Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

Het algemene doel van deze experimentele procedure is het onderzoeken van de rangschikking van elektroden in de registratiekamer voor gelijkstroomstimulatie van een hersensectie en het effect hiervan op epileptische activiteit geregistreerd met een multi-elektrode array. Dit kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over gelijkstroomstimulatie en de met een multi-elektrode array geregistreerde epileptische activiteit in een muizenhersensectie. Een voordeel van deze techniek is dat de effecten van gelijkstroomstimulatie kunnen worden geëvalueerd in het specifieke pad van de muizenhersensectie.

Hsiang Chin en Wei-Jen Chang, technici uit mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Steriliseer bij deze procedure alle chirurgische instrumenten met een 75% ethanol-oplossing vóór het experiment. Leg vervolgens de schedel van het dier bloot en trim het resterende spierweefsel weg.

Pel vervolgens het dorsale oppervlak van de schedel af met behulp van rongeurs en trim de zijkanten weg. Snijd daarna met een spatel de bulbi olfactorii en de zenusverbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen door voordat u deze verwijdert. Breng de hersenen snel over naar een bekerglas gevuld met ijskoud, zuurstofrijk ACSF.

Om coupes voor te bereiden die het MT-ACC-pad bevatten, maakt u een sagittale snede, 2 mm lateraal van de middellijn in elke hemisfeer, om de subcorticale anatomie bloot te leggen. Maak vervolgens een schuine dwarsdoorsnede parallel aan het zichtbare vezelbaan in het striatum. Maak de tweede schuine dwarsdoorsnede vanaf de verbinding tussen het cerebellum en de visuele cortex naar het middelpunt tussen de commissura anterior en het tractus opticus, die ventraal en parallel aan het thalamus cingulate-pad liggen.

Bevestig daarna het hersenblok met een cyanoacrylaatlijm aan een hoekplaat. Maak een snede net boven het omslagpunt van het traject. Vouw vervolgens de plaat uit, maak deze vlak en lijm deze op de kamertafel van een vibratoom.

Snijd vervolgens de hersensecties in plakjes van 500 micrometers dikte en bewaar deze in ijskoud, zuurstofrijk ACSF. Plaats een plakje gedurende één uur in de registratiekamer bij 32 degrees Celsius met een continue perfusie van zuurstofrijk ACSF. Bevestig de plaatsing van een MEA-probe op het multichannel-systeem.

Gebruik één slangetje om de ACSF in de MEA-kamer te leiden en het andere slangetje om de ACSF uit de kamer te leiden. Perfuseer het preparaat continu met warme, zuurstofrijke ACSF bij 30 °C. Breng met een vochtig wattenstaafje een hersenplakje over naar de MEA.

Verplaats de hersensnijde voorzichtig om de ACC boven de elektroden te positioneren en stabiliseer de hersensnede vervolgens met een slice anchor om een goede elektrische verbinding tussen de snede en de elektroden te garanderen. Plaats daarna de anode-elektrode proximaal ten opzichte van de ACC en de kathode-elektrode distaal ten opzichte van de ACC. Registreer de veldsterkte via de twee veldoriëntaties van de MEA.

Dien vervolgens de elektrische stromen toe met behulp van een stimulator. Stel de afstand tussen de twee zilverchloride-elektroden in op ongeveer 1,5 tot 2 cm en pas de stroomsterkte van de stimulator aan om de DCS tussen 0,5 en 2 milliamps te houden. Plaats bij deze procedure een wolfraamelektrode in MT en dien pulsen vanuit de stimulator toe aan de thalamische regio van het coupesectie.

Gebruik vervolgens verschillende stroomsterktes om de drempelwaarde te bepalen die een ACC-respons uitlokt. Verplaats de wolfraamelektrode langs het thalamo-cingulate pad om het optimale responsprofiel te verkrijgen. Registreer 1-20 ACC-responsen en gebruik de software om automatisch alle door MT-stimulatie opgewekte ACC-responsen te middelen.

Om epileptische activiteit op te wekken, voegt u 250 micromolar 48P en 5 micromolar bicuculline toe aan de perfusie-oplossing en blijft u de slice twee tot drie uur perfunderen. Houd de pomp op een relatief hoge perfusiesnelheid, wat kan helpen om de opbouw van een pH-gradiënt te voorkomen. Plaats vervolgens de wolfraamelektrode bij MT en dien elektrische stimulatie toe om een ACC-responsprofiel te verkrijgen.

Registreer 10-20 sweeps en bereken het gemiddelde van de responsen. Vervang daarna de prefusie-oplossing door verse ACSF om de geneesmiddelen uit te spoelen. Zorg bij deze procedure voor de generatie van uniforme elektrische velden door stromen te laten lopen tussen twee parallelle, met zilverchloride gecoate zilverdraden die in de MEA-kamer zijn geplaatst.

Indien er geen problemen zijn, moet de DCS tussen 0,5 en 2 milliampère blijven. Zet vervolgens de DCS uit en stimuleer de thalamus met een wolfraamelektrode. Om maximale synaptische responsen in de ACC te verkrijgen, worden 10-20 responsen geregistreerd om deze vervolgens te middelen.

Zet vervolgens de DCS aan en stimuleer gelijktijdig de thalamus. Evalueer de amplitudeveranderingen van de door thalamische stimulatie opgewekte ACC-respons tijdens de DCS. Zet nu de DCS uit, voeg 250 micromolair 48P en 5 micromolair bicuculline toe aan de perfusie-oplossing en wacht 2-3 uur.

Indien de geneesmiddelen effect hebben op de hersensectie, zou de sectie corticale epileptische responsen moeten vertonen. Verzamel vervolgens 10-20 responsen van de anterior cingulate cortex en meet de amplitude en duur van de elektrisch opgewekte corticale epileptische responsen. Zet daarna de DCS aan en stimuleer gelijktijdig de thalamus.

Evalueer de veranderingen in de amplitude en duur van de opgewekte corticale epileptische reacties tijdens de toediening van DCS. Vervang daarna de perfusie-oplossing door verse ACSF om de geneesmiddelen uit te spoelen. Deze figuur toont verschillende opgewekte reacties, waaronder de door thalamische stimulatie opgewekte reacties in de ACC, door geneesmiddelen geïnduceerde epileptische activiteit, en zowel de door thalamische stimulatie als door geneesmiddelen geïnduceerde epileptische activiteit.

Deze figuur toont het effect van verschillende oriëntaties bij DCS, zoals verschillende oriëntaties in het elektrisch veld, door thalamische stimulatie opgewekte responsen met DCS, en het effect van kathodale DCS op epileptische activiteit. In deze figuur is te zien dat 15 minuten kathodale DCS effectief langetermijndepressie heeft geïnduceerd en de opgewekte responsen heeft onderdrukt. De duur van de insulten was significant afgenomen na 15 minuten kathodale DCS in vergelijking met de situatie zonder toepassing van DCS.

sneller; technisch gezien kan dit in vier uur worden voltooid als het correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere zaken, zoals transcraniële magnetische stimulatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bieden van niet-invasieve benaderingen voor het beheersen van resistente insulten. Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van niet-invasieve therapie om behandelingen voor insulten in een diermodel te verkennen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe stroomstimulatie kan worden gebruikt om epileptische activiteit in hersensecties te beoordelen.