Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel
8 augustus 2017
Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.
Het algemene doel van deze gradiëntspanningschip is om een eenvoudige aanpak te bieden om niet-continue gradiëntstatische spanningen op een 3D-hydrogel te genereren voor de onderzoek naar celgedrag onder verschillende spanningscondities. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het bio-engineeringveld te beantwoorden, zoals de stimulatie van stamceldifferentiatie en de regulering van cellulaire uitlijning voor de ontwikkeling van kunstmatig weefselorgaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat verschillende spanningen op de cel- en hydrogellagen in dezelfde micro-omgeving kunnen worden toegepast voor vergelijking van celgedrag.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de voorbereidingsstappen van de chip moeilijk te leren zijn, aangezien het licht drie tot vier uur volledig moet zijn voor de basis van het experiment om hoge celvariabiliteit te garanderen. Weeg 10 gram gelatinepoeder en voeg het toe aan een glazen kolf met 100 milliliter Dulbecco's fosfaat-gebufferd zoutoplossing of DPBS. Plaats een magnetische roerder in de kolf en plaats de kolf op een roerende hotplate.
Bedek de kolf met aluminiumfolie om waterverdamping te voorkomen. Stel de hotplate-temperatuur in op 50 tot 60 graden en de roerder op 100 RPM gedurende één uur om het gelatinepoeder op te lossen. Nadat het gelatine is opgelost, voegt u heel langzaam acht milliliter methacrylzuuranhydride toe met behulp van een pipette.
Laat het drie uur reageren bij 60 graden Celsius. Voeg vervolgens voorverwarmde DPBS toe aan de kolf tot een eindvolume van 500 milliliter. Laat de oplossing 15 minuten goed mengen om de reactie te stoppen.
Snijd ondertussen een dialysemembraan in verschillende buizen van 25 millimeter lang. Dompel ze 15 minuten onder in gedeïoniseerd water. En maak een knoop om een van de uiteinden van de dialysebuizen te sluiten.
Laad de juiste hoeveelheid polymeeroplossing in de dialysebuizen en sluit het andere uiteinde. Plaats vervolgens de gevulde buizen in een plastic beker van vijf liter met gedeïoniseerd water gedurende een week. Ververs het gedeïoniseerd water twee keer per dag en houd de oplossing gedurende het dialyseproces op 40 tot 50 graden Celsius.
Na de dialyse verzamel de oplossing uit de buizen in een glazen fles van 500 milliliter. Giet ongeveer 450 tot 500 milliliter oplossing in een 500 milliliter filterbeker. En breng een vacuüm aan om de oplossing door het filtermembraan te forceren voor sterilisatie.
Breng vervolgens de gesteriliseerde polymeer in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 milliliter. Breng de gesteriliseerde polymeer over in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 milliliter en bewaar ze in een vriezer van min 80 graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen. Vries droog het polymeer van min 80 graden Celsius gedurende een week met behulp van een vriesdroger om GelMA te vormen, die vervolgens in een vriezer van min 80 graden Celsius kan worden bewaard.
Voor de chipfabricage bereidt u eerst het polymethacrylaat of PMMA voor, gespeeld en gevormd zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid vervolgens de PTMS-deksel en de PTMS-stop aan door 30 gram PTMS-elastomeer en drie gram PTMS-hardingsmiddel goed te mengen. Ontgast het mengsel gedurende één uur onder een vacuümkamer.
Giet 1,8 tot twee gram van het mengsel in de PMMA-vorm voor de PTMS-deksel. Gebruik ook de juiste hoeveelheid om elke holte voor de PMMA-vorm voor de PTMS-stop te vullen. Giet bovendien 10 gram ongehard PTMS-mengsel in een blanco plastic plaat van 10 centimeter.
Plaats deze mallen in een vacuümkamer om gedurende 30 minuten te ontgasten. Genees de PTMS gedurende twee uur bij 80 graden Celsius. Nadat de genezen PTMS op de mal is afgekoeld, verwijdert u de PTMS-deksels en de PTMS-stops van de PMMA-mallen.
Boor vervolgens twee gaten met diameters van ongeveer drie millimeter aan de uiteinden van de stroomkanalen van de PTMS-deksels. Snijd het PTMS-blad, gegoten uit de plastic plaat van 10 centimeter, in vele blokjes van één centimeter bij één centimeter. En boort een gat van drie millimeter in elk PTMS-blok.
Lijm twee ongeharde PTMS-blokken van één centimeter bij één centimeter op de openingen van het PTMS-deksel om als mediumreservoirs te dienen en om te helpen bij het uithardingsproces van de gradiëntcirkelvormige hydrogelpatronen. Genees vervolgens gedurende één uur bij 80 graden Celsius. Lijm vervolgens de PTMS-deksels met de twee PTMS-reservoirs op een TMSPMA-gecoate dia.
Om dit te doen, behandel de bindingszijde van het PTMS-deksel en de TMSPMA-gecoate dia onder een zuurstofplasmamachine gedurende 90 seconden met zuurstofplasmabehandeling. Breng het plasmabehandelde oppervlak van de PTMS-deksels en de TMSPMA-dia in contact en druk ze dicht op elkaar voor permanente binding door de vorming van de siliciumzuursiliciumbinding. Druk een fotomasker af door de vastgestelde lay-out op een transparante film af te drukken.
Snijd vervolgens de gedrukte fotomasker in grootte van 25 millimeter bij 37,5 millimeter. Weeg 25 milligram gevriesdroogd GelMA in 0,3 milliliter voorverwarmd celkweekmedium in een zwarte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Plaats de microcentrifugebuis op een laboratoriumroerder hotplate tot het GelMA in het medium is opgelost.
Voeg 50 milligram foto-initiator toe aan één milliliter DPBS in een microcentrifugebuis. Plaats het in een oven van 80 graden Celsius gedurende 15 minuten of totdat de foto-initiator is opgelost. Voeg 25 microliter van de 10% foto-initiator toe aan de microcentrifugebuis.
Pipetteer meerdere keren om goed te mengen. Tel vervolgens drie miljoen NIH3T3-cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. Na centrifugatie van de suspensie bij 200 Gs gedurende vijf minuten, gooit u de supernatant weg en hersuspendeert u de cellen in 175 microliter celkweekmedium.
Voeg
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering voor het aanbrengen van niet-continu gradiëntstatische rek op een concentrische, celhoudende hydrogel om de celuitlijning voor tissue engineering te reguleren. De gradiëntrek-chip is bedoeld om celgedragingen onder verschillende rekcondities te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Tissue Engineering
- Celgedrag
- Bioengineering
Achtergrond
- Het begrijpen van celuitlijning is cruciaal voor de ontwikkeling van kunstmatig weefsel.
- Stamceldifferentiatie kan worden beïnvloed door mechanische stimuli.
- Huidige methoden missen mogelijk het vermogen om variërende rekken toe te passen in een gecontroleerde omgeving.
- Een visuele demonstratie van de chipvoorbereiding is essentieel voor de reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het genereren van niet-continue gradiënt statische rekken.
- Het onderzoeken van de effecten van deze rekken op de uitlijning en het gedrag van cellen.
- Het faciliteren van vergelijkingen van celrespons binnen een consistente micro-omgeving.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een 3D-hydrogel met behulp van gelatine en DPBS.
- Toepassing van gradiënt statische rek op de celhoudende hydrogel.
- Observatie van het celgedrag onder verschillende rekcondities.
- Visuele documentatie van het proces voor de bereiding van de chip.
Belangrijkste resultaten
- De haalbaarheid van het toepassen van verschillende rekcondities op de hydrogel is aangetoond.
- Er is aangetoond hoe rekcondities de uitlijning van cellen beïnvloeden.
- Er zijn inzichten verschaft in de mechanismen van stamceldifferentiatie.
- Het belang van de consistentie van de micro-omgeving in experimenten is benadrukt.
Conclusies
- De gradient-strainchip is een waardevol instrument voor onderzoek naar tissue engineering.
- Het maakt het mogelijk om mechanische invloeden op het celgedrag te onderzoeken.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om de weefselontwikkeling te verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze gradiënt-rekchip maakt gecontroleerd onderzoek mogelijk naar cellulaire reacties op mechanische stimuli in 3D-hydrogels, waarmee een belangrijke uitdaging in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt aangepakt. Door niet-continue gradiënt statische rekken te genereren binnen één microfluïdische omgeving, ondersteunt deze methode het mechanistische risicobeheer van biomateriaalkoncepten en voorspellende modellering van celgedrag onder fysiologisch relevante mechanische signalen. Deze functionaliteit verbetert workflows voor targetvalidatie en assayontwikkeling door een reproduceerbaar platform te bieden om te screenen hoe mechanische gradiënten de cellulaire uitlijning, differentiatie en weefselvorming beïnvloeden—kritieke factoren voor de relevantie van preklinische modellen en de ontdekking van translationele biomarkers.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe gradiënten van mechanische rek de cellulaire uitlijning en het fenotype moduleren, wat bijdraagt aan de validatie van targets in mechanotransductiepaden.
- Operationele waarde: Maakt een zij-aan-zij vergelijking mogelijk van celgedrag over een spectrum van rek (15–65%) in een enkele chip, waardoor de experimentele variabiliteit wordt verminderd en de doorvoersnelheid voor hypothesetoetsing wordt verhoogd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert kwantificeerbare veranderingen in de geometrie van de hydrogel (lijnbreedtegradiënten) die correleren met de toegepaste rek, waardoor gestandaardiseerde read-outs voor assays van cellulaire respons mogelijk worden.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor externe rekinstrumenten door het zelfstandig creëren van gradiënt-micro-omgevingen na UV-crosslinking, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert en contaminatierisico's in steriele workflows vermindert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bootst de mechanische heterogeniteit van natuurlijk weefsel na, waardoor de ziekterelevantie van in vitro-modellen voor fibrose, wondgenezing en weefselkweek van het bewegingsapparaat wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale kweek (tot 7 dagen) met verversing van het medium, wat de beoordeling van temporele cellulaire adaptaties aan mechanische gradiënten in preklinische continuïteitsstudies mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door vroegtijdige mechanistische screening van biomaterialen onder instelbare mechanische omstandigheden mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-verbindingen en risicoreductie voorafgaand aan in vivo validatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten over hoe mechanische gradiënten de cytoskeletorganisatie en nucleaire signalering in celhoudende hydrogels beïnvloeden.
- Screening: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste rekprofielen via metingen van de lijnbreedte van de hydrogel, wat zorgt voor gestandaardiseerde, vergelijkbare resultaten over verschillende experimentele condities.
- Analytics: Biedt op beeldvorming gebaseerde morfometrische read-outs (cellulaire uitlijningshoeken, oriëntatie-ordeparameters) die statistische vergelijking van rek-geconditioneerde responsen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontwikkelingsbiologie en preklinische modellering door rekgradiënten te reproduceren die worden waargenomen in ontwikkelende of genezende weefsels.
- Enterprise Hergebruik: Het ontwerp van de fluïdische chip maakt meerdere replicaten en condities per run mogelijk, wat de platformstandaardisatie bevordert tussen teams en projecten in screeningsprogramma's voor mechanobiologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in cel-materiaalinteracties door topografische en rekgebaseerde sturingssignalen te ontkoppelen, wat het vertrouwen in de target-engagement vergroot.
- Operationele waarde: Standaardiseert de bereiding van hydrogelen en de toepassing van rek via dialyse-gebaseerde GelMA-fabricage en UV-gemedieerde crosslinking, waardoor de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van biomaterialen door rekdrempels te identificeren die ongewenste fenotypische verschuivingen triggeren (bijv. verlies van uitlijning, willekeurige organisatie).
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van hydrogelformuleringen mogelijk op basis van hun vermogen om gestuurde cellulaire uitlijning te behouden onder fysiologische rekbereiken.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de assemblage van microfluïdische apparaten, UV-fotopatterning en hydrogelsynthese (GelMA-bereiding via dialyse en sterilisatie).
- Afhankelijk van toegang tot vacuümkamers, warmteplaten, zuurstofplasmareinigers, UV-lampen en steriele celkweekincubators.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor chipbonding, uitlijning van fotomaskers en fluïdische belading om een consistente gradiëntvorming te garanderen.
- Aanpassing aan andere celtypen (naast NIH3T3) kan optimalisatie van de celdichtheid, GelMA-concentratie en foto-initiatorniveaus vereisen om de levensvatbaarheid en functionaliteit te behouden.
- Praktische beperkingen omvatten het UV-blootstellingsvenster van 3–4 uur voor de stabiliteit van het prepolymeer en de noodzaak van nauwkeurige reiniging om belbubbelvorming tijdens het bonden te voorkomen.
