Name: Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in Arabidopsis Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer hoe je kristallijne cellulose kwantificeert in Arabidopsis wortels met gepolariseerd licht. Deze methode biedt inzicht in celwandsamenstelling en plantengroei op cellulair niveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. M. Rosenberg voor haar advies en hulp met anatomische secties. We danken ook D. Eisler voor zijn technische bijstand. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binationale Landbouwonderzoek en Ontwikkeling (BARD; IS-4246-09), en Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Plant Groei <ol><li> Surface steriliseren zaden. <ol><li> Steriliseren zaden (tot 30 mg) door natte of droge methode. Als voorbeeld voor droge sterilisatiemethode, voeg 1 ml glaciaal 37% HCl in 50 ml bleekmiddel, in een glazen beker in een gesloten exsiccator gedurende tenminste 4 uur en tot overnacht. Voer deze stap in een chemische kap. </li></ol></li><li> Verspreid de steriele zaden op platen met 0,8% plantaardige agar in 0,5x Murashige &amp; Skoog (MS) medium. Wikkel platen met Parafilm of poreuze tape en dek af met aluminiumfolie. </li><li> Bewaar de platen bij 4 ° C gedurende 1-4 dagen uniforme ontkieming te bevorderen. </li><li> Breng de platen een groeikamer geschikt voor de teelt Arabidopsis zaailingen. Plaats de platen verticaal wortelgroei bovenop het agarmedium te houden en doordringing te voorkomen. </li><li> Transfer zaailingen tot 7 dagen na het ontkiemen fixeermiddel (DAG). </li></ol> 2. fixatie <ol><li> Bereid 50 ml Richardson Solution door het combineren van gelijke volumes van 1% Borax (buffer agent), 1% methyleenblauw en 1% Azure (histologische kleurstoffen) met tweemaal gedestilleerd water. Filteren door middel van een spuit Driven 0,22 pm PVDF Filter Unit voor gebruik. </li><li> Bereid 50 ml fixatief: 1,25% glutaraldehyde in 0,05 M natriumcacodylaat (buffermiddel). Opmerking: Deze materialen zijn toxisch en moeten in een chemische kap behandeld. </li><li> Voeg 100 gl Richardson oplossing (zie 2.1) aan de fixatie-oplossing (zie 2.2) aan de uiteindelijke bevestiging oplossing te verkrijgen. </li><li> Mark elk putje van een 6-well plaat met de bijbehorende sample naam. </li><li> Place 2-3 ml definitieve fixatie-oplossing (zie 2.3) in de putjes, zodat de zaailingen eenmaal overgedragen volledig gedekt in vloeistof. </li><li> Zorgvuldig overbrengen behulp van een tang, tot 10 zaailingen aan elk putje. Dicht de platen met behulp van Parafilm. Bewaren bij 4 ° C, in het donker, gedurende ten minste een nacht en maximaal een week. </li></ol> 3. Uitdroging <ol> &lt;li&gt; Dehydrateer zaailingen. Overbrengen tussen putjes van nieuwe 6-well platen gemaakt met toenemende concentraties ethanol, zoals hier vermeld: 10% ethanol gedurende 15 min; 30% ethanol gedurende 15 min; 50% ethanol gedurende 15 min; 70% ethanol gedurende 15 min; 85% ethanol gedurende 15 min; 95% ethanol gedurende 15 min; 95% ethanol bij 4 ° C overnacht, minimaal. Behandel zaailingen door ze voorzichtig vast te pakken door hun zaadlobben, bij voorkeur met plastic tang. </li></ol> 4. Infiltratie <ol><li> Bereid infiltratie medium. Meng de inhoud van 1 zakje de historesin kit activator met 50 ml Basic harsvloeistof kit in een klein glazen flesje. Roer met magneet voor 20 min. Infiltratie medium kan bij 4 ° C gedurende enkele weken houdbaar. </li><li> Mark elk putje van een nieuwe 6-well plaat met de bijbehorende monsteromschrijving en vul met 2-3 ml van infiltratie medium. </li><li> Breng de zaailingen van de 95% ethanoloplossing de infiltratie medium behulp van een tang. Zorg ervoor dat de zaailingen fully waarop het medium. </li><li> Bewaren bij 4 ° C gedurende ten minste 4 dagen, om maximale penetratie zorgen in plantenweefsels. </li></ol> 5. Block Voorbereiding <ol><li> Plaats kleine labels, potlood-gemarkeerd met sample naam, binnen elk putje van inbedding mallen. </li><li> Bereid inbedding medium door toevoeging van 1 ml verharder tot 15 ml infiltratie medium (zie 4.1). Probeer niet om een ​​volume te bereiden die kleiner is dan 15 ml, om problemen polymerisatie te voorkomen. </li><li> Vul helft van elk putje in de vorm met 200 ul inbeddingsmedium en bedek met een overhead filmstuk de gietvorm snijden, maar tot een grootte 1 mm groter aan weerskanten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur, om polymerisatie mogelijk. Niet meer dan 5 uur. </li><li> Bereid een extra partij inbeddingmedium (zie 5.2) en blijf op ijs, om polymerisatie te vermijden terwijl wortel tips worden aangebracht in de mal. </li><li> Snijd elke wortel tip onder een dissectie scope met behulp van scalpel en zeer zorgvuldig te positioneren it: verticaal voor dwarsprofielen of horizontaal voor langsdoorsnede ongeveer 2-3 mm van de matrijs periferie. Vul de mal volledig met het blokkeren oplossing en cover met een overhead film. Merk op dat de blokkerende oplossing enigszins krimpt wanneer het wordt gepolymeriseerd. </li><li> Bewaren bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, minimaal. </li><li> Om de blokken drogen plaatsen in een doos met droge silicagel en laat bij kamertemperatuur gedurende de nacht, minimaal. </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Bereid glas messen van glas staven met een mes maker. Gebruik de glazen messen voor weefsel snijden. Snijd de glazen staaf in een vierkant en snijd het plein schuin naar twee messen te produceren, met behulp van een diamant scoring tool. </li><li> Sectie blokken in 2-3 micrometer breed plakjes, met behulp van een machine snijden. Plaats plakjes op een glasplaatje, op de top van gedestilleerd water druppels en plaats de dia op een warmte-blok ingesteld op laag vuur (50 - 60 ° C), totdat het water verdampt. </li></ol><ol><li> Richardson verdunde oplossing (zie 2.1) tot 0,2% van de oorspronkelijke oplossing en gebruik 1 ml aan de plakjes dekken. Leg ze op de hitte blok voor 5 sec en daarna wassen met gedestilleerd water. </li><li> Droog de dia op een hete plaat. Controleer onder een dissectie omvang en markeer de achterkant van de slede met een markering, waarmee de positie van de segmenten van belang aangeven van latere identificatie onder de microscoop te vergemakkelijken. </li><li> Voeg 100 ul van montage medium en dek af met een deksel slip. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol><li> Plaats de bedekte dia met de baanvakken onder een lichtmicroscoop met Polscope passend om retardance informatie en een polarisator / optische interferentie filter (figuur 1 AD) te verkrijgen. </li><li> Kies een vergroting die duidelijke visualisatie van het gehele monster mogelijk maakt (bijvoorbeeld 40X in deze studie) en de focus van de microscope op een leeg veld dat blok sectie, maar geen wortel gedeelte bevat. Probeer om een ​​schone omgeving te vinden zonder vlekken. Gebruik deze regio om de achtergrond in te stellen. </li><li> Stel de imaging-systeem en de software parameters: Stel bereik tot 17 nm. Apply &quot;Auto Exposure&quot; en achtergrondafbeelding te verkrijgen van het lege veld (zie 8.2). afbeelding Een achtergrond wordt gebruikt per experiment. </li></ol> 9. Polscope Analyse van Cellulose microfibril Orientation <ol><li> Analyse van de langsprofielen. <ol><li> Plaats een dia met longitudinale secties onder de microscoop en een retardance beeld van te krijgen. De focus van de microscoop op een wortel gedeelte van belang. Zorg voor een nieuwe bestandsnaam. </li><li> Maak een foto Abrio (afbeelding met vertraging informatie) door het raam &quot;Levende Abrio&quot;. Zeker een sectie die de celwand, die kan worden geïdentificeerd door de gekleurde cellulose langs de omtrek van de cel, zoals getoond in Figuur 2C omvat vangen.</li></ol></li><li> Beeldanalyse. <ol><li> Dubbelklik op de desbetreffende afbeelding in de stack. Selecteer &quot;Orientation Pseudo kleur&quot; in het tabblad &#39;Display Settings &quot;. </li><li> De cellulose microfibril hoek schatten, overeenkomen met de overeenkomstige kleur van de celwand dat bij het kleurenwiel. OPMERKING: De kleurenwiel in Figuur 2C geeft de langzame as van het licht liggen langs de microfibril die richting langs de lengteas van de microfibrillen toont. De hoek van cellulose microfibrillen is het aangegeven door de kleur en de lange as van de cel. Bijvoorbeeld, de verlengende cel in het vak ziet cyaan kleur, gekanteld over 90 ° op de lengteas van de cellen. </li><li> Voor de gemiddelde microfibril hoek in de celwand te kwantificeren, gebruik &quot;retardance en Azimuth Stamp&quot; tool op de werkbalk van de software. Terwijl de selectie van het gereedschap, punt en klik op de regio van belang in het verkregen beeld. LET OP: Dit will resulteren in de weergave van de hoeken (azimut) in graden (figuur 2C). </li><li> In een alternatieve open access gepolariseerd het licht analyse software, lunch &quot;Pol-Analyzer&quot; plugin van de plugin menu. In het nieuw geopende venster selecteert u het tabblad &quot;Dubbele breking&quot; en open en sla de achtergrond bestand en het beeldbestand. </li><li> In het venster afbeelding, selecteer &quot;Specs.&quot; en stel de &#39;ROI pixelgrootte&#39; (gebruik 5 pixels voor deze studie). In de &quot;Specs.&quot; venster, selecteer &quot;toont waarden in Result table&quot;. </li><li> Gebruik de Polygon gereedschap om de regio van belang in het venster afbeelding te markeren. Selecteer &quot;oriëntatielijnen&quot; naar de oriëntatie van de cellulose microfibril verkrijgen. Opmerking: Dit zal resulteren in de weergave van de hoeken (azimut) in graden. OPMERKING: De gemiddelde hoek berekend door een van beide methoden moeten vervolgens genormaliseerd naar de positie van de wortel doorsnede volgens de glijbaan. Om te corrigeren voor afwijkingen vande horizontale positie van het gehele wortel doorsnede volgens de slede kwantificeren gemiddelde microfibril hoek van de celwand aan weerszijden van de cel langs de lengteas (dat wil zeggen, loodrecht op de sectie en langs de wortelgroei as, Figuur 2C). Deze hoek is 180 ° bij de wortel gedeelte nauwkeurig gepositioneerd langs de glijbaan. Voor het berekenen van de microfibril hoek aftrekken van de gemiddelde gemeten microfibril hoek van de flankerende celwand van 180 °. Voeg de resulterende verschil van de gemiddelde gemeten microfibril hoek van de celwand die plat ligt op de dia. </li></ol></li></ol> 10. Polscope Analyse van kristallijne cellulose accumulatie <ol><li> Gebruik de dwarse (kruis) secties. Merk op dat kristallijne cellulose ophoping alleen vergeleken tussen cellen bij de cellulosemicrovezels bij elkaar aansluitende gelijke hoek (zoals bepaald 9). </li><li> Dubbelklik op de desbetreffende afbeelding in de stack. Selecteer &quot;Pseudo kleur &quot;in het tabblad&quot; Display Settings &quot;. </li><li> Om retardance meten. Inzoomen op het beeld. Selecteer &quot;Regio&quot; en markeer alle regio&#39;s van belang. Ga naar het tabblad &quot;metingen&quot; en &quot;Kopiëren naar klembord&quot; alle waarden. <ol><li> De gegevens over naar Excel en vereiste informatie (gemiddelde regio retardance) extract. Normaliseren van de data. LET OP: Als u rekening te houden met de verschillen in dikte tussen de schijfjes, drukken de waarden ten opzichte van een specifieke celwand rand in de dia. Te normaliseren, verdelen de gemiddelde retardance overeenkomt met de celwand van belang die de gemiddelde retardantie van een ander celwand in dezelfde afbeelding. Zo werd het epidermale buitenste celwand genormaliseerd naar de binnenwand corticale celwand in onze studie. </li></ol></li><li> Herhaal metingen gedurende minstens 3 delen per wortel, met een minimum van 3 wortels per monster. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li>
<li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM%2C+XRD%2C+NMR+and+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresources%22%5BJournal%5D)">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li>
<li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling%2C+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li>
<li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.+A-2%3A+Polymer+Physics%22%5BJournal%5D)">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li>
<li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li>
<li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Arabidopsis+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li>
<li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li>
<li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control%3A+brassinosteroid+activity+gets+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li>
<li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li>
<li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li>
<li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Hier presenteren we een methode voor het bepalen van de accumulatie van kristallijn cellulose in de verschillende weefsels van het Arabidopsis wortels, met behoud van anatomische informatie. Als zodanig verschaft een extra stap naar het begrijpen van groeiprocessen in planten op cellulair resolutie. Deze werkwijze kan ook worden toegepast voor het bestuderen van aanvullende plantensoorten en organen. Een aantal punten moet rekening worden gehouden bij de toepassing van de methode. E...

De plantencelwand is een dynamische structuur. Groeiende cellen zijn omgeven door een primaire celwand, de organisatie die het cellen groeien. Cellen die ophouden te groeien storting een meer rigide secundaire muur die de mechanische ondersteuning van de plant verbetert. Beide celwanden bestaan ​​uit cellulose microfibrillen ingebed in een matrix van polysacchariden van verschillende structuren (bijvoorbeeld hemicellulose en pectine) die uiteenlopen van ontwikkelingsstadium en weefsels 1,2. Cellulose wordt gesynthetiseerd als ketens van (1,4) -β-D-glucan die nauw zijn afgestemd op de microfibril van een kristallijne structuur. Amorfe cellulose verwijst naar de regio&#39;s waar de glucan ketens minder worden besteld. De verhouding tussen de kristallijne en de amorfe domeinen één parameter aangenomen dat de mechanische eigenschappen van de celwand beïnvloeden door mechanische sterkte en viscoelastische karakteristieke respectievelijk 3. Er zijn verschillende methodenontwikkeld voor het detecteren en kwantificeren van de twee vormen van cellulose inrichting, waaronder röntgendiffractie en kruispolarisatie / magic angle spinning solid-state NMR 4. Röntgendiffractie kan worden gebruikt om het aandeel van kristallijn cellulose versus amorfe domeinen bepalen in het monster 5. Een alternatieve werkwijze gebruikt fractionering van celwand inhoud in zuur onoplosbaar en zuur-oplosbaar materiaal, onderscheid maken tussen de kristallijne en amorfe cellulose of andere polymeren, respectievelijk. In deze benadering wordt incorporatie van gemerkte glucose ([14C] glucose) gebruikt om de cellulose 6,7 kwantificeren. Deze werkwijzen vereisen grote hoeveelheden plantmateriaal gehele orgel analyses hooguit en dus zijn onvoldoende gevoelig voor weefsel-specifieke variatie in structuur van de celwand. Visualisatie van cellulose microfibrillen op cellulair resolutie kan worden bereikt in levende imaging studies samen met fluorescerende kleurstoffen 8,9, dat veranderingen kunnen identificerende oriëntatie van de cellulose microfibrillen. Echter, deze kleurstoffen niet gebruikt voor kwantificatie, ze zijn niet specifiek voor kristallijn cellulose en kan interfereren met de normale structuur van de celwand 8. Polscope is een beeldvormende techniek die berust op het vermogen van kristallijne cellulose lichtbundels gesplitst en vertragen deel van het licht 10. Lichte vertraging is het sterkst microfibrillen die loodrecht liggen op de richting van de lichtpropagatie. Voor microvezels met gelijke oriëntatie, hoe hoger de mate van kristalliniteit, hoe groter het licht 11 vlamvertraging. Derhalve wordt polscope gebruikt om zowel de relatieve niveaus en oriëntatie van de cellulose microfibrillen bestuderen. Wortels vertonen lineaire groei, waarbij cellen uit de stamcelniche, aan het uiteinde van de wortel, ondergaan een reeks celdelingen, voordat ze snel uit te breiden 12. De cellen die de wortel uit te breiden in een één richting (anisotrope)wijze zoals gedicteerd door klein molecuul signalering hormonen die de eigenschappen van de celwand 13 beïnvloeden. Differentiële reacties op hormonen, in tijd en ruimte, een middel van een evenwichtige orgel groei 14. Derhalve kan een hoge resolutie analyse van celwandstructuur belangrijke informatie die nodig beter begrip van de verbinding tussen celtype-specifieke reacties op hele organen behalen. Hier melden wij de uitvoering van polscope weefsel-specifieke accumulatie van kristallijne cellulose studeren in Arabidopsis wortels, zoals waargenomen in hoge kwaliteit anatomische secties. Deze methode recent ontdekt celtype-specifieke accumulatie van kristallijne cellulose als reactie op ruimtelijke verstoring van hormonale activiteit 15.

<table><tbody><tr><td>Murashige &amp; Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Spuitgedreven 0,22 mm PVDF-filter&nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylaat</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingsvormen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &micro; P.P.C.&nbsp;</td><td>www.Jolybar.com</td><td></td><td>overhead film</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>9990402</td><td>montagemedium</td></tr><tr><td>lichtmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio beeldvormingssysteem</td><td>CRI</td><td>Abrio beeldvormingssysteem</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 software</td><td></td></tr><tr><td>Open access gepolariseerd licht beeldanalyse software &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

hoge resolutie kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; arabidopsis</em&gt; roots aan tissue-specifieke celwand wijzigingen monitor

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plantencellen zijn omgeven door een celwand, waarvan de samenstelling hun uiteindelijke grootte en vorm bepaalt. De celwand bestaat uit een complexe matrix die polysacchariden bevat, waaronder cellulose-microfibrillen die zowel kristallijne structuren vormen als celluloseketens met amorphe organisatie. De oriëntatie van de cellulosevezels en hun concentraties bepalen de mechanische eigenschappen van de cel. Er worden verschillende methoden gebruikt om de niveaus van kristallijne cellulose te bepalen, elk met voor- en nadelen. Sommige kunnen het aandeel van kristallijne gebieden binnen de totale cellulose onderscheiden. Ze zijn echter beperkt tot analyses van het hele orgaan die gebrekkig zijn in ruimtelijk-tijdelijke informatie. Andere, die afhankelijk zijn van live-beeldvorming, worden beperkt door het gebruik van onnauwkeurige kleurstoffen. Hier rapporteren we een gevoelig op gepolariseerd licht gebaseerd systeem voor specifieke kwantificering van relatieve lichtvertraging, die de accumulatie van kristallijne cellulose vertegenwoordigt in dwarsdoorsneden van Arabidopsis thaliana wortels. In deze methode worden de cellulaire resolutie en anatomische gegevens behouden, waardoor directe vergelijkingen mogelijk zijn tussen de verschillende weefsels die de groeiende wortel samenstellen. Deze aanpak opent een nieuw analytisch dimensie, waardoor licht wordt geworpen op de link tussen celwandsamenstelling, cellulair gedrag en groei van het hele orgaan.

We bestuderen de effecten van celtype-specifieke reacties op brassinosteroiden (BRS) met de Arabidopsis wortel als model orgaan 15-17. Wanneer de BR-receptor BRI1 is gericht, op de achtergrond BRI1 mutant, een subset van epidermale cellen die niet-haarcellen (Figuur 2A, B), remt unidirectionele celexpansie van naburige cellen, en hele-wortelgroei 15. Polscope analyse werd uitgevoerd om het mechanisme achter deze remming onthullen. ...

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Het algemene doel van deze anatomische dwarsdoorsnedepreparatie is om de relatieve accumulatie van kristallen en cellulose op cellulaire resolutie te kwantificeren, waardoor directe vergelijkingen mogelijk zijn tussen de verschillende weefsels in de primaire wortel van Arabidopsis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantenfysiologie en -ontwikkeling, zoals de manier waarop de cellulaire samenstelling van een bepaald celtype de groei van een volledig orgaan beïnvloedt. Na het steriliseren van Arabidopsis-zaden volgens het tekstprotocol, worden de steriele zaden verspreid over platen die 0,8% plantenagar en 0,5XM-medium bevatten.Wikkel de platen in parafilm en dek ze af met aluminiumfolie. Bewaar de platen gedurende één tot vier dagen bij 4 graden Celsius om een uniforme kieming te bevorderen. Plaats de platen vervolgens verticaal in een groeikamer die geschikt is voor het kweken van Arabidopsis-zaailingen, zodat de wortelgroei op het agarmedium behouden blijft. Bereid de Richardson-oplossing voor volgens het tekstprotocol. Filtreer de oplossing voor gebruik door een met een spuit aangedreven 0,22 micron PVD-filtereenheid.Bereid vervolgens onder een zuurkast 50 milliliters fixeerder voor door 38 ml 0,5M natriumcacodylaat te mengen met 2,5 ml glutaraldehyde. Voeg daarna 100 microliters Richardson-oplossing toe aan de fixeeroplossing om de uiteindelijke fixeeroplossing te verkrijgen. Gebruik een vooraf gemarkeerde plaat en breng 2 tot 3 ml van de uiteindelijke fixeeroplossing aan in de wells, zodat de oplossing de zaailingen volledig bedekt.Breng met een plastic pincet voorzichtig tot 10 zaailingen over naar elke put. Gebruik parafilm om de platen af te sluiten voordat ze in het donker bij 4 graden Celsius worden bewaard voor ten minste één nacht en maximaal één week. Om de gefixeerde zaailingen te dehydrateren, worden de planten met een pincet bij hun basis opgepakt en overgebracht naar de putten van nieuwe, gemarkeerde zes-puts-platen die toenemende concentraties ethanol bevatten voor de hier vermelde tijdsduuren.Bereid het infiltratiemedium voor in een klein glazen flesje door de inhoud van één zak Historesin Activator te mengen met 50ml basisresinevloeistof. Plaats een magneetje en roer de oplossing 20 minuten lang op een roerplaat. Vul de gelabelde putjes van een zesputjesplaat met 2 tot 3 ml infiltratiemedium.Wanneer de zaailingen volledig zijn gedehydrateerd, gebruik dan een pincet om ze vanuit de 95% ethanol-oplossing over te brengen naar het infiltratiemedium, waarbij u ervoor zorgt dat ze volledig door het medium worden bedekt. Bewaar de monsters gedurende ten minste vier dagen bij 4 graden Celsius om maximale penetratie in de plantenweefsels te waarborgen. Om blokjes voor te bereiden, plaatst u kleine labels die met potlood zijn voorzien van de monsternaam in elke gietvorm voor inbedding.Bereid het inbeddingsmedium voor door 1 ml verharder toe te voegen aan 15 ml infiltratiemedium. Vul de helft van elke put in de mal met ongeveer 200 microliter inbeddingsmedium. Gebruik vervolgens een stuk folie bovenop om de mal af te dekken met nog eens 1 ml aan elke zijde.Incubeer de mallen gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur om gedeeltelijke polymerisatie mogelijk te maken. Bereid vervolgens een extra batch inbeddingsmedium voor en houd deze op ijs om polymerisatie te voorkomen terwijl de worteltoppen in de mal worden gerangschikt. Voeg inbeddingsmedium toe aan een klein plaatje en plaats één zaailing in het medium.Snijd onder een dissectiescoop met een scalpel elke wortelpunt af en plaats deze vervolgens zeer voorzichtig in de mal, ongeveer 2 tot 3 mm vanaf de rand van de mal, óf verticaal voor dwarsdoorsneden óf horizontaal voor longitudinale doorsneden. Vul na het positioneren van het weefsel de mal volledig met inbeddingsmedium en dek deze af met een folie. Incubeer vervolgens gedurende minimaal twee uur bij kamertemperatuur. Om de blokken te drogen, plaatst u deze in een desiccator met droge silicagel en laat u ze een nacht bij kamertemperatuur staan.Bereid glazen messen voor uit glazen staven met behulp van een messenmaker die is uitgerust met een diamantkrasinstrument, door de glazen staaf in een vierkant te snijden en dit vierkant vervolgens diagonaal door te snijden om twee messen te produceren. Verifieer of beide messen scherpe randen hebben. Monteer een blok in een houder.Verwijder vervolgens met een industrieel enkelzijdig mes het overtollige blokmateriaal tot op één mm van de wortelpunt om een piramidevorm te verkrijgen. Snijd het gevormde blok in plakjes van 2 tot 3 micron breed en breng de plakjes over naar een gemarkeerd glazen objectglas. Voeg vervolgens waterdruppels toe op de plakjes.Het is belangrijk om coupes te bereiden die uniform in breedte zijn om de variabiliteit van de geanalyseerde gegevens te minimaliseren. Plaats de glazen objectglazen op de warmteblokken die op lage temperatuur zijn ingesteld tot het water is verdampt. Om objectglazen voorwaarts te bereiden voor observatie onder een polarisatiemicroscoop, dient de Richardson-oplossing te worden verdund tot 2% van de oorspronkelijke oplossing en ongeveer 1ml te worden gebruikt om de coupes te bedekken.Plaats de monsters vervolgens gedurende 5 seconden op het warmteblok en spoel ze af met gedestilleerd water. Nadat de coupes op de warmteplaat zijn gedroogd, worden ze onder een dissectiemicroscoop geobserveerd en wordt de achterzijde van een objectglas met een marker gemarkeerd om de positie van de coupes van belang aan te geven. Voeg 100 µL monteermiddel toe voordat ze met het dekglas worden afgedekt.Beeldvorming en analyse dienen te geschieden volgens het tekstprotocol. Hier wordt een dwarsdoorsnede van de primaire wortel van Arabidopsis getoond met de radiale organisatie van de bestanddelen cellen en weefsels, waaronder niet-haarcellen, haarcellen en de cortex. Deze confocale afbeelding toont BRI1-GFP-expressie in niet-haarcellen in een BRI1-mutantachtergrond, wat de unidirectionele expansie van naburige cellen en de groei van de gehele wortel remt.Zoals hier te zien is, vertoonden longitudinale secties van de wortels, verkregen van het wild-type en van lijnen die BRI1 tot expressie brengen in niet-haarcellen, een soortgelijke oriëntatie van cellulose-microfibrillen, met een hoge variabiliteit in hoeken in meristeemcellen vergeleken met cellen in de transitiezone. Dit maakt een vergelijking mogelijk van de relatieve accumulatie van kristallen in cellulose in de overeenkomstige meristeem- en elongatiecellen van de twee genetische achtergronden, zoals hier in dwarsdoorsneden wordt getoond, en onthult een correlatie tussen BRI1-expressie in niet-haarcellen en een hoge lokale accumulatie van kristallen in cellulose. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode in de video's moeite hebben, omdat het uitdagend is om goed georiënteerde wortels te verkrijgen tijdens de inbeddingsprocedure.Daarom moeten er meerdere blokjes worden voorbereid voor het maken van coupes. Zodra de techniek onder de knie is, kan een enkel blokje in 2 tot 3 uur worden gesneden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de accumulatie van kristallen in cellulose vergelijkbaar is tussen cellen als zij een vergelijkbare oriëntatie van hun cellulose-microfibrillen hebben, zoals bepaald door de longitudinale coupes.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u Arabidopsis-zaailingen moet fixeren, hoe u deze in blokken moet inbedden en hoe u vervolgens longitudinale en transversale worteldoorsneden bereidt. U heeft daarnaast een goed inzicht gekregen in de gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van gepolariseerde lichtmicroscopie.

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode gebaseerd op confocale Raman microscopie wordt gepresenteerd die biedt label-free visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of soort.

Label-free In situ Imaging van Lignification in Plant celwanden

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

In this video, we describe a staining procedure to visualize cellulose deposition within cell walls of Arabidopsis thaliana, a dicot plant, using calcofluor white, which specifically binds to β-linked glucans, exhibiting fluorescence under UV light.

Calcofluor White Staining: A Simple Method for UV-Induced Fluorescence Visualization of Cellulose Deposits in Cell Walls of Dicot Plant Stem Sections

We beschrijven een methode om mechanische eigenschappen van plantenweefsels in kaart te brengen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM). We richten ons op hoe mechanische veranderingen die plaatsvinden in celwanden tijdens plantontwikkeling op brede-veld mesoschaal kunnen worden geregistreerd, waardoor deze veranderingen kunnen worden gecorreleerd met groei en morfogenese.

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer hoe je kristallijne cellulose kwantificeert in Arabidopsis wortels met gepolariseerd licht. Deze methode biedt inzicht in celwandsamenstelling en plantengroei op cellulair niveau.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in Arabidopsis Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor (Video) | JoVE Journal

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in

Meer video's verkennen