Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding
June 7th, 2016
Studies hebben aangetoond dat cathodale transcraniële gelijkstroom-stimulatie onderdrukkende effecten kan hebben op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen. In deze studie werd een in vitro experimentele opstelling bedacht waarin de gelijkstroom-stimulatie en de multi-elektrode array-registratie van aanvallen-achtige activiteit werden geëvalueerd in een herfsnede-preparaat van muizen. De parameters van de gelijkstroom-stimulatie werden geëvalueerd.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om toegang te krijgen tot de opstelling van elektroden in de opnamekamer voor directe stroomstimulatie van een hersenplakje en het effect ervan op aanvalsachtige activiteit die wordt geregistreerd met een multi-elektrode array. Dit kan beter helpen om belangrijke vragen over directe stroomstimulatie te beantwoorden en aanvalsachtige activiteit in een muis-hersenplakje die met een multi-elektrode array wordt opgenomen. Een voordeel van deze techniek is dat de effecten van directe stroomstimulatie kunnen worden geëvalueerd in de specifieke route van het muis-hersenplakje.
Demonstratie van de procedure zal worden gedaan door Hsiang Chin en Wei-Jen Chang, technici van mijn laboratorium. Bij deze procedure worden alle chirurgische instrumenten voor het experiment gesteriliseerd met 75% ethanoloplossing. Vervolgens wordt de schedel van het dier blootgelegd en wordt de resterende spier verwijderd.
Vervolgens wordt de dorsale oppervlakte van de schedel verwijderd met behulp van rongeurs en worden de zijkanten afgesneden. Vervolgens wordt met een spatel de reukbollen en zenuwverbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen doorgesneden voordat ze worden verwijderd. Breng de hersenen snel over in een beker gevuld met ijskoud, geoxygeneerd ACSF.
Om plakjes met de MT-ACC-route te bereiden, maak je een sagittale snede, 2 mm lateraal van de middenlijn in elk hemisphäre, om de subcorticale anatomie weer te geven. Maak vervolgens een schuine dwarssnede parallel aan de zichtbare vezelbundel in het striatum. Maak de tweede schuine dwarssnede vanaf de verbinding tussen de hersenen en de visuele cortex, tot het middenpunt tussen de anterior commissure en de opticusbaan, die ventraal en parallel aan de thalamus cingulate-route zijn.
Bevestig vervolgens de hersenblok op een hoekige plaat met een cyanoacrylaat-kleefstof. Maak een snede net boven het draaipunt van de route. Vouw vervolgens de plaat uit, maak hem plat en plak hem op de kamerfase van een vibratoom.
Vervolgens worden de hersenplakjes in een dikte van 500 micrometer gesneden en bewaard in ijskoud geoxygeneerd ACSF. Breng een plakje over naar de opnamekamer bij 32 graden Celsius met continue doorstroming van geoxygeneerd ACSF gedurende een uur. Bevestig de plaatsing van een MEA-sonde op het veelkanaalssysteem.
Gebruik één buis om de ACSF naar de MEA-kamer te leiden en de andere buis om de ACSF uit de kamer te leiden. Perfuseer de voorbereiding continu met warm, geoxygeneerd ACSF bij 30 graden Celsius. Gebruik een natte wattenstaafje om een hersenplakje naar de MEA over te brengen.
Verplaats voorzichtig het hersenplakje om de ACC boven de elektroden te oriënteren, stabiliseer vervolgens het hersenplakje met een plaksteun om een goede elektrische verbinding tussen de plak en de elektroden te garanderen. Plaats daarna de anode-elektrode proximaal van de ACC en de kathode-elektrode distaal van de ACC. Neem de veldsterkte op door de twee veldoriëntaties van MEA.
Vervolgens worden elektrische stromen toegediend met behulp van een stimulator. Pas de afstand tussen de twee zilverchloride-elektroden aan op ongeveer 1,5 tot 2 cm en pas de stroomsterkte van de stimulator aan om de DCS tussen 0,5 en 2 milliamp te maken. Bij deze procedure wordt een wolfraamelektrode in MT geplaatst en worden pulsen van de stimulator naar het thalamische gebied van de plak geleid.
Gebruik vervolgens verschillende stroomintensiteiten om de drempel te bepalen die een ACC-reactie oproept. Beweeg de wolfraamelektrode langs de thalamus cingulate-route om het optimale responsprofiel te verkrijgen. Neem 1-20 ACC-reacties op en gebruik de software om alle ACC-reacties geëvoceerd door MT-stimulatie automatisch te berekenen.
Om aanvalsachtige activiteit op te wekken, voeg je 250 micromolar 48P en 5 micromolar bicuculline toe aan de perfusieoplossing en blijf je de plak gedurende twee tot drie uur doorstromen. Houd de pomp op een relatief hoge perfusiesnelheid, wat kan helpen om de ophoping van een pH-gradiënt te voorkomen. Plaats vervolgens de wolfraamelektrode bij MT en geef elektrische stimulatie om een ACC-responsprofiel te verkrijgen.
Neem 10-20 sweeps op en bereken de gemiddelde reacties. Vervolgens vervang je de prefusieoplossing door verse ACSF om de medicijnen weg te spoelen. Bij deze procedure zorg je ervoor dat uniforme elektrische velden worden gegenereerd door stromen te laten passeren tussen twee parallelle zilverchloride-gecoate zilverdraden die in de MEA-kamer zijn geplaatst.
Als er geen problemen zijn, zou de DCS tussen 0,5 en 2 milliamp moeten blijven. Schakel vervolgens de DCS uit en stimuleer de thalamus met een wolfraamelektrode. Om maximale synaptische reacties in ACC te verkrijgen, neem je 10-20 reacties op en bereken je deze vervolgens.
Schakel vervolgens de DCS in en stimuleer de thalamus gelijktijdig. Evalueer de amplitudeveranderingen van de thalamische stimulatie-geïnduceerde ACC-reactie tijdens DCS. Schakel nu de DCS uit, voeg 250 micromolar 48P en 5 micromolar bicuculline toe aan de perfusieoplossing en wacht 2-3 uur.
Als de medicijnen effect hebben op de hersenplak, zou de plak corticale aanvalsachtige reacties moeten produceren. Verzamel vervolgens 10-20 anterior cingulate corticale reacties en meet de amplitude en duur van de elektrisch geëvoceerde corticale aanvalsachtige reacties. Schakel vervolgens de DCS in en stimuleer de thalamus gelijktijdig.
Evalueer de veranderingen in de amplitude en duur van de geëvoceerde corticale aanvalsachtige reacties tijdens DCS-toepassing. Vervang vervolgens de perfusieoplossing door verse ACSF om de medicijnen weg te spoelen. Deze figuur toont verschillende geëvoceerde reacties, waaronder de door thalamische stimulatie geïnduceerde reacties in ACC, door geneesmiddelen geïnduceerde, aanvalsachtige activiteit en zowel de thalamische stimulatie als de door geneesmiddelen geïnduceerde aanvalsachtige activiteit.
Deze figuur toont de invloed van verschillende oriëntaties in DCS, zoals verschillende or
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van cathodale transcraniële direct-stroom stimulatie op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen met behulp van een in vitro muis hersensnedemodel. De opstelling van elektroden en hun impact op aanval-achtige activiteit werden geëvalueerd door middel van een multi-elektrode array.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurostimulatie
Achtergrond
- Cathodale transcraniële direct-stroom stimulatie heeft potentiële therapeutische effecten op epileptische aanvallen.
- Het begrijpen van de mechanismen van stimulatie kan helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor geneesmiddelresistente epilepsie.
- In vitro modellen bieden nauwkeurige controle en observatie van neuronale activiteit.
- Multi-elektrode arrays bieden gedetailleerde opnames van elektrische activiteit in hersensnedes.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van direct-stroom stimulatie op aanval-achtige activiteit in muis hersensnedes te beoordelen.
- Om de opstelling van elektroden in de opnamekamer te evalueren.
- Om het begrip van de paden die door stimulatie worden beïnvloed te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van muis hersensnedes voor experimenten.
- Toepassing van cathodale transcraniële direct-stroom stimulatie.
- Opname van aanval-achtige activiteit met behulp van een multi-elektrode array.
- Evaluatie van stimulatieparameters en hun effecten.
Belangrijkste resultaten
- Direct-stroom stimulatie produceerde onderdrukkende effecten op aanval-achtige activiteit.
- Specifieke elektrodeopstellingen beïnvloedden de resultaten van stimulatie.
- De studie leverde inzichten in de paden die betrokken zijn bij aanvalmodulatie.
- Resultaten ondersteunen het potentieel van direct-stroom stimulatie in therapeutische toepassingen.
Conclusies
- Cathodale transcraniële direct-stroom stimulatie kan effectief aanvalactiviteit in vitro moduleren.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van stimulatietechnieken in de neurowetenschappen.
- Er is verder onderzoek nodig om deze bevindingen te vertalen naar klinische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neuromodulation strategies for seizure disorders by evaluating direct current stimulation effects on thalamocingulate pathway plasticity and seizure-like activity in an in vitro mouse model. It supports target validation and predictive confidence in preclinical neurotherapeutic development by quantifying amplitude and duration changes in electrically evoked cortical responses. The approach provides a reproducible platform for screening stimulation parameters prior to in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding neuromodulation of thalamocingulate circuitry in seizure suppression.
- Operational Value: Enables biological de-risking of direct current stimulation targets through pathway-specific electrophysiological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated brain slice preparations for standardized assessment of stimulation parameters including orientation, field strength, and duration.
- Operational Value: Delivers quantitative, multi-channel electrophysiological outputs that support assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity in anterior cingulate cortex.
- Operational Value: Supports translational continuity from mechanistic discovery to preclinical evaluation of neuromodulation interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization in neuromodulation, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of thalamocingulate circuitry as a modifiable target for seizure control.
- Screening: Enables assay readiness through standardized multi-electrode array recording of stimulation-evoked and seizure-like responses.
- Analytics: Generates quantitative measurements of response amplitude and duration that allow comparative analysis across stimulation conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by modeling drug-resistant seizure phenotypes in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating diverse neuromodulation paradigms beyond direct current stimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by demonstrating suppression of seizure-like activity through cathodal stimulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled perfusion, electrode placement, and multi-channel recording protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parameter optimization in vitro before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuromodulation candidates based on electrophysiological de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slice preparation, and multi-electrode array handling.
- Dependent on vibratory microtomes, perfusion systems, stimulators, and multi-electrode array acquisition units.
- Necessitates standardization of slice orientation, electrode positioning, and perfusion timing across experimental replicates.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require validation of pathway preservation and stimulation efficacy.
- Practical limitations include slice viability duration and the need for precise control of current density and field orientation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Preparation of Medial Thalamus-anterior Cingulate Cortex Brain Slice
3:01
Preparation of Perfusion Chamber for Multielectrode Array Recording and Electric Field Generation
4:23
Electrically-induced Cortical Synaptic Responses and Seizure-like Activity
5:58
Testing Effect of DCS on Evoked Cortical Responses
7:37
Results: Testing of Evoked Responses and Effect of DCS on Seizure Activity
8:37
Conclusion
