uit lijnen die BRI1 in niet-haarcellen tot expressie brengen een vergelijkbare oriëntatie van cellulosemicrofibrillen met een hoge variabiliteit van hoeken a