Name: Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Leer een eenvoudige methode om niet-continue gradiëntstatische spanningen toe te passen op cel-beladen hydrogels voor het bestuderen van celuitlijning in weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de Graduate Student studie in het buitenland programma (NSC-101-2917-I-007-010); het programma van de biomedische ingenieurstechnieken (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); en de nanotechnologie nationale programma (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council van de R.O.C., Taiwan. De auteurs bedank Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul en Ronglih Liao aan Harvard Medical School voor het delen van de hydrogel en cel inkapseling-technologie.

1. GelMA-synthese
<ol>
	<li>Weeg 10 g gelatinepoeder af en voeg dit toe aan een glazen kolf met 100 mlDulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Doe een magnetische roerlat in de kolf en plaats deze op een roerende hotplate.</li>
	<li>Dek de kolf af met aluminiumfolie om waterverdamping te voorkomen. Stel de hot plate temperatuur in op 50-60 °C en de roerder op 100 rpm gedurende 1 uur om het gelatinepoeder goed op te lossen.</li>
	<li>Nadat de gelatine is opgelost, voeg 8 mL methacrylzuuranhydride zeer langzaam toe (één druppel per seconde) met behulp van een pipette. Laat het reageren bij 60 °C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Voeg voorverwarmde DPBS (40 °C) toe aan de kolf tot een eindvolume van 500 mL en laat deze mix gedurende 15 minuten mengen om de reactie te stoppen.</li>
	<li>Snij ondertussen een dialysemembraan (14 kDa snijwergrootte) in verschillende buizen van 25 cm lang. Dompel ze 15 minuten onder in gedeïoniseerd (DI) water en maak een knoop om één uiteinde van de dialysebuizen te sluiten.</li>
	<li>Laad de geschikte hoeveelheid (30 - 60 mL) van de polymeeroplossing in de dialysebuizen en sluit het andere uiteinde. Plaats ze in een 5-L plastic beker met DI water gedurende een week. Ververs het DI water twee keer per dag en houd de oplossing tijdens het dialyseproces op 40 - 50 °C.</li>
	<li>Verzamel de oplossing uit de buis in een glazen fles van 500 mL. Giet ~450 - 500 mL oplossing in een 500-mL filterbeker (poriegrootte van 0.22 µm) en breng een vacuüm aan op de filterbeker om de oplossing door de filtermembraan te forceren voor sterilisatie.</li>
	<li>Breng de gesteriliseerde polymeer over in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 mL en bewaar ze in een -80 °C vriezer gedurende 3 - 5 dagen.</li>
	<li>Vriesdroog de -80 °C polymeer gedurende 1 week met behulp van een vriesdroger om GelMA te vormen. Bewaar de GelMA in een -80 °C vriezer.</li>
</ol>
2. 3-(Trimethoxysilypropyl)methacrylaat (TMSPMA)-modificatie
<ol>
	<li>Snij commerciële glasplaten in twee kleine stukken (25 mm x 37,5 mm) en dompel ze 4 uur lang onder in 0,5 M NaOH-oplossing. Was de platen met een grote hoeveelheid DI water.</li>
	<li>Plaats de plaat op een rek in een glazen container met 95% ethanol en reinig met behulp van een ultrasone reiniger op 43 kHz gedurende 15 minuten. Laat de glasplaat aan de lucht drogen.</li>
	<li>Dompel de glasplaten 1 uur lang in 5% TMSPMA in 99,5% ethanol.</li>
	<li>Was de platen in 95% ethanol, laat de platen aan de lucht drogen en gloei de TMSPMA-coating in een oven gedurende 2 uur bij 80 °C.</li>
</ol>
3. Chipfabricage
<ol>
	<li>Neem één 2 mm- en één 0,3 mm-dik polymethylmethacrylaat (PMMA) plaat, breng dubbelzijdig plakband aan op één zijde van het PMMA-oppervlak en laat de lijnvoering aan één zijde los. Laat twee 2 mm-dikke PMMA-platen en één 1 mm-dikke plaat zonder dubbelzijdig plakband achter.</li>
	<li>Snijd met een laser een 2 mm-dikke PMMA-plaat zonder dubbelzijdig plakband tot 42 mm x 30 mm om de onderplaat te maken. Snijd een 2 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband om de randplaat te maken, met buitenafmetingen van 42 mm x 30 mm en binnenafmetingen van 37,5 mm x 25 mm.</li>
	<li>Snijd met een laser de 0,3 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband in een 12 mm-centrumcirkel met twee 2 mm-brede en 8 mm-lange stromingskanalen aan tegenovergestelde kanten van de cirkel (Figuur 1a).</li>
	<li>Om de PMMA-mal voor het gieten van de PDMS-afdekking voor te bereiden, monteer de drie stukken PMMA-componenten uit stappen 3.2-3.3 (Figuur 1b) met behulp van dubbelzijdig plakband.</li>
	<li>Snijd met een laser een 2 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband in een 5 cm x 5 cm stuk met een 3 x 3-array van 8,5 mm x 8,5 mm holle rechthoeken. Snijd nog een 5 cm x 5 cm stuk met een 3 x 3-array van 4 mm holle cirkels. Snijd met een laser een 1 mm-dikke PMMA-plaat zonder dubbelzijdig plakband in een 5 cm x 5 cm PMMA-onderplaat.</li>
	<li>Bereid de PMMA-mal voor om de PDMS-plug te gieten door de drie stukken PMMA-componenten uit stap 3.5 (Figuur 1c) met behulp van dubbelzijdig plakband samen te stellen.</li>
	<li>Bereid de PDMS-afdekking en PDMS-plug voor door 30 g PDMS-elastomeer en 3 g PDMS-hardingsmiddel goed te mengen; schuim het mengsel onder vacuüm gedurende 1 uur.</li>
	<li>Giet 1,8-2,0 g van het mengsel in de PMMA-mal voor de PDMS-afdekking en gebruik de geschikte hoeveelheid om elke holte van de PMMA-mal voor de PDMS-plug te vullen. Giet 10 g ongehard PDMS-mengsel in een lege 10-cm plastic plaat. Doe deze mallen in een vacuümkamer om gedurende 30 minuten te schuim.</li>
	<li>Hard de PDMS gedurende 2 uur bij 80 °C. Nadat de gehard PDMS op de mal is afgekoeld, verwijder de PDMS-afdekkingen en de PDMS-plugs van de PMMA-mallen.</li>
	<li>Puns twee gaten met diameters van ongeveer

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
<li>Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes+in+a+compliant+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system.</a> Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+effects+of+mechanical+strain+on+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).</li>
<li>Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+strain+stimulates+fibroblastic+phenotype+shift+in+smooth+muscle+cells+in+an+engineered+tissue+model+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall.</a> Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).</li>
<li>Ramon-Azcon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacrylate+as+a+promising+hydrogel+for+3D+microscale+organization+and+proliferation+of+dielectrophoretically+patterned+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells.</a> Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).</li>
<li>Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-Based+Comparison+of+the+Osteogenesis+of+Human+Bone+Marrow-+and+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+under+Mechanical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation.</a> PLoS One. 7 (9), e46689(2012).</li>
<li>Gould, R. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22281945">Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture.</a> Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17060641">Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells.</a> Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).</li>
<li>Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Induced+Alignment+in+Collagen+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Induced Alignment in Collagen Gels.</a> PLoS One. 4 (6), e5902(2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/4/2/1084">Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery.</a> Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+Counts%3A+Microenvironmental+Regulation+of+Stem+Cells+by+Biophysical+and+Material.+Cues%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).</li>
<li>Segers, V. F., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+therapy+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell therapy for cardiac disease.</a> Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).</li>
<li>Hsieh, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+static-strain+stimulation+in+a+microfluidic+chip+for+3D+cellular+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment.</a> Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze paper rapporteren we op een eenvoudige benadering te vergelijken het uitlijningsgedrag cel na hydrogel vorm begeleiding en treksterkte rek. Een flexibele membraan PDMS creëert een koepel-vormige kromming voor het genereren van verschillende hoogtes van concentrische circulaire hydrogels. Na het loslaten van de druk, het PDMS membraan automatisch toegepast kracht op de hydrogels micro-patroon te vormen van de kleurovergang stam/rek, met een maximum in het midden en ten minste bij de buitenste rand. Zoals de vormin...

Een blok-materiaal dat een inheemse communicatie bootst bijeenkomen, kan een hydrogel extracellulaire matrix (ECM) met herbouwen biomimetische weefsel steigers ter ondersteuning van de celgroei. Om te bezitten van de functies van een weefsel, is georganiseerde Celuitlijning een essentiële eis. Diverse 2D (dat wil zeggen, de cellen gekweekt op een oppervlak) en 3D (dat wil zeggen, de cellen ingekapseld in een hydrogel) cel uitlijning zijn bereikt door kweken of inkapselen van cellen in of op flexibele ondergronden met micro- of nano-patronen1. 3D uitlijning in microarchitectuur is aantrekkelijker te maken, zoals de communicatie dichter bij de inheemse weefsel construct2,3,4 is. Een gemeenschappelijke aanpak voor 3D Celuitlijning is de geometrische cue hydrogel vorm2,3. Vanwege de beperkte ruimte voor celproliferatie in de richting van de korte-as willen cellen uitgelijnd langs de richting van de lange-as in een micro-patroon hydrogel. Een andere benadering is trekvast stretch beroep openstaan bij de hydrogels om Celuitlijning parallel aan de stretch richting4,5.
Biofysische stimulatie op ECM hydrogels, zoals druksterkte stam of een elektrisch veld, kan reguleren cel functies voor goede weefsel integratie, proliferatie en differentiatie1,2,3. Veel onderzoek is gedaan om te onderzoeken van cellulaire gedrag door één stam voorwaarde toe te passen op een moment met behulp van meerdere mechanische controle eenheden4,6,7,8,9. Bijvoorbeeld is het gebruik van mechanische stap motors geperst of uitgerekt over een 3D cel-ingekapseld collageen hydrogel een gemeenschappelijke aanpak7,10. Echter, dergelijke controlerende apparatuur vereist extra ruimte en geconfronteerd met het probleem van de besmetting in de incubator7,9,11,12. Daarnaast het grote instrument niet het geven van een nauwkeurige controleomgeving te bieden hoge reproduceerbaarheid13.
Gezien het feit dat de cel-beladen hydrogels meestal op de micro-schaal voor biomedische toepassingen worden ingezet, is het voordelig om te combineren MEMS technieken voor het genereren van een aantal van de stam/stretch stimulatie te onderzoeken gelijktijdig cel gedrag in 3D biomimetische constructies in vitro2,14,15,16,17,18. Bijvoorbeeld kan met behulp van gasdruk te vervormen het PDMS membraan in microfluidic chips aanleiding geven tot verschillende stammen, celdifferentiatie rijden naar verschillende geslachten9,16. Er zijn echter vele technische uitdagingen, zoals de gecompliceerde chip fabricage processen in een schone kamer en de software controle integratie van motoren, pompen, afsluiters en samengeperste gassen.
In dit werk tonen we een eenvoudige benadering van een zichzelf onderhoudende kleurovergang static-stam microfluidic chip verkrijgen door gebruik te maken van een concentrische circulaire hydrogel patroon en een flexibele PDMS membraan. In tegenstelling tot de meeste van de bestaande benaderingen is ons platform een draagbare en wegwerp miniatuur-apparaat dat kan worden vervaardigd buiten een gele kamer en die bezit zelf genereren kleurovergang stammen op concentrische cel-ingekapseld hydrogels, zonder externe mechanische apparatuur tijdens de incubatie. 3T3 fibroblast cel gedrag beïnvloed door een combinatie van hydrogel vorm en een scala aan treksterkte stretch begeleiding signalen werden gedemonstreerd tijdens de observatie van de celuitlijning in 3D ECM-mimetische omgevingen in de kleurovergang stam-chip voor 3 dagen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL zwarte microcentrifugebuisje</td><td>Argos Technologies&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>Deze kan worden vervangen door een 1,5 mL buisje met een neutrale kleur, bedekt met aluminiumfolie</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Molecular Probe</td><td>C1430</td><td>Voor het labelen van levensvatbare cellen</td></tr><tr><td>CCD</td><td>PCO. Imaging</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>Celmembraan doordringbare oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0,5% Triton X-100 voor het doordringen van de celmembraan</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Kleurstof voor celkern</td></tr><tr><td>Dialyse membraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Molecuulgewicht afsnijding = 14.000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gelsterkte 300, type A, uit varkenshuid</td></tr><tr><td>Elektronische corona generator met hoge frequentie</td><td>Electro-technic products</td><td>MODEL BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylzuuranhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Microspruit</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>50 μL&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inclusief twee filtersets: LF405/LP-B-000 en LF488/LP-C-000 van Semrock</td></tr><tr><td>Oxygenplasmamachine</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Voor het fixeren van cellen</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>Mengsel voor het fabriceren van PDMS-chip-afgietsel</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>penicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>Foto-initiator</td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Voor het labelen van dode cellen</td></tr><tr><td>Steriele filtratiecup</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Voor hydrogel immobilisatie</td></tr><tr><td>Ultrasone apparatuur</td><td>Delta</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>UV-licht</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>Vriesdroger</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3(fibroblast)</td><td>Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)</td><td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini Automatische Cell Counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

kleurovergang stam chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen hydrogel

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Kunstmatige begeleiding voor cellulaire uitlijning is een hot topic op het gebied van weefselengineering. Allermeest naar de vorige onderzoek heeft één stam-geïnduceerde cellulaire uitlijning op een cel-beladen hydrogel onderzocht met behulp van complexe experimentele processen en massale controle systemen, die meestal geassocieerd met besmetting kwesties. Dus, in dit artikel stellen wij een simpele aanpak aan de opbouw van een kleurovergang statische belasting met behulp van een fluidic chip met een plastic PDMS cover en een UV transparant glas substraat voor de stimulatie van cellulaire gedrag in een 3D hydrogel. Overbelading foto-patternable cel prepolymeren in het fluidic kamer kunt genereren een convex gebogen PDMS membraan op de cover. Na UV crosslinking, via een concentrische circulaire micropattern onder de gebogen PDMS membraan, en buffer wassen, een communicatie voor behandelende cel gedrag onder een verscheidenheid van kleurovergang stammen is zelf gevestigd in één fluidic chip, zonder externe instrumenten. NIH3T3 cellen werden aangetoond na het observeren van de verandering in de trend van de cellulaire uitlijning onder begeleiding van de meetkunde, in samenwerking met de stimulatie van de stam, die van 15-65% op hydrogels variëren. Na een 3-daagse incubatie domineerde de hydrogel geometrie de celuitlijning onder lage druksterkte stam, waar cellen uitgelijnd langs de hydrogel rek richting onder hoge druksterkte stam. Tussen deze toonden de cellen willekeurige uitlijning als gevolg van de afbraak van de radicale begeleiding van hydrogel rek en de richtsnoeren van de geometrie van de patroon hydrogel.

Om te vergelijken de mechanische variaties tussen elke circulaire hydrogel in de voltooide kleurovergang stam stimulatie-chip, we gemeten de breedte van de lijn van elke ronde hydrogel in twee van de dezelfde chips, met injectie hoeveelheid 0 µL (figuur 4a) en 40 µL (figuur 4b), respectievelijk. Het percentage versnellingen op elke cirkel werden berekend door de versnellingen in de 40 µL-geïnjecteerd chip door de breedte van de l...

Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Het algemene doel van deze gradiëntspanningschip is om een eenvoudige aanpak te bieden om niet-continue gradiëntstatische spanningen op een 3D-hydrogel te genereren voor de onderzoek naar celgedrag onder verschillende spanningscondities. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het bio-engineeringveld te beantwoorden, zoals de stimulatie van stamceldifferentiatie en de regulering van cellulaire uitlijning voor de ontwikkeling van kunstmatig weefselorgaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat verschillende spanningen op de cel- en hydrogellagen in dezelfde micro-omgeving kunnen worden toegepast voor vergelijking van celgedrag.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de voorbereidingsstappen van de chip moeilijk te leren zijn, aangezien het licht drie tot vier uur volledig moet zijn voor de basis van het experiment om hoge celvariabiliteit te garanderen. Weeg 10 gram gelatinepoeder en voeg het toe aan een glazen kolf met 100 milliliter Dulbecco's fosfaat-gebufferd zoutoplossing of DPBS. Plaats een magnetische roerder in de kolf en plaats de kolf op een roerende hotplate.Bedek de kolf met aluminiumfolie om waterverdamping te voorkomen. Stel de hotplate-temperatuur in op 50 tot 60 graden en de roerder op 100 RPM gedurende één uur om het gelatinepoeder op te lossen. Nadat het gelatine is opgelost, voegt u heel langzaam acht milliliter methacrylzuuranhydride toe met behulp van een pipette.Laat het drie uur reageren bij 60 graden Celsius. Voeg vervolgens voorverwarmde DPBS toe aan de kolf tot een eindvolume van 500 milliliter. Laat de oplossing 15 minuten goed mengen om de reactie te stoppen.Snijd ondertussen een dialysemembraan in verschillende buizen van 25 millimeter lang. Dompel ze 15 minuten onder in gedeïoniseerd water. En maak een knoop om een van de uiteinden van de dialysebuizen te sluiten.Laad de juiste hoeveelheid polymeeroplossing in de dialysebuizen en sluit het andere uiteinde. Plaats vervolgens de gevulde buizen in een plastic beker van vijf liter met gedeïoniseerd water gedurende een week. Ververs het gedeïoniseerd water twee keer per dag en houd de oplossing gedurende het dialyseproces op 40 tot 50 graden Celsius.Na de dialyse verzamel de oplossing uit de buizen in een glazen fles van 500 milliliter. Giet ongeveer 450 tot 500 milliliter oplossing in een 500 milliliter filterbeker. En breng een vacuüm aan om de oplossing door het filtermembraan te forceren voor sterilisatie.Breng vervolgens de gesteriliseerde polymeer in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 milliliter. Breng de gesteriliseerde polymeer over in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 milliliter en bewaar ze in een vriezer van min 80 graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen. Vries droog het polymeer van min 80 graden Celsius gedurende een week met behulp van een vriesdroger om GelMA te vormen, die vervolgens in een vriezer van min 80 graden Celsius kan worden bewaard.Voor de chipfabricage bereidt u eerst het polymethacrylaat of PMMA voor, gespeeld en gevormd zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid vervolgens de PTMS-deksel en de PTMS-stop aan door 30 gram PTMS-elastomeer en drie gram PTMS-hardingsmiddel goed te mengen. Ontgast het mengsel gedurende één uur onder een vacuümkamer.Giet 1,8 tot twee gram van het mengsel in de PMMA-vorm voor de PTMS-deksel. Gebruik ook de juiste hoeveelheid om elke holte voor de PMMA-vorm voor de PTMS-stop te vullen. Giet bovendien 10 gram ongehard PTMS-mengsel in een blanco plastic plaat van 10 centimeter.Plaats deze mallen in een vacuümkamer om gedurende 30 minuten te ontgasten. Genees de PTMS gedurende twee uur bij 80 graden Celsius. Nadat de genezen PTMS op de mal is afgekoeld, verwijdert u de PTMS-deksels en de PTMS-stops van de PMMA-mallen.Boor vervolgens twee gaten met diameters van ongeveer drie millimeter aan de uiteinden van de stroomkanalen van de PTMS-deksels. Snijd het PTMS-blad, gegoten uit de plastic plaat van 10 centimeter, in vele blokjes van één centimeter bij één centimeter. En boort een gat van drie millimeter in elk PTMS-blok.Lijm twee ongeharde PTMS-blokken van één centimeter bij één centimeter op de openingen van het PTMS-deksel om als mediumreservoirs te dienen en om te helpen bij het uithardingsproces van de gradiëntcirkelvormige hydrogelpatronen. Genees vervolgens gedurende één uur bij 80 graden Celsius. Lijm vervolgens de PTMS-deksels met de twee PTMS-reservoirs op een TMSPMA-gecoate dia.Om dit te doen, behandel de bindingszijde van het PTMS-deksel en de TMSPMA-gecoate dia onder een zuurstofplasmamachine gedurende 90 seconden met zuurstofplasmabehandeling. Breng het plasmabehandelde oppervlak van de PTMS-deksels en de TMSPMA-dia in contact en druk ze dicht op elkaar voor permanente binding door de vorming van de siliciumzuursiliciumbinding. Druk een fotomasker af door de vastgestelde lay-out op een transparante film af te drukken.Snijd vervolgens de gedrukte fotomasker in grootte van 25 millimeter bij 37,5 millimeter. Weeg 25 milligram gevriesdroogd GelMA in 0,3 milliliter voorverwarmd celkweekmedium in een zwarte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Plaats de microcentrifugebuis op een laboratoriumroerder hotplate tot het GelMA in het medium is opgelost.Voeg 50 milligram foto-initiator toe aan één milliliter DPBS in een microcentrifugebuis. Plaats het in een oven van 80 graden Celsius gedurende 15 minuten of totdat de foto-initiator is opgelost. Voeg 25 microliter van de 10% foto-initiator toe aan de microcentrifugebuis.Pipetteer meerdere keren om goed te mengen. Tel vervolgens drie miljoen NIH3T3-cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. Na centrifugatie van de suspensie bij 200 Gs gedurende vijf minuten, gooit u de supernatant weg en hersuspendeert u de cellen in 175 microliter celkweekmedium.Voeg

gradient-strain-chip-for-stimulating-cellular-behaviors-cell-laden

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de microfabricage van de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat dat kan genereren ruimtelijke en temporele gradiënten in goed gedefinieerde micro-omgeving. In deze benadering kan de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat worden gebruikt om gerichte celmigratie, embryogenese, wondgenezing, en kanker metastase te bestuderen.

Een Gradient-genererende Microfluïdische Device for Cell Biology

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeistofcomponenten bieden een in vitro platform voor celstudies die het in vivo micro-milieu nabootsen. We ontwikkelden op polymethylmethacrylaat gebaseerde microfluïdische chips voor het bestuderen van cellulaire reacties onder enkele of naast elkaar bestaande chemische/elektrische/schuifspanningsstimuli.

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

We beschrijven de isolatie van neonatale cardiomyocyten en de voorbereiding van de cellen voor inkapseling in fibrine hydrogel constructen voor tissue engineering. We beschrijven methoden voor het analyseren van de weefselmanipulatieproducten myocard na de cultuur periode met inbegrip van actieve kracht die op elektrische stimulatie en levensvatbaarheid van de cellen en immunohistologische vlekken.

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Leer een eenvoudige methode om niet-continue gradiëntstatische spanningen toe te passen op cel-beladen hydrogels voor het bestuderen van celuitlijning in weefselengineering.

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Meer video's verkennen