Name: In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer hoe je geabsorbeerde eiwitfilms in waterige oplossingen karakteriseert met behulp van SALVI en ToF-SIMS. Deze methode biedt inzicht in biomoleculen en bio-interfaces voor biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij zijn dankbaar voor de ondersteuning van de Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) en Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fonds. Instrumentele toegang werd verschaft via een W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is een nationaal wetenschappelijk gebruikersfaciliteit gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research (BER) bij PNNL. De auteurs danken de heer Xiao Sui, de heer Yuanzhao Ding en mevrouw Juan Yao voor het corrigeren van het manuscript en het verstrekken van nuttige feedback. PNNL wordt beheerd door Battelle voor de DOE onder Contract DE-AC05-76RL01830.

1. Reiniging en sterilisatie van de SALVI Microchannel <ol><li> Sterilisatie van de Microchannel in SALVI <ol><li> Trekken 2 ml 70% ethanol waterige oplossing in een injectiespuit, sluit de spuit met het inlaateinde van SALVI en injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min. Verwijder de injectiespuit aan het einde van de injectie. Vervolgens sluit de inlaat en uitlaat van SALVI met behulp van een polyetheretherketon (PEEK) unie. Anders, gebruik een spuitpomp dezelfde procedure voeren. Stel bijvoorbeeld de stroomsnelheid van 100 pl / min. </li><li> Houd de SALVI microkanaal gevuld met 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. </li></ol></li><li> Introduceer gedeïoniseerd (DI) water in SALVI <ol><li> Trek 2 ml gesteriliseerde DI water in een spuit, sluit de spuit met de inlaat van SALVI, en injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min. Verwijder de spuit en sluit de inlaat en uitlaat van SALVI met behulp van een PEEK unie. Afwisselend gebruik een spuitpomp zoals vermeld instap 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. immobilisatie van het eiwit Film in SALVI <ol><li> Immobiliseer de Eiwit Film in SALVI <ol><li> Trek 2 ml van fibronectine (10 ug / ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) oplossing in een spuit, sluit de spuit met de inlaat van SALVI, injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min, verwijder de spuit en sluit de inlaat en de uitlaat van SALVI met behulp van een PEEK unie. </li><li> Incubeer de SALVI gevuld met fibronectine oplossing in een schone kweekschaal, houdt de schaal in de kap bij kamertemperatuur gedurende 12 uur. </li><li> Trek 2 ml gesteriliseerde DI water in een spuit en verbind de spuit met de inlaat van SALVI. injecteer langzaam 1 ml water in 10 min, verwijder de spuit en sluit de inlaat en uitlaat van SALVI. Opmerking: als uitgerust met een lichtmicroscoop, controleer dan de SALVI onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de SiN membraan intact is voordat ToF-SIMS analyse. Nu is de SALVI apparaat klaar is voor ToF-SIMS eenalysis. </li></ol></li></ol> 3. Installeer SALVI in de ToF-SIMS laadvergrendelingskamer Opmerking: Handschoenen moeten worden gedragen te allen tijde bij de behandeling van de SALVI apparaat en het installeren van het op de ToF-SIMS podium om mogelijke verontreinigingen tijdens de oppervlakte-analyse te voorkomen. <ol><li> Mount SALVI naar het werkgebied <ol><li> Leg de ToF-SIMS stage op een vlakke en schone ondergrond. Zet de SALVI apparaat op het podium met het silicium wafer en SiN membraan naar boven. Bevestig de SALVI met behulp van vier metalen Klemstukken en schroef de metalen stukken die de hoek van het apparaat in de metalen plaat met vier schroeven. </li><li> Voorzichtig oprollen de PFTE slangen aangesloten op de microfluïdische kanaal. Gebruik vier stukken metaal en vier schroeven om de stijve deel ingedrukt houdt. Zorg ervoor dat het apparaat is geplaatst in de open ruimte op het podium SIMS zodat het niet interfereert met de primaire ionenbundel tijdens de analyse. Additional image en illustratie van de SALVI fabrication en de installatie zijn beschikbaar in eerdere publicaties. 8,9,11 </li></ol></li><li> Monteer de Faraday Cup naar het werkgebied <ol><li> Bevestig de Faraday-beker op het podium door een schroef. </li></ol></li><li> Laad de Stage in de ToF-SIMS laadvergrendelingskamer <ol><li> Open de ToF-SIMS loadlock, vast te houden en de weg geëffend horizontaal op het laadplatform, en sluit de laadsluis deur. </li></ol></li></ol> 4. ToF-SIMS Data Acquisition <ol><li> Schakel de vacuümpomp en zorgen voor passende vacuüm (bijvoorbeeld, in de orde van 10 mbar of -6 Torr) wordt bereikt in de laadvergrendelingskamer. </li><li> Verplaats de SALVI in de hoofdkamer nadat het vacuüm is gestabiliseerd na ongeveer 30 min. Opmerking: Het vacuüm moet lager zijn dan 5 x 10 -6 mbar vacuüm in de belangrijkste kamer tijdens data-acquisitie. Anders hogere vacuüm duidt op een lek in het systeem SALVI. </li><li> Pas de primaire ionenbundel en analyse van ToF-SIMS met eenruimtelijke resolutie van ongeveer 400 nm volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De stroom van primaire bundel 1200 pA terwijl de cyclustijd 30 psec onder gelijkstroompulsmodus. Opmerking: Dit proces volgt grotendeels aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Vind de microfluïdische kanaal met de optische microscoop. Gebruik het optische beeld centrum als referentie en breng het in overeenstemming met het secundaire beeld ion center te zijn. </li><li> Vóór elke meting, gebruik dan een 1 KeV O 2 + bundel (~ 40 nA) te scannen op het raam SiN met een 500 x 500 pm 2 gebied voor ~ 15 sec om besmetting van het oppervlak te verwijderen. Gebruik ook een elektron overstroming pistool tegen het oppervlak opladen compenseren tijdens alle metingen. Gebruik de automatische functie van de zondvloed pistool in de standaardmodus voor deze stap. </li><li> Selecteer positieve of negatieve modus voor data-acquisitie. Gebruik de 25 keV Bi 3 + bundel als de primaire ionenbundel in alle afmetingen. Opmerking: De stappen zijn vergelijkbaar fof positieve en negatieve data acquisities. Voor het belang van de ruimte, wordt de positieve modus in detail beschreven hier. <ol><li> diepte Profiling <ol><li> Scan de Bi + 3 straal op een rondje met een diameter van ~ 2 micrometer met 32 pixels bij 32 pixels resolutie. </li><li> Om de tijd die nodig is om punch-through de SiN membraan te minimaliseren, gebruik dan een lange puls breedte (dwz 180 ns, straalstroom ~ 1,0 Pa bij een cyclustijd van 100 psec) Bi 3 + balk. De intensiteit van de secundaire ionen vertegenwoordiger van de vloeistof toename oppervlak als punch-through is bereikt. Het doorschakelen varieert van 300 sec tot 500 sec, afhankelijk van de partij van de SiN membraan. Opmerking: Dit verschil lijkt verband te houden met de partij SiN membraan verkregen volgens onze ervaring. Echter, de punch-through tijd niet echt invloed op de data-analyse. </li><li> Na de SiN membraan punch-through, houden dezelfde stroom voor ongeveer 200 secvoldoende gegevens voor 2D beeld reconstructies te verkrijgen. </li><li> Verlaag de pulsbreedte tot 80 nanoseconden voor het verzamelen van gegevens om spectra te verwerven met een betere massa-resolutie. Ga door deze overname nog ongeveer 200 sec. Het spectrum uit figuur 1 worden verkregen uit dit gebied. </li></ol></li><li> 2D Imaging and Mass Spectra <ol><li> Verzamel de 2D-beeldvorming en de massa spectra data op hetzelfde moment bij het meten van de diepte profiling data. De ToF-SIMS instrument slaat alle informatie van elke plek in het experiment. De gegevens worden getoond in verschillende vensters (FPanel - Spectra, FPanel - Profielen en FPanel - Beelden afzonderlijk) van de digitale control software. Controleer gegevens in elk paneel oordeelkundig tijdens data-acquisitie. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ToF-SIMS Data Analysis Let op: Data-analyse wordt in eerste instantie uitgevoerd met de IonToF ToF-SIMS instrumentale software. <ol><li> Open het eenalysis software van SIMS (Measurement Explorer) en klik vervolgens op de &#39;profielen&#39;, &#39;spectra&#39; en &#39;beeld&#39; knoppen, respectievelijk, de diepte profiel, m / z spectrum, en beeldgegevens te verwerken. </li><li> Open de gegevensbestanden die de extensie &quot;.ita&quot; te hebben. </li><li> Selecteer toppen van belang, typt u de naam van die soort in box &quot;ion&quot;, en label ze met verschillende kleuren in de spectra. Gebruik het muiswieltje te slepen langs de x-as. Gebruik Ctrl en scrollwiel om piek hoogtes en breedtes te passen. Letter &quot;L&quot; schakelt tussen Lineair en Log modes langs de y-as. </li><li> Gedrag datareconstructie voordat massa kalibratie. Anders is het moeilijk om de afstand tussen pieken in het massa calibratiestap kiezen. <ol><li> Selecteer de diepte profilering gegevens van rente en te reconstrueren de spectra volgens de diepte profiel temporele series. </li><li> Klik op de knop de wederopbouw. In het venster &quot;Reconstructie Start&quot;, typt u een scan reeks interest. Klik op &quot;OK&quot; om de diepte profiel data te reconstrueren. </li></ol></li><li> Voer een massa kalibratie. Druk op &quot;F3&quot; om het venster &quot;massa-kalibratie&quot; te openen. Kies pieken voor de kalibratie op basis van de specifieke monster. 21 In dit werk, gebruikt u de volgende pieken CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) en H 13 O 6 + (m / z 109) voor de positieve modus. Gebruik de volgende pieken CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), en C 4 H - (m / z 49) de negatieve modus. <ol><li> Selecteer een piek,Zorg ervoor dat de neerwaartse pijl wijst op het hoogtepunt in de linker benedenhoek van het venster. Klik op dat de piek en typ de naam piek in het venster &quot;massa-kalibratie&quot;, klik op &quot;Add&quot;, en het ion van belang wordt opgenomen in de massa kalibratie. </li><li> Tot slot, klik op de &quot;Opnieuw kalibreren&quot; knop. Controleer of de oppervlakten van de pieken op de juiste plaats op basis van hun massa&#39;s op te laden. In het menu &quot;Spectrum&quot;, te selecteren en klik op &quot;Apply Mass Calibration&quot; naar &quot;Alle Spectra &#39;of&#39; Geselecteerde spectra&quot;, afhankelijk van de specifieke analyse wordt uitgevoerd. </li></ol></li><li> Zoals piek selectie nodig zijn voor het monster analyse, het bepalen van karakteristieke pieken van het monster volgens de literatuur of andere eerdere bevindingen. Vergelijk de intensiteit van belangrijke pieken in de m / z spectra. Indien nodig, het toevoegen van nieuwe pieken of te verwijderen nutteloos pieken in de top lijst. <ol><li> pieken toe te voegen. Klik op een piek, het vinden van de rode lijnen op de bodem venster verlaten. Hold de &quot;Ctrl&quot; -toets, scroll muis horizontaal om piekbreedte, die een piek toevoegt aan de piek lijst automatisch te definiëren. Een andere manier om een ​​piek toe te voegen is een piek in de belangrijkste spectrum venster te selecteren en vervolgens te klikken op de &quot;add piek&quot; knop boven het raam. Als er veel pieken om verwante specificaties in het nieuw geopende venster toe te voegen, in het menu &quot;Spectrum&quot;, selecteer &quot;search pieken&quot;, controleren, pieken voeg dan als dat nodig is. </li><li> Tot een piek te exporteren, in het menu &quot;Peak List&quot;, selecteer &quot;Opslaan ...&quot; de piek lijst in de &quot;itmil&quot; formaat. Gebruik de Ctrl en de linker knop te slepen langs het spectrum. In de spectra venster, kies een piek van belang en sleep de twee stippellijnen om gewenste posities. </li><li> Tot een piek lijst importeren in het menu &quot;Mass interval List&quot;, kies &quot;Importeren ...&quot;, zoek een bestaand peak lijst bestand met de extensie &quot;.ITPL&quot;. Klik op &quot;Open&quot;. </li><li> Om een ​​&quot;itmil&quot; piek lijst te gebruiken, inhet menu &quot;Mass Interval List&quot;, klik op &quot;Open ...&quot;, zoek het bestand en klik op &quot;Open&quot;. </li></ol></li><li> Breng een piek lijst om de gegevens verder te analyseren. In de linker onderhoek van venster &quot;Spectra&quot;, is er een venster genaamd &quot;Mass Interval List&quot;. De geïmporteerde piek lijst wordt hier getoond op. <ol><li> Klik met de rechtermuisknop de piek lijst bestand te gebruiken, toe te passen op de &quot;actieve spectrum&quot; of &quot;alle spectra.&quot; </li></ol></li><li> Raadpleeg de profielen. In het venster &quot;Profile&quot;, gebruiken letter &quot;M&quot; aan te passen om het venster (full range) en de letter &quot;N&quot; aan te passen aan de y-as. Gebruik Ctrl en scroll wiel om het profiel breedte aan te passen. Gebruik &quot;/&quot; en &quot;*&quot; op het toetsenbord om de y-as bereik en hoogte veranderen. </li><li> Export van gegevens voor verdere plotten met behulp van andere grafische software na de eerste analyse. <ol><li> Tot een diepte profiel te exporteren, in het venster &quot;Profile&quot;, klikt u op het menu &quot;Bestand&quot; en selecteer &quot;Export &amp; #34 ;, en selecteer vervolgens &quot;Opslaan als&quot; een &quot;.txt&quot; bestand. </li><li> Om een ​​m / z spectrum bestand te exporteren, in het venster &quot;Spectra&quot;, klikt u op het menu &quot;Bestand&quot; en selecteer &quot;Export&quot; en selecteer vervolgens &quot;Opslaan als&quot; een &quot;.txt&quot; bestand. </li><li> Om een ​​image-bestand te exporteren, in de &quot;Image&quot; venster, print screen en opslaan als het beeldbestand. </li></ol></li></ol> 6. ToF-SIMS gegevens plotten en presentatie Opmerking: Gebruik een grafische tool om de gegevens te plotten na de SIMS gegevens worden verwerkt met behulp van de instrumentale software. <ol><li> Gebruik een grafische tool om de gegevens te importeren. </li><li> Maak een grafiek met de m / z als de x-as en piekintensiteit als de y-as naar de gereconstrueerde spectrum tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 1. </li><li> Maak een grafiek met de sputtertijd de x-as en piekintensiteit als de y-as naar de gereconstrueerde diepteprofiel temporale reeks tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in Figure 2. </li><li> Combineer gereconstrueerde 2D beelden van verschillende m / z en vormen een matrix voor de ion mapping tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 2. </li></ol>

<ol><li>Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+rotation+barriers+on+protein+molecular+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Water rotation barriers on protein molecular surfaces.</a> Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).</li>
<li>Maruyama, Y., Harano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+water+drive+protein+folding%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Does water drive protein folding?</a> Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).</li>
<li>Chaplin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+-+Do+we+underestimate+the+importance+of+water+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hydration+dynamics+around+a+protein+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mapping hydration dynamics around a protein surface.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).</li>
<li>Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+analysis+of+conformational+changes+in+adsorbed+protein+films%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films.</a> Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).</li>
<li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+proteins+with+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction of proteins with solid surfaces.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).</li>
<li>Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structure+of+binary+and+ternary+adsorbed+protein+films+using+electron+spectroscopy+for+chemical+analysis%2C+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%2C+and+radiolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling.</a> Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+and+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101(2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+aqueous+surfaces+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22LC+GC+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS.</a> LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).</li>
<li>Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+microfluidic+device+for+in+situ+ToF-SIMS+analysis+of+selected+organic+molecules+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces.</a> Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+molecular+imaging+of+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+and+three-dimensional+dynamic+imaging+of+live+biofilms+in+a+microchannel+by+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry.</a> Biomicrofluidics. 9 (3), 031101(2015).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).</li>
<li>Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin at a glance.</a> J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+the+cell-attachment+site+in+fibronectin+with+monoclonal+antibodies+and+proteolytic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule.</a> Cell. 26 (2), 259-267 (1981).</li>
<li>Engvall, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+soluble+form+of+fibroblast+surface+protein%2C+fibronectin%2C+to+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen.</a> Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).</li>
<li>Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS%3A+Accurate+mass+scale+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liquids+using+microfluidic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Imaging liquids using microfluidic cells.</a> Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).</li>
<li>Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sailing+into+uncharted+waters%3A+recent+advances+in+the+in+situ+monitoring+of+catalytic+processes+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments.</a> Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).</li>
<li>Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+biophysical+tools+to+investigate+lipid+specificity+in+the+interaction+between+bioactive+molecules+and+the+plasma+membrane%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta-Biomembr%22%5BJournal%5D)">Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review.</a> Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Mol.+Cell+Biol.+Lipids%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Gilmore, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMS+of+organics-Advances+in+2D+and+3D+imaging+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819(2013).</li>
<li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins%3A+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li>
<li>Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li>
<li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.-Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li>
<li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly%28hydroxylethyl+methacrylate%29+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

SALVI is een microfluïdische interface die dynamisch vloeistofoppervlak en vloeistof-vaste stof grensvlak analyse maakt van vacuüm gebaseerde instrumenten, zoals ToF-SIMS en scanning elektronenmicroscopie (SEM). Door het gebruik van kleine openingen bloot vloeistof direct in vacuüm, SALVI is geschikt voor vele fijne gefocuste spectroscopie en imaging technieken zonder enige wijziging; 22 de draagbaarheid en veelzijdigheid van microfluidics maken het een echt multimodaal imaging platform. Verschillende functie...

Hydratatie is essentieel voor de structuur, conformatie 1, 2 en 3 biologische activiteit van eiwitten. Eiwitten zonder watermoleculen rondom hen niet zou hebben levensvatbare biologische activiteiten. Specifiek watermoleculen interactie met het oppervlak en inwendige structuur van eiwitten en andere toestanden van hydratatie eiwitten dergelijke interacties onderscheiden. 4 de interactie van eiwitten met vaste oppervlakken is een fundamenteel verschijnsel gevolgen nanotechnologie, biomaterialen en weefselengineering processen. Studies hebben aangetoond dat lange conformationele veranderingen kunnen optreden als een eiwit een oppervlak ontmoet. ToF-SIMS is voorzien als de techniek die het potentieel heeft om de eiwit-vaste stof grensvlak studie. 5-7 Het is belangrijk om de hydratatie van eiwitten begrijpen op vaste oppervlakken, die potentieel biedt een fundamenteel begrip van het mechanisme van hun structuur, conformatie en biologischeal activiteit. Echter hoofdoppervlak analytische technieken zijn meestal vacuüm gebaseerde directe toepassingen voor vluchtige vloeibare studies moeilijk door de snelle verdamping van vluchtige vloeistof onder de vacuümomgeving. We ontwikkelden een vacuümcompatibel microfluïdische interface analysesysteem in de Liquid Vacuum Interface (SALVI), om directe waarneming van vloeistofoppervlakken en vloeistof-vaste stof interacties met behulp van time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS) inschakelen. 8- 11 de unieke aspecten zijn: 1) het detectievenster is mazen van 2-3 urn diameter worden directe beeldvorming van het vloeistofoppervlak, 2) oppervlaktespanning wordt gebruikt om de vloeistof binnen de opening te houden, en 3) is SALVI draagbare tussen meerdere analytische platforms. 11,12 SALVI bestaat uit een siliciumnitride (SiN) Membraan het detectiegebied en een microkanaal van polydimethylsiloxaan (PDMS). Het is fabrvoor bestemde in de clean room, de fabricage en uitgangspunten van factoren zijn beschreven in eerdere artikelen en octrooien. 8-12 De toepassingen van ToF-SIMS als analytisch hulpmiddel aangetoond met verschillende waterige oplossingen en complexe vloeistofmengsels sommige die nanodeeltjes bevatten. 13-17 Specifiek SALVI vloeistof ToF-SIMS maakt dynamische sonderen van de vloeistof-vaste stof grensvlak van levende biologische systemen (dat wil zeggen, biofilms), enkele cellen en vaste elektrolyt-interface, het openen van nieuwe mogelijkheden voor in situ gecondenseerde fase studies met inbegrip van vloeistoffen met behulp van ToF-SIMS. Echter, het huidige ontwerp nog niet toestaan ​​dat gas-vloeistof interacties. Dit is een richting voor toekomstige ontwikkeling. SALVI is gebruikt om de gehydrateerde proteïnefilm bestuderen dit werk voor het eerst. Fibronectine is een veelgebruikte eiwit dimeer bestaande uit twee vrijwel identieke monomeren verbonden door een paar disulfidebindingen, 18 waarbij is bekend om zijn vermogen om cellen te binden. 19,20 werd gekozen als modelsysteem om te illustreren dat het gehydrateerde eiwit film dynamisch kunnen worden gesondeerd met behulp van de vloeistof SALVI ToF-SIMS aanpak. De eiwitoplossing werd in de microkanaal. Na incubatie gedurende 12 uur, een gehydrateerde eiwit gevormd op de achterzijde van de SiN membraan. Gedeïoniseerd (DI) water werd gebruikt om af te spoelen na het kanaal eiwit introductie. Informatie werd verzameld uit gehydrateerde fibronectine eiwitmoleculen in de SALVI microkanaal met behulp van dynamische ToF-SIMS. DI water werd ook bestudeerd als een controle ter vergelijking met de resultaten van gehydrateerde fibronectine dunne film. Duidelijke verschillen waargenomen tussen de gehydrateerde eiwit film en DI-water. Dit werk toont aan dat eiwit adsorptie op het oppervlak in de vloeibare milieu kan worden bestudeerd met behulp van de roman SALVI en vloeibare ToF-SIMS aanpak. De video protocol is bedoeld om technische begeleiding voor mensen die geïnteresseerd zijnin het gebruik van deze nieuwe analytische tool voor diverse toepassingen van SALVI met ToF-SIMS en onnodige fouten in liquid handling verminderen evenals ToF-SIMS data-acquisitie en analyse.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>Resolutie: >10.000 m/&Delta;m voor massa resolutie; >4.000 m/&Delta;m voor hoge ruimtelijke resolutie&nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI is een uniek, zelfstandig, draagbaar analytisch instrument dat voor de eerste keer vacuüm-gebaseerde wetenschappelijke instrumenten zoals time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS) in staat stelt om vloeistofvlakken in hun natuurlijke staat op moleculair niveau te analyseren.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>voor het verbinden van de inlaat en uitlaat van SALVI</td></tr><tr><td>5 Axes Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>De stage is zelf gemaakt voor het monteren van SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Reverse Osmosis filtratiemodule (D2716)</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Bereik: 100 tot 1.000 ml</td></tr><tr><td>Pipettip</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1.000 &micro;l</td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% Gedenatureerd</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ karakterisering van gehydrateerde eiwitten in water door salvi en tof-sims

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Dit werk toont in situ karakterisering van eiwit biomoleculen in de waterige oplossing met behulp van het systeem voor de analyse van de Liquid Vacuum Interface (SALVI) en time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS). De fibronectine proteïnefilm werd geïmmobiliseerd op het siliciumnitride (SiN) membraan dat de SALVI detectiegebied vormt. Tijdens ToF-SIMS werden drie wijzen van analyse zoals hoge ruimtelijke resolutie massaspectrometrie, tweedimensionale (2D) beeldvorming en diepteprofilering. Massaspectra werden zowel positieve als negatieve modes verworven. Gedeïoniseerd water werd ook geanalyseerd als referentiemonster. Onze resultaten tonen aan dat de film fibronectine in water is duidelijker en sterker watercluster pieken opzichte water alleen. Karakteristieke pieken aminozuur fragmenten zijn ook waargenomen in het gehydrateerde eiwit ToF-SIMS spectra. Deze resultaten illustreren dat eiwitmolecuul adsorptie aan een oppervlak kan worden bestudeerd dynamically gebruik SALVI en ToF-SIMS in de vloeibare omgeving voor de eerste keer.

Enkele representatieve resultaten worden de voordelen van de voorgestelde protocol aangetoond. Door het gebruik van de SALVI microfluïdische interface kan de primaire ionenbundel (Bi 3 +) direct bombarderen op de gehydrateerde fibronectine film in DI water. Waardoor de moleculaire chemische mapping van het vloeistofoppervlak succes kan worden verkregen. Figuur 1a en 1b va...

Dit werk geeft een protocol voor vloeistofverwerking en monsterintroductiemethode een microkanaal in situ time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie analyse van biomoleculen eiwit in een waterige oplossing.

In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van geadsorbeerde proteïnefilms in waterige oplossingen, gebruikmakend van het System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface en time-of-flight secundaire ionenmassaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over biomoleculen en de bio-interface. Bijvoorbeeld de karakterisering van geadsorbeerde proteïnen op een vast oppervlak.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de biomoleculen in situ in de vloeibare omgeving kunnen worden bestudeerd, en in combinatie met moleculaire mapping. Hoewel deze methode inzicht kan geven in biomoleculen op de vast-vloeistofgrensvlak, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, waaronder onderzoek naar enkelvoudige kankercellen, interacties van geneesmiddelen en de aanhechting van biofilms. Trek twee milliliter van een 70% ethanol-oplossing op in een spuit van vijf milliliter.Koppel de spuit aan het inlaatgedeelte van het SALVI-apparaat en injecteer langzaam één milliliter van de vloeistof gedurende 10 minuten. Verwijder na afloop van de injectie de spuit en verbind de inlaat en uitlaat van de SALVI met een polyether-ether-keton koppeling.

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Het doel van dit experiment is om vast te stellen en de grootte, vorm en stabiliteit van zelf-geassembleerde discotische amfifielen in het water te controleren. Voor waterige basis van supramoleculaire polymeren, mate van controle is erg moeilijk. Wij hanteren een strategie met behulp van zowel afstotend en aantrekkelijk interacties. De experimentele technieken toegepast om dit systeem te karakteriseren zijn breed toepasbaar.

Het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van de supramoleculaire polymeren in water

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Zachte landing van in massa geselecteerde ionen op oppervlakken is een krachtige aanpak voor de zeer gecontroleerde bereiding van nieuwe materialen. In combinatie met de analyse door in situ secundaire ionen massaspectrometrie (SIMS) en infrarood reflectie absorptie spectroscopie (IRRAS), zachte landing biedt ongekende inzichten in de interacties van welbepaalde soorten met oppervlakken.

In Situ SIMS en IR spectroscopie van Well-gedefinieerde oppervlakken die zachte landing van Mass-geselecteerde Ionen

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Sedimentatie-evenwicht (SE) kan worden gebruikt om eiwit-eiwit-interacties in een fysiologische omgeving te bestuderen. Dit manuscript beschrijft het gebruik van deze techniek om het effect van pH op de stabiliteit van een homo-pentameer, gevormd door het kleine hydrofobe (SH) eiwit dat wordt gecodeerd door het humane syncytiale respiratoir virus (hRSV), te bepalen.

Sedimentatie Evenwicht van een Kleine Oligomeer-vormende membraaneiwit: Effect van histidine Protonering op pentamere Stabiliteit

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Door in situ vloeistof Scanning elektronen microscopie presenteren we een procedure voor real-time beeldvorming en elementaire samenstelling analyse van böhmiet deeltjes in gedeïoniseerd water.

In Situ Karakterisering van böhmiet deeltjes in het Water met behulp van vloeibare SEM

Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van Interfaciale water op de atoomschaal, in termen van submolecular resolutie beeldvorming, moleculaire manipulatie en enkele-binding Vibrationele spectroscopie.

Sonderen de structuur en de dynamiek van Interfaciale Water met Scanning Tunneling microscopie en spectroscopie

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Leer hoe je geabsorbeerde eiwitfilms in waterige oplossingen karakteriseert met behulp van SALVI en ToF-SIMS. Deze methode biedt inzicht in biomoleculen en bio-interfaces voor biologisch onderzoek.

In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

Meer video's verkennen