In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS
15 februari 2016
Dit werk geeft een protocol voor vloeistofverwerking en monsterintroductiemethode een microkanaal in situ time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie analyse van biomoleculen eiwit in een waterige oplossing.
Het algemene doel van deze procedure is om geadsorbeerde eiwitfilms in waterige oplossingen te karakteriseren, met behulp van het systeem voor analyse bij de vloeistof-vacuüm interface en tijd-van-vlucht secundaire ionen massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over biomoleculen en de bio-interface. Bijvoorbeeld, de karakterisering van geadsorbeerde eiwitten op een vaste oppervlakte.
De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat de biomoleculen in situ kunnen worden gestart in de vloeibare omgeving, en in combinatie met moleculair mapping. Hoewel deze methode inzicht kan geven in biomoleculen op het vast-vloeistof grensvlak, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, inclusief onderzoek naar enkele kankercellen, geneesmiddelinteracties, en de aanhechting van biofilms. Trek twee milliliter van een 70% ethanol oplossing op in een spuit van vijf milliliter.
Verbind de spuit met het inlaatuiteinde van het SALVI-apparaat en injecteer langzaam één milliliter van de vloeistof gedurende 10 minuten. Aan het einde van de injectie, verwijder de spuit en verbind de inlaat en uitlaat van de SALVI met een polyether-ether-keton unie. Houd de SALVI microkanaal gevuld met de 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende vier uur.
Vul vervolgens een tweede spuit met steriel gedeïoniseerd water. Verbind deze met de inlaat van de SALVI en injecteer langzaam het gedeïoniseerd water in het apparaat gedurende 10 minuten. Verwijder de spuit en verbind de inlaat en de uitlaat van het apparaat weer met elkaar.
Om een eiwitfilm te immobiliseren, begin met het opzuigen van twee milliliter fibronectine oplossing in een spuit. Verbind de spuit met de inlaat van het SALVI-apparaat en injecteer langzaam één milliliter van de vloeistof gedurende 10 minuten. Vervolgens verwijder de spuit en verbind de inlaat en de uitlaat weer met elkaar.
Incubeer de opstelling in een schone kweekschaal bij kamertemperatuur gedurende 12 uur. Na incubatie, injecteer langzaam één milliliter steriel gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten en verbind vervolgens de inlaat met de uitlaat. Leg om te beginnen de ToF-SIMS-standaard op een platte, schone ondergrond.
Plaats het SALVI-apparaat op de standaard met de siliconen wafer en silicon nitride membraan naar boven. Bevestig het SALVI-apparaat aan de standaard met behulp van vier metalen klemstukken en schroef de metalen stukken die de hoek van het apparaat vasthouden met vier schroeven in de metalen plaat. Rol vervolgens voorzichtig de PFTE buis op die verbonden is met het microfluïdische kanaal.
Gebruik vier metalen stukken en vier schroeven om het stijve gedeelte vast te houden. Zorg ervoor dat het apparaat in de open ruimte op de standaard is geplaatst, zodat het niet interfereert met de primaire ionenstraal tijdens de analyse. Monteer vervolgens de Faraday-cup op de standaard met behulp van een schroef.
Open vervolgens de ToF-SIMS loadlock-deur en plaats de standaard horizontaal op het laadplatform voordat u de deur sluit. Schakel de vacuümpomp in en laat de loadlock-kamer naar ongeveer 10 tot de min zesde millibar pompen. Beweeg vervolgens het SALVI-apparaat na ongeveer 30 minuten naar de hoofdkamer, zodra het vacuüm is gestabiliseerd.
Stel de primaire ionenstraal en de analyzer van de ToF-SIMS in om een ruimtelijke resolutie van ongeveer 400 nanometer te verkrijgen door het aanbevolen protocol van de fabrikant te volgen. Zoek vervolgens het microfluïdische kanaal met behulp van de optische microscoop. Gebruik het optische beeldcentrum als referentie en lijn het uit om consistent te zijn met het centrum van het secundaire ionenbeeld.
Visuele demonstratie van deze stap is cruciaal, omdat het moeilijk is te leren, omdat het monster dikker is dan normale vaste monsters, en het moeilijk is om de instellingen aan te passen om de beste focus van het kanaal te vinden. Gebruik voor elke meting een zuurstofstraal van één kiloelektronvolt om ongeveer 15 seconden op het silicon nitride raam te scannen om oppervlakteverontreiniging te verwijderen. Gebruik ook een elektronenoverstromingspistool om oppervlaktelading tijdens alle metingen te compenseren.
Selecteer vervolgens de positieve of negatieve modus voordat u begint met gegevensverzameling. Gebruik de 25 kiloelektronvolt bismut drie plus als primaire ionenstraal in alle metingen. Voor diepteprofilering, scant de primaire ionenstraal op een ronde gebied met een diameter van ongeveer twee micrometer met een resolutie van 32 pixels bij 32 pixels.
Om de tijd die nodig is om door het silicon nitride membraan te prikken te minimaliseren, gebruik een primaire ionenstraal met een lange pulsbreedte. Na het prikken van het silicon nitride membraan, houd dezelfde stroom gedurende ongeveer 200 seconden om voldoende gegevens te verkrijgen voor tweedimensionale beeldafreconstructies. Voor gegevensverzameling, verlaag de pulsbreedte tot 80 nanoseconden om spectra met betere massa-resolutie te verkrijgen.
Ga door met deze verwerving gedurende ongeveer nog eens 200 seconden. Met behulp van de SALVI microfluïdische interface kan de primaire ionenstraal direct op de gehydrateerde fibronectine film bombarderen. Een aantal waterclusters en aminozuurfragmenten worden aangegeven door de ToF-SIMS massaspectrometrie gegevens.
Dit biedt direct bewijs van de eigenschappen van watermoleculen rond en in de gehydrateerde eiwitmoleculen. Hier kan men de tijdsreeks van de diepteprofielen van de gehydrateerde fibronectine film en van gedeïoniseerd water zien. De intensiteiten van geselecteerde tweede ionen zijn verwaarloosbaar voordat het silicon nitride membraan wordt doorboord.
Zodra het silicon nitride membraan is doorboord, nemen de intensiteiten van de secundaire ionen aanzienlijk toe. Het proces met korte pulsbreedte wordt gebruikt om gegevens te verkrijgen met betere massa-resolutie voor beeldafreconstructies en spectra. De 2D-beelden van de gehydrateerde fibronectine film en gedeïoniseerd water vertegenwoordigen de tellers van geselecteerde secundaire ionen uit het monster.
Hoe helderder het beeld, hoe hoger de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit werk presenteert een protocol voor het karakteriseren van geadsorbeerde proteïnefilms in waterige oplossingen met behulp van time-of-flight secundaire ionenmassaspectrometrie. De methode maakt in situ analyse van biomoleculen aan de vaste-vloeistofgrensvlak mogelijk, wat inzicht geeft in diverse biologische systemen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Massaspectrometrie
- Biomoleculaire Analyse
Achtergrond
- De karakterisering van biomoleculen is cruciaal voor het begrijpen van hun interacties.
- Time-of-flight secundaire ionmassaspectrometrie biedt gedetailleerde moleculaire mapping.
- De methode kan worden toegepast op diverse systemen, waaronder kankercellen en geneesmiddelinteracties.
- In situ analyse verbetert het begrip van biomoleculen in hun natuurlijke omgevingen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor vloeistofbehandeling en monsterintroductie.
- Het analyseren van eiwitbiomoleculen in waterige oplossingen.
- Het verkrijgen van inzicht in het gedrag van biomoleculen bij bio-interfaces.
Gebruikte methoden
- Gebruik van het systeem voor analyse aan de vloeistof-vacuüminterface.
- Time-of-flight secundaire ion-massaspectrometrie voor analyse.
- Monsterpreparatie met gebruik van een 70% ethanoloplossing.
- In situ karakterisering van geadsorbeerde eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle introductie van monsters in microkanalen voor analyse.
- Karakterisering van geadsorbeerde eiwitten op vaste oppervlakken.
- Inzichten in interacties tussen biomoleculen in vloeibare omgevingen.
- Potentiële toepassingen in kankeronderzoek en studies naar geneesmiddelinteracties.
Conclusies
- Het protocol maakt een effectieve analyse van eiwitbiomoleculen mogelijk.
- In situ-analyse biedt waardevolle inzichten in het gedrag van biomoleculen.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse biologische onderzoekstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt directe moleculaire karakterisering van gehydrateerde eiwitten in hun natuurlijke waterige omgeving mogelijk, waarmee een kritisch hiaat in de analyse van bio-interfaces wordt opgevuld. Door de hydratatietoestand van eiwitten tijdens ToF-SIMS-analyse te behouden, biedt het mechanistische inzichten in biomoleculaire adsorptie en water-eiwitinteracties die relevant zijn voor targetvalidatie. De aanpak ondersteunt vroege ontdekkingsinspanningen door ruimtelijk opgeloste chemische gegevens te leveren die bijdragen aan de functionele targetbeoordeling en de onzekerheid bij de identificatie van lead-verbindingen verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar proteïne-adsorptiemechanismen op vast-vloeistofgrensvlakken mogelijk onder fysiologisch relevante hydratatieomstandigheden.
- Operationele waarde: Maakt directe detectie van aminozuurfragmenten en watercluster-signaturen mogelijk om de aanwezigheid en conformatie van proteïnen te bevestigen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets door te onthullen hoe hydratatielagen de biomoleculaire oppervlakte-interacties beïnvloeden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert labelvrije moleculaire kaarten van de eiwitdistributie met een ruimtelijke resolutie van ~400 nm voor de karakterisering van assay-oppervlakken.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve tellingen van secundaire ionen, waardoor de reproduceerbaarheid over verschillende eiwitimmobilisatiecondities kan worden beoordeeld.
- Klaar voor assay: Faciliteert de voorbereiding van screening-klare oppervlakken door de integriteit van de eiwitfilm te verifiëren voorafgaand aan compound-screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bindingsassays en native-achtige omgevingen door eiwitten in gehydrateerde toestand te karakteriseren.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen bindingsgebeurtenissen plaatsvinden via direct eiwitcontact of worden gemedieerd door hydratatielagen.
- Preklinische relevantie: Ondersteunt het modelleren van ziekterelevante systemen door analyse van fibronectine en andere extracellulaire matrixeiwitten in oplossing mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De techniek past binnen het ontdekkingscontinuüm van target engagement screening tot lead-optimalisatie door interface-moleculaire data te leveren die complementair is aan assays in bulkoplossing. Het bevindt zich na de initiële target-validatie, maar vóór de cellulaire screening, en biedt een mechanistische laag voor de hit-to-lead progressie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van adsorptiemechanismen en doelwitfunctionaliteit gerelateerd aan pathways door middel van directe moleculaire mapping.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door de uniformiteit van de eiwitfilm en de hydratatie-afhankelijke signaalconsistentie te verifiëren.
- Analytics: Levert masseresolved spectra en 2D-ionkaarten die vergelijking van eiwitfragmenten en waterclusters over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door de hydratatietoestand van eiwitten te behouden, waardoor de relevantie voor in vivo bio-interfacecondities wordt verbeterd.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor interface-analyse dat toepasbaar is op meerdere doelwitten en eiwitfamilies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door ambiguïteit in mechanismen van eiwit-oppervlakinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de analyse van gehydrateerde eiwitten via reproduceerbare vloeistofbehandeling en vacuümcompatibele microfluïdische koppelingen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege go/no-go beslissingen mogelijk te maken op basis van mechanistische grensvlakgegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door te verduidelijken of target-interactie direct is of via hydratatie verloopt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in vacuümoppervlakteanalyse en het hanteren van microfluïdische apparaten om een lekvrije SALVI-werking te garanderen.
- Afhankelijk van ToF-SIMS-instrumentatie met de capaciteit voor het schakelen tussen positieve/negatieve ionmodi en diepteprofilering.
- Vereist cross-team standaardisatie tussen oppervlaktewetenschaps- en biologieteams voor monstervoorbereiding en data-interpretatie.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding voorbij fibronectine naar andere eiwitten met variërende adsorptiekinetiek.
- Beperkt door de noodzaak van compatibiliteit met ultrahoog vacuüm, waardoor analyse beperkt blijft tot oppervlakken die compatibel zijn met microfluïdische afdichting onder vacuüm.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Cleaning and Sterilization of the SALVI Microchannel
2:05
Immobilization of the Protein Film in SALVI
2:50
Install SALVI into the ToF-SIMS Loadlock Chamber
4:05
ToF-SIMS Data Acquisition
7:35
Results: Dynamic Liquid Surface and Liquid-solid Interface Analysis
9:02
Conclusion
