HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie
July 9th, 2016
In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren te injecteren in de muis frontale cortex gedragsproblemen assays die GPCR heteromere vorming nodig te testen.
Het algemene doel van deze methode is om te observeren hoe door virus gemedieerde genoverdracht gedragsfenotypes beïnvloedt die heterodimerisatie van G-proteïnegekoppelde receptoren vereisen in muismodellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van neuro- en psychofarmacologie te beantwoorden. Specifiek hoe G-proteïnegekoppelde receptoren op moleculair niveau met elkaar interageren.
Door deze methode te gebruiken, kunnen we begrijpen hoe deze interactie het gedrag beïnvloedt in modellen van psychiatrische stoornissen, zoals schizofrenie en depressie. Met behulp van deze methode gaan we specifiek naar seratonine 2a en metabotropische glutamaatreceptor 2 kijken, die beide zijn aangetoond als betrokken bij het werkingsmechanisme van geneesmiddelen die worden gebruikt om patiënten met schizofrenie te behandelen. Begin door de muis volgens goedgekeurde methoden goed te verdoven.
Zorg ervoor dat een chirurgische verdovingsdiepte is verkregen door een teenprikken uit te voeren en de afwezigheid van een reactie te noteren. Breng vervolgens ooggel aan om de ogen te beschermen. Bevestig de muis aan het stereotactische frame en zorg ervoor dat de hoek van het hoofd wordt aangepast zodat de schedel vlak en horizontaal is.
Breng povidonjodium aan op de blootgestelde hoofdhuid. Maak met een scalpel een sagittale insnijding langs de middenlijn van de schedel in het blootgestelde, geschoren gebied. Bevestig vervolgens pureit-klemmen op de huid op de plaats van de insnijding om ervoor te zorgen dat de schedel bloot blijft.
Breng waterstofperoxide aan om het periost op te lossen en de hechtingen van de schedel bloot te leggen. Nu de bregma en hechtingen zichtbaar zijn, zorg ervoor dat het stereotactische frame wordt aangepast om ervoor te zorgen dat de schedel horizontaal is. Lijn de naaldpunta van de spuiten uit met bregma en noteer de coördinaten van bregma.
Om de frontale cortex bilateraal te injecteren, voegt u 1,6 mm toe aan de geregistreerde rostrale caudale bregma-coördinaat en 2,6 mm aan de geregistreerde mediale laterale bregma-coördinaat. Markeer de injectieplaatsen op de schedel en boor vervolgens kleine gaatjes op de injectieplaatsen. Veeg met een wattenstaafje eventueel overtollig bloed of botfragmenten weg.
Breng de naald naar het oppervlak van de hersenen en laat hem zakken tot de diepte van de dorsale ventrale coördinaat. Injecteer vervolgens langzaam de inhoud van de spuit door de zuiger van de naald te draaien om 0,1 microliter per minuut gedurende vijf minuten te bereiken, voor een injectie van 0,5 microliter. Laat de spuit vijf minuten op zijn plaats blijven.
Na de toegewezen tijd, verwijdert u het dier uit de stereotaxie, sluit de insnijding en plaats het op een verwarmingspad. Dien postoperatieve pijnstilling toe volgens uw goedgekeurde dierprotocol. Voer gedragstests uit twee tot drie dagen na stereotactische injectie van virale deeltjes.
Laat de muizen zich ten minste vier uur lang aan de ruimte wennen voordat het experiment begint. Begin door DOI op te lossen in een 0,9 procent zoutoplossing tot twee milligram per kilogram. Bereid een thuiscas aan zonder beddengoed en pas een statief aan om een camera zodanig te plaatsen dat deze direct boven de thuiscas hangt.
Kalibreer de camera zodat de hele thuiscas in het gezichtsveld staat. Weeg de muis en injecteer intraperitoneaal met de juiste dosis van 0,9 procent zoutoplossing of DOI. Plaats de muis weer tien minuten in de thuiscas.
Na tien minuten plaatst u de muis in het midden van de lege thuiscas en zorgt u ervoor dat er geen blinde vlakken in het gezichtsveld van de camera zijn. Druk op opnemen op de camcorder en verlaat de kamer. Stop na 30 minuten de opname en plaats de muis terug in de oorspronkelijke thuiscas.
Herhaal het gedragstest bij de volgende muis. Laat de scheidsrechter de video's beoordelen zonder kennis van de experimentele omstandigheden. Noteer handmatig elke hoofdbeweging gedurende de video.
Een hoofdbeweging wordt gedefinieerd als een snelle schudbeweging van het hoofd uitgevoerd door een muis. Verwerk de gegevens zoals beschreven in het schriftelijke deel van het protocol. Hier is een representatief beeld van HSV-gemedieerde transgenexpressie in de frontale cortex.
HSV mGlu2 GFP werd geïnjecteerd in de frontale cortex en GFP-expressie werd onthuld door immunocytochemie. Deze schaalbalk vertegenwoordigt 200 micrometer. Dit beeld toont een western blot van HSV-gemedieerde transgenexpressie en anti-mGlu2-reactiviteit in de frontale cortex van mGlu2 knockout muizen.
Hier hebben we de immunoreactiviteit van mGlu2 gemeten als een monomeer. Dit histogram laat zien dat virale gemedieerde expressie van mGlu2, maar niet van chimerische mGlu2 in de frontale cortex van mGlu2 knockout muizen, de door de hallucinogene seratonine 2a-receptoragonist DOI geïnduceerde hoofdbewegingsreactie aanzienlijk redt. De meest kritische stappen in dit experiment zijn het tijdstip tussen de virale injecties, de hoofdbewegingsreactie en wanneer de muizen worden geofferd.
Elke vertraging kan de resultaten van het experiment veranderen of dubbelzinnigheid in de gegevens introduceren. Eenmaal onder de knie, duurt de muizenchirurgie ongeveer 30 minuten om het virus te injecteren. Het hoofdbewegingsexperiment zou ook ongeveer 35 minuten per muis moeten duren.
Het is raadzaam om operaties te verspreiden of op meer dan één muis tegelijk te opereren. Op deze manier kan men een tijdlijn handhaven die het mogelijk maakt om de hoofdbewegingsexperimenten in de drie tot vier dagen na de operatie uit te voeren, wat de piekexpressietijd van de virale construct is. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het injecteren van virale vectoren in de frontale cortex van muizen om gedragsonderzoeken te bestuderen die gerelateerd zijn aan heteromere vorming van GPCR's. De aanpak is gericht op het verduidelijken van de moleculaire interacties van G-eiwit gekoppelde receptoren en hun invloed op gedrag in psychiatrische modellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Farmacologie
- Gedragswetenschap
Achtergrond
- G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) spelen een cruciale rol in neurotransmissie.
- Begrip van GPCR-interacties kan inzicht geven in psychiatrische stoornissen.
- Heterodimerisatie van GPCR's kan gedragsresultaten beïnvloeden.
- Deze methode maakt gebruik van virale vectoren voor genoverdracht in muismodellen.
Doel van de studie
- Om de effecten van door virus gemedieerde genoverdracht op gedragsfenotypen te onderzoeken.
- Om de interactie tussen serotonine 2A en metabotropische glutamaatreceptor 2 te verkennen.
- Om vragen in neuro- en psychofarmacologie aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Correcte anesthesie van muizen volgens goedgekeurde methoden.
- Injectie van virale vectoren in de frontale cortex.
- Gedragsonderzoeken om de invloed van GPCR-interacties te beoordelen.
- Analyse van gedragsfenotypen gerelateerd aan psychiatrische stoornissen.
Belangrijkste resultaten
- Inzichten in heteromere vorming van GPCR's en de gedragsimplicaties ervan.
- Begrip van de rol van serotonine 2A en metabotropische glutamaatreceptor 2.
- Mogelijke verbanden tussen GPCR-interacties en psychiatrische aandoeningen.
- Bijdraging aan het veld van neurofarmacologie door middel van experimentele bevindingen.
Conclusies
- De methode biedt een kader voor het bestuderen van GPCR-interacties in vivo.
- Bevindingen kunnen therapeutische strategieën voor psychiatrische stoornissen informeren.
- Er is verder onderzoek nodig om de implicaties van deze interacties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
