Name: Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer hoe je embryonale verlenging in Caenorhabditis elegans analyseert met tijdopnamemicroscopie en flowcytometrie. Deze methode identificeert genen die morfogenetische processen reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada en The Canada Foundation for Innovation. Dank aan Dr. Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) voor de let-502(sb118ts) stam. Enkele van de stammen werden verstrekt door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol beschrijft roman metrics om vroeg te karakteriseren en late stadia van de embryonale rek. In hoofdstuk 1, de kritische stap is de mogelijke aanwezigheid van bacteriën op het pad. De embryo&#39;s zijn hermetisch afgesloten tussen het pad en het dekglaasje tijdens beeldacquisitie. Het afdichten van de slide is nodig om uitdrogen van de dieren tijdens het verwerven die meer dan twee uur duurt te voorkomen. Voor zover wij weten, geen van de jagers gebruikt om agarose pads tussen gli...

Al bijna 50 jaar gevestigd het aaltje Caenorhabditis elegans zich als een krachtig model op belangrijke vragen in de ontwikkeling, neurobiologie, evolutie, gastheer-pathogeen interacties, enz. Bestuderen 1 De kracht van dit model in de studie van de ontwikkeling ligt in: de korte levenscyclus van 3 dagen; het gemak waarmee deze dieren genetisch kunnen worden gewijzigd; de transparantie dat de waarneming van de cel verplaatsing en morfologie maakt in levende dieren en de ontwikkeling die is meestal extra-uteriene. De ontwikkelingsstadia van de nematode betrekking embryogenese en vier larvale stadia (L1 tot L4), gevolgd door volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling, epidermale morfogenese vestigde aandacht op zijn vermogen om een ​​beter begrip van hoe epitheelcellen migreren als groep, hoe ze reorganiseren hun verbindingen mogelijk te maken en hun individuele morfologie en hun relatieve positie binnen een functioneel epitheel wijzigen.Epidermale morfogenese is verdeeld in vier fasen: dorsale intercalatie bestaande uit de reorganisatie van de dorsale epidermale cellen, als de onderhuid genoemd; ventrale behuizing, die bestaat in de migratie van ventrale onderhuidse cellen in de richting van het ventrale middellijn aldus het embryo in een epitheliale cel monolaag bekisten; vroege en late rek transformeren van de boon-vormige embryo in wormvormig larven. Naar aanleiding van morfogenese, embryo luik en L1 larven beginnen voeden met behulp van beschikbare bacteriën in hun directe omgeving. Embryonale rek is derhalve een laat stadium van de embryonale ontwikkeling. Het bestaat uit de verlenging van het embryo langs zijn langsas en een vermindering van de transversale diameter. Het gaat om een ​​dramatische verandering van de vorm van hypodermale cellen. De rek wordt verdeeld in een vroege en een late fase. De eerste fase begint bij de komma stadium en eindigt wanneer het lichaam muur spieren beginnen aanbestedende op 1,75 maal het podium in wild-type (wt) embryo - overeenkomt met embryo&#39;s die 1,75 maal de lengte in vergelijking met niet-langwerpige embryo. Morfogene processen die zich in die fase worden vooral gedreven door samentrekking van filamenteus actine bundels (FBS) bij het ​​apicale pool van onderhuidse cellen die hun rek rijden langs de antero-posterior as van het embryo 2. Samentrekking van FB is controle door fosforylering van myosine-lichte ketens door drie kinases LAAT-502 / ROCK, MRCK-1 en PAK-1 5. De late fase van het rek, begint wanneer het lichaam muur spieren functioneel geworden en beginnen contracting. Het gaat om mechanotransductie signalering uit het lichaam muur spieren aan de dorsale en ventrale onderhuidse cellen en eindigt wanneer dieren broeden 3. Rek defecten worden algemeen gekenmerkt door het percentage dieren sterven als embryo (embryonale letaliteit, EMB) en die de ontwikkeling arrestatie L1 larven (larven arrestatie fenotype; Lva) en beduidend korter dan gew. Identificatie van het stadium van ontwikkelings arrestatie vereist microscopische waarneming van dode embryo&#39;s en arresteerde Larven 3-6. Recent werd aangetoond dat meerdere genen, zoals Cdc42 / Rac regulator en effector pix-1 en pak-1, controle morfogene processen tijdens zowel vroege als late rek 3,7. We hebben onlangs aangetoond dat morfogene werkwijzen verschillen langs de antero-posterior as van het embryo tijdens de vroege elongatie 3 7. Deze bevindingen gemotiveerd de ontwikkeling van nieuwe metriek specifiek gericht vroege of late stadia rek en andere statistieken waardoor de karakterisering van de morfologie van embryo&#39;s langs de antero-posterieure as tijdens de vroege rek. Deze nieuwe werkwijzen omvatten het meten van de lengte van embryo aan het begin en aan het einde van vroege rek en de breedte van hun hijadvertenties en staarten. 7 Twee protocollen werden ontwikkeld om de lengte van de pas uitgekomen larven, gesynchroniseerd op L1 fase 7 meten. De eierschalen van het embryo beschermen deze tegen alkalisch hypochloriet behandeling, terwijl larven, volwassen en bacteriën in de kweekmedia worden opgelost door de behandeling. Deze behandeling wordt vervolgens gebruikt om embryo&#39;s te zuiveren van een niet-gesynchroniseerde populatie een meerderheid van goed gevoede 8 volwassenen. Voedselrestrictie wordt gebruikt om pas uitgekomen larven synchroniseren. Lengtemeetapparaten deze larven wordt vervolgens gebruikt om rek defecten te detecteren. Deze meting heeft de voorkeur boven het meten van gearresteerde larven op kweekplaten omdat larven die uitkomen uit niet-volledig verlengde embryo kan herstellen &quot;normale lengte&quot; wanneer het wordt ingevoerd, maar hun geringe grootte handhaven wanneer gearresteerd in afwezigheid van voedsel. Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen waardoor de meting van de length van het verlengen van embryo&#39;s, evenals de breedte van de kop en de staart met behulp van time-lapse DIC microscopie en beeldanalyse (Protocol 1). We bieden ook gedetailleerde protocollen om de lengte van gesynchroniseerde larven met behulp van beeldanalyse (Protocol 2) en Flow-Cytometry (Protocol 3) te meten.

<table><tbody><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Calcium Chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>High fluorescent control particles</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (magnesium sulfate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>SDB0487</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Drawing Gum 45&nbsp;ml</td><td>p&eacute;b&eacute;o</td><td>PDG033000</td><td>any art/craft store</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics te karakteriseren embryonale verlenging van de nematode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Het onderzoeken van de signaalroutes die de verandering van morfogenetische processen tijdens de embryonale ontwikkeling regelen, vereist robuuste en gevoelige metrische methoden. De embryonale verlenging van de nematode Caenorhabditis elegans is een late ontwikkelingsfase die bestaat uit de verlenging van het embryo langs de lengteas. Deze ontwikkelingsfase wordt geregeld door intercellulaire communicatie tussen hypodermale cellen en de onderliggende lichaamswandspieren. Deze signaalmechanismen controleren de morfologie van hypodermale cellen door het cytoskelet en de cel-celverbindingen om te vormen. Meting van embryonale letaliteit en ontwikkelingsstop in larvale stadia, evenals verandering van het cytoskelet en cel-cel-hechtingsstructuren in hypodermale en spiercellen zijn klassieke fenotypes die al meer dan 25 jaar worden gebruikt om deze signaalroutes te onderzoeken. Recente studies vereisten de ontwikkeling van nieuwe metrische methoden die specifiek gericht zijn op vroege of late verlenging en het karakteriseren van morfogenetische defecten langs de antero-posteriore as van het embryo. Hier bieden we gedetailleerde protocollen die de nauwkeurige meting van de lengte en de breedte van de verlengende embryo's, evenals de lengte van gesynchroniseerde larven, mogelijk maken. Deze methoden vormen nuttige hulpmiddelen om genen te identificeren die de verlenging regelen, om te beoordelen of deze genen zowel de vroege als late fasen van deze fase controleren en gelijkmatig vereist zijn langs de antero-posteriore as van het embryo.

Hoofd-, staart- en Head / Tail-breedteverhouding zijn robuust Metrics. De hier beschreven protocollen zijn met succes gebruikt om de functie van regulatoren en effectoren van Rho GTPases pix-1, pak-1 karakteriseren en laat-502 tijdens de vroege elongatie 7. ...

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Het algemene doel van deze groep experimenten is om ontwikkelingsdefecten te identificeren bij de nematode Caenorhabditis elegans tijdens de vroege en late fasen van de embryonale verlenging. Deze methode kan een kernvraag in het veld van de ontwikkelingsgenetica beantwoorden. Het maakt de karakterisering mogelijk van genen die een laat stadium van de embryonale ontwikkeling van Caenorhabditis elegans aansturen, genaamd de embryonale verlenging.Het belangrijkste voordeel van deze groep technieken is dat ze genen identificeren die ofwel de vroege of late fase van de verlenging beheersen, en ook diegenen die morfogenetische processen in het anterieure of posterieure deel van het embryo controleren. Ik zal de procedure demonstreren samen met Olivier Rocheleau-Leclair, een voormalige student van het laboratorium. Deze procedure vereist DIC-lenzen, een prisma en een video-opnamesysteem voor time-lapse microscopie van Z-stacks.Positioneer eerst het op het objectglas gemonteerde monster voor observatie. De details van de preparatie staan in het tekstprotocol. Identificeer, beginnend bij een lage vergroting, embryo's in hun pre-morfogenese stadia.Voeg vervolgens een druppel olie toe en gebruik een objectief met een hogere vergroting. Identificeer nu de bovenste en onderste punten van de embryo's om deze te registreren en stel de parameters voor de Z-stack in. Stel de time-lapse zo in dat er elke twee minuten beelden worden genomen.Zorg ervoor dat de lichtsluiter gesloten is tussen de beeldacquisities door. De tijd die nodig is om het vroege elongatie-event vast te leggen kan variëren van één tot acht uur, afhankelijk van het stadium van het embryo. Start nu het programma voor beeldacquisitie en sla de resultaten op.Ga vervolgens over tot de analyse met Fiji ImageJ-software. Zodra de afbeeldingen zijn geladen, selecteert u de Hyperstack-weergavemodus. Pas daarin de helderheid en het contrast aan door de Auto Mode uit de Lookup Tables toe te passen.Ga vervolgens naar Analyze Set Measurements en stel de parameters in. Stel voor elk embryo de Z-schaalbalk zo in dat de focus op de pharynx ligt, wat een goed referentiepunt is voor het middelpunt van het embryo. Pas nu de tijdschaalbalk aan naar het begin van de vroege elongatie voor een specifiek embryo.Noteer dit tijdstip. Bereken vervolgens de lengte van het embryo met de Analyze Measure-tool door een lijn te trekken van de punt van de staart naar de mond langs de middellijn. Noteer deze lengte.Pas vervolgens het tijdstip aan naar het einde van de vroege elongatiefase en herhaal de lengtemeting. Gebruik deze waarden om de duur van de vroege elongatie en de lengtegroei tijdens de vroege elongatie te berekenen. De verandering in breedte kan ook worden gemeten door met een hulpmiddel voor het trekken van rechte lijnen een lijn over de middellijn van de kop te trekken.Dit is een geschikte locatie voor consistente metingen. Voer dezelfde handeling uit bij de middellijn van de staart, bereken vervolgens de kop-staartverhouding voor elk tijdstip en gebruik dit om veranderingen in breedte te scoren. Voor dit protocol moet een flowcytometer worden klaargemaakt voor de doorstroming van grote deeltjes.Een dergelijke machine fungeert in feite als een wormsorteerder. Start vóór aanvang het laserblok, de compressor, de wormsorteerder en de software op. Klik in de software op Start en controleer de Argon Laser Control.Selecteer de Run-modus en laat de laser opwarmen tot een vermogen van bijna 10 milliwatt en selecteer vervolgens Done. Laat de druk gedurende ten minste 15 minuten equilibreren. Bereid nu het monster voor.Laad eerst 10 µL gesynchroniseerde wild-type L1 in een horlogeglas en schat onder een microscoop het fractie aandeel dode eieren. Als de schatting hoger is dan 20%, gebruik het monster dan niet. Overbreng de ongeveer 700 µL gesynchroniseerde L1 in M9-oplossing naar een buis van 15 mL en voeg propidiumjodide toe tot een concentratie van 10 µg/mL.Laat de kleuring 30 minuten inwerken bij kamertemperatuur. Bereid nu het systeem voor. Het is essentieel om de stroomsnelheid via de Sheath- en Sample Flow Controllers respectievelijk op 5.1 en 5.51 in te stellen.Zodra de druk is gestabiliseerd, vinkt u het vakje Pressure Okay aan. Gebruik vervolgens het commando Acquire en tik handmatig tegen de tubulus om eventuele luchtbellen uit het kanaal tussen het monsterbekertje en de analysekamer te verwijderen. In het Acquisition Window zal uiteindelijk worden weergegeven dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Dit is ook essentieel voor het experiment. Stel nu de parameters in voor de fluorescentie- en TOF-metingen. Stel de schalen voor TOF, EXT, Groen, Geel en Rood in op 256.Stel vervolgens de Gain in zoals vermeld. Stel daarna de PMT-controle in op 700 voor zowel Groen als Geel, en op 900 voor Rood. Kalibreer nu de wormensorteerder.Laad 20 milliliters algemene controledeeltjes met hoge fluorescentie in een monsterbeker en plaats deze in de sorter. Selecteer in de software Run Control Particles onder Tools en klik op Acquire. Controleer of de resulterende variatiecoëfficiënt groter dan of gelijk is aan 11 en of het gemiddelde gelijk is aan 21 plus of min zes.Indien dit niet het geval is, probeer de tubuli dan te reinigen door op de knop Clean te klikken of door het stroomkanaal kortstondig te laten bewegen (flicking). Verlaat nu de modus Control Particles door het commando onder Tools uit te vinken. Zodra de 30 minuten durende kleuring van de wormen met propidiumjodide is voltooid, voegt u 10 milliliters M9 toe aan de gekleurde wormen en mengt u dit.Incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur. Neem nu vijf milliliter van de verdunning en voeg dit toe aan een monsterbeker met 15 milliliter M9. Laat deze verdunning door de wormsorter lopen. Druk op de knop Acquire en observeer de stroomsnelheid.Het kan noodzakelijk zijn om de concentratie wormen aan te passen om een goede flow te verkrijgen, ergens tussen de 15 en 25 objecten per seconde. Zodra de juiste concentratie objecten is bereikt, voegt u controledeeltjes toe aan de test om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 0,5 tot 1x controledeeltjes in de oplossing te verkrijgen. Pas nu de Gating-parameter onder het Gating-menu aan naar TOF versus Green.Pas vervolgens de sorteringsparameters aan naar TOF versus Rood. Hiermee worden de controlepartikels gescheiden van de dode dieren en de levende dieren. Voer nu het experiment uit door op Acquire te klikken.Analyseer ongeveer 10.000 objecten, wat overeenkomt met ongeveer 8.000 dieren. Stop vervolgens het experiment en klik op Store om de gegevens als tekstbestand op te slaan voor analyse. Om de robuustheid van de meting van de kopbreedte vast te stellen, werd de meting vijf keer onafhankelijk uitgevoerd op 12 wild-type embryo's in het 1,2-voudige stadium.Er waren geen varianties tussen de gegevens bij toepassing van de Brown-Forsythe-test. De reproduceerbaarheid en batch-effecten geassocieerd met de meting van de kopbreedte werden getest met behulp van 4D DIC-beeldvorming op drie verschillende dagen. Over deze drie meetgroepen werden geen varianties of batch-effecten gevonden.Beide beschreven protocollen werden gebruikt om de lengte van gestopte larven in wildtype en mutante achtergronden te beoordelen. Beeldanalyse leverde absolute lengtemetingen op in micrometers. In dit experiment waren de mutanten kleiner dan de wildtypes.Meting van de lengte via flowcytometrie leverde vergelijkbare resultaten op. Deze metingen waren echter veel robuuster. Daarom zou deze methode subtielere effecten in mutantpopulaties moeten kunnen aantonen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een constante stroomsnelheid tijdens het experiment te handhaven om een eerlijke vergelijking tussen de geanalyseerde stammen te garanderen. Zodra de methode onder de knie is, maakt de meting van de larvelengte met flowcytometrie de karakterisering van 18 tot 24 condities of mutante stammen per dag mogelijk, zelfs rekening houdend met de initiële kalibratie van de apparatuur. Door deze procedure te volgen, zijn we in staat de morfologie van de hypodermale cel te bestuderen.Om dit te doen kunnen we fluorescerende markers en confocale microscopie gebruiken om de moleculaire functie van de geïdentificeerde genen te karakteriseren. Vergeet niet dat propidiumjodide extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

We hebben een video-rate volgen microscoop systeem dat kan opnemen en te...

C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

This video demonstrates the use of a radial locomotion assay to evaluate motor dysfunction in C. elegans expressing either wild-type or ALS-mutant human TDP-43 protein. Worms with varying levels of wild-type or mutant TDP-43 expression are allowed to crawl, and their movement is measured by the radial distance traveled from the central point on the assay plate. The assay distinguishes between mild, moderate, and severe motor impairments based on the distance traveled by the different C. elegans...

Evaluating Motor Impairment in C. elegans Models Using the Radial Locomotion Assay

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo's , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.

4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Leer hoe je embryonale verlenging in Caenorhabditis elegans analyseert met tijdopnamemicroscopie en flowcytometrie. Deze methode identificeert genen die morfogenetische processen reguleren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode

Meer video's verkennen