In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van geadsorbeerde proteïnefilms in waterige oplossingen, gebruikmakend van het System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface en time-of-flight secundaire ionenmassaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over biomoleculen en de bio-interface. Bijvoorbeeld de karakterisering van geadsorbeerde proteïnen op een vast oppervlak.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de biomoleculen in situ in de vloeibare omgeving kunnen worden bestudeerd, en in combinatie met moleculaire mapping. Hoewel deze methode inzicht kan geven in biomoleculen op de vast-vloeistofgrensvlak, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, waaronder onderzoek naar enkelvoudige kankercellen, interacties van geneesmiddelen en de aanhechting van biofilms. Trek twee milliliter van een 70% ethanol-oplossing op in een spuit van vijf milliliter.

Koppel de spuit aan het inlaatgedeelte van het SALVI-apparaat en injecteer langzaam één milliliter van de vloeistof gedurende 10 minuten. Verwijder na afloop van de injectie de spuit en verbind de inlaat en uitlaat van de SALVI met een polyether-ether-keton koppeling. Houd het SALVI-microkanaal gedurende vier uur bij kamertemperatuur gevuld met de 70% ethanoloplossing.

Vul vervolgens een tweede spuit met steriel gedeïoniseerd water. Verbind deze met de inlaat van de SALVI en injecteer het gedeïoniseerde water gedurende 10 minuten langzaam in het apparaat. Verwijder de spuit en verbind de inlaat en de uitlaat van het apparaat opnieuw met elkaar.

Om een proteïnelaag te immobiliseren, begint u met het opzuigen van twee milliliters fibronectine-oplossing in een injectiespuit. Verbind de spuit met de inlaat van het SALVI-apparaat en injecteer langzaam één milliliter van de vloeistof gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens de spuit en verbind de inlaat en uitlaat opnieuw.

Incubeer de opstelling in een schone kweekschaal bij kamertemperatuur gedurende 12 uur. Injecteer na incubatie langzaam één milliliter steriel gedeïoniseerd water over een periode van 10 minuten en verbind vervolgens de inlaat opnieuw met de uitlaat. Begin met het plaatsen van de ToF-SIMS-台 op een vlak, schoon oppervlak.

Plaats het SALVI-apparaat op de tafel met de siliciumwafer en het siliciumnitride-membraan naar boven gericht. Bevestig het SALVI-apparaat aan de tafel met vier metalen klemstukken en draai de metalen stukken die de hoek van het apparaat vasthouden met vier schroeven vast in de metalen plaat. Rol vervolgens voorzichtig de PTFE-slang op die is verbonden met het microfluïdische kanaal.

Gebruik vier metalen plaatjes en vier schroeven om het stijve deel vast te zetten. Zorg ervoor dat het apparaat is gepositioneerd in de open ruimte op de houder, zodat het de primaire ionenbundel tijdens de analyse niet hindert. Monteer vervolgens de Faraday-cup op de houder met behulp van een schroef.

Open vervolgens de loadlock-deur van de ToF-SIMS en plaats de houder horizontaal op het laadplatform voordat u de deur sluit. Zet de vacuümpomp aan en laat de loadlock-kamer vacuüm trekken tot ongeveer 10⁻⁶ millibar. Verplaats het SALVI-apparaat na ongeveer 30 minuten, zodra het vacuüm gestabiliseerd is, naar de hoofdkamer.

Stel de primaire ionenbundel en de analyzer van de ToF-SIMS in om een ruimtelijke resolutie van ongeveer 400 nanometer te verkrijgen, volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol. Lokaliseer vervolgens het microfluïdische kanaal met behulp van de optische microscoop. Gebruik het centrum van het optische beeld als referentie en lijn dit uit zodat het overeenkomt met het centrum van het secundaire ionenbeeld.

Een visuele demonstratie van deze stap is cruciaal, aangezien deze lastig aan te leren is omdat het monster dikker is dan normale vaste monsters en het moeilijk is om de instellingen aan te passen om de beste focus van het kanaal te vinden. Gebruik vóór elke meting een zuurstofbundel van 1 keV om gedurende ongeveer 15 seconden over het siliciumnitridevenster te scannen om oppervlakteverontreiniging te verwijderen. Gebruik daarnaast een electron flood gun om oppervlaktelading tijdens alle metingen te compenseren.

Select vervolgens de positieve of negatieve modus voordat u begint met de data-acquisitie. Gebruik de 25 kiloelectronvolt bismuth drie plus als de primaire ionenbundel in alle metingen. Scan bij diepteprofilering de primaire ionenbundel over een rond gebied met een diameter van ongeveer twee micrometer met een resolutie van 32 pixels bij 32 pixels.

Om de tijd die nodig is om door het siliciumnitride-membraan te slaan te minimaliseren, dient een primaire ionenbundel met een lange polsbreedte te worden gebruikt. Na het doorbreken van het siliciumnitride-membraan wordt dezelfde stroom gedurende ongeveer 200 seconden gehandhaafd om voldoende gegevens te verkrijgen voor tweedimensionale beeldreconstructies. Verlaag voor de gegevensverzameling de polsbreedte naar 80 nanoseconden om spectra met een betere massaresolutie te verkrijgen.

Zet deze acquisitie voort voor ongeveer nog eens 200 seconden. Met behulp van de SALVI-microfluïdische interface kan de primaire ionenbundel direct bombarderen op de gehydrateerde fibronectinefilm. Een aantal waterclusters en aminozuurfragmenten worden aangewezen door de ToF-SIMS massaspectrometriegegevens.

Dit biedt direct bewijs voor de eigenschappen van watermoleculen rondom en binnenin de gehydrateerde eiwitmoleculen. Hier kan men de tijdreeks van het diepteprofiel zien van de gehydrateerde fibronectinefilm en van gedeïoniseerd water. De intensiteiten van geselecteerde secundaire ionen zijn verwaarloosbaar voordat het siliciumnitride-membraan wordt doorgeprikt.

Zodra het siliciumnitridemembraan is doorboord, nemen de intensiteiten van de secundaire ionen aanzienlijk toe. Het proces met een korte pulsuitrekking wordt gebruikt om gegevens met een betere massaresolutie te verkrijgen voor beeld- en spectrumreconstructies. De 2-D beelden van de gehydrateerde fibronectinefilm en het gedeioniseerde water vertegenwoordigen de tellingen van geselecteerde secundaire ionen uit het monster.

Hoe lichter het beeld, hoe hoger de tellingen van secundaire ionen. Deze intuïtieve beelden bieden een duidelijke vergelijking van geselecteerde secundaire ionen tussen verschillende monsters, wat nuttig is bij de data-analyse. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een microreactor lekvrij moet zijn voordat deze in de vacuümkamer wordt geplaatst.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biologie en bio-interfaces om eiwitadsorptie, biofilmhechting, zelfgeassembleerde monolagen en vele andere fenomenen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe verschillende vloeistofmonsters bestudeerd kunnen worden met behulp van SALVI en vloeistof ToF-SIMS.