Name: HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer hoe HSV-gemedieerde transgenexpressie van chimere constructen het gedrag van GPCR-heteromeren in muizen bestudeert. Deze methode onthult de rol van 5-HT2A-mGlu2-complexen in hallucinogeen-geïnduceerde reacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R01MH084894 deel aan de financiering van deze studie. We danken Drs. Yasmin Hurd en Scott Russo op Mount Sinai School of Medicine voor de donatie van muizen en het gebruik van hun operatie en het gedrag faciliteiten tijdens het filmen van dit werk.

LET OP: Alle procedures voor het fokken van dieren en zorgen werden uitgevoerd volgens de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) regulering van Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. Zorg ervoor dat u steriele handschoenen te gebruiken tijdens de gehele procedure. 1. Drug en Virus Voorbereiding <ol><li> drug Voorbereiding <ol><li> Bereid 15,0 ml ketamine / xylazine anesthesie door het oplossen van 1,35 ml 100 mg / ml Ketamine en 0,75 ml 20 mg / ml xylazine in 12,9 ml 0,9% zoutoplossing. Meng oplossing. </li></ol></li><li> viruspreparaat <ol><li> Kloon de mGlu2 en mGlu2ΔTM4N constructen in een bicistronische herpes simplex virus (HSV) vector volgende standaardprotocollen eerder beschreven 6. Verpak de virale deeltjes zoals hiervoor beschreven 6,13,14. Substitutie van residuen Ala-677 4.40, Ala-681 4.44 en 4.48 Ala685 in mGlu2 voor Ser686 4,40, PhE690 4,44 en Gly-694 4,48 in mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) zijn eerder beschreven 6. Opmerking: Het is eerder aangetoond dat het chimere construct HA-mGlu2ΔTM4N is vastgesteld op het plasmamembraan met intacte G-eiwit-afhankelijke signalering 6. </li><li> WINKEL virale vectoren -80 ° C wanneer niet in gebruik. Dooi virale vector op ijs, en vervolgens aliquot in 10 ul porties. Voor de chirurgische procedure op ijs bewaren. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> chirurgie voorbereiding <ol><li> Weeg muis en injecteer de muis met de juiste dosis van ketamine / xylazine cocktail (voor details, zie punt 1.1.1). </li><li> Controleer de muis om te zien of de juiste verdoofd, knijp voet en de staart van pijn reactie, als niet in staat om een ​​reactie uit te lokken, is de muis goed verdoofd. </li><li> Scheren muis hoofd van de basis van de schedel tot aan de punt van de neus met behulp van clippers. Toepassen oftalmische gel om de muis afterward blindheid van de muis voorkomen. </li><li> Laad elke spuit op het stereotactische frame. tilt dan loodrechte gedeelte van elke arm van de stereotaxisch frame zodat ze 10 graden van de normaal. Zorgen dat de armen gekanteld, zodanig dat de naalden tegenover elkaar. </li><li> Reinig elke spuit door het vullen van de naald met 70% ethanol. Vul de naald ten minste driemaal zodat de injectiespuit schoon. </li><li> Zodra de naald is schoongemaakt, spoelt de naald door het vullen van de naald met dubbel gedestilleerd H 2 O. Eenmaal gespoeld, vul elke naald met 1,3 pi dubbel gedistilleerd H 2 O. Draai de plunjer van de spuit om 0,3 ui dubbel gedestilleerd H2O vrijgeven Als water kralen op het puntje van de naald, veeg water weg. Als er niets komt uit de spuit, duw de zuiger helemaal naar beneden en herhaal het schoonmaken van de spuit. </li><li> Na het vullen met water, dan trek de spuit vullen van de spuit met0,5 ul van de lucht. </li><li> Zodra de lucht en water zijn in de spuit voorzichtig de spuit te vullen met 1,3 ul van het virus oplossing. Op dit punt ervoor te zorgen dat het totale volume in de spuit 2,8 pi. Gaan krullen de punt van de spuit 0,3 pi virus vrij. Als er vloeistof kralen aan de punt van de naald voorzichtig weg te vegen vloeistof. Als er niets komt uit de spuit, duw de zuiger helemaal naar beneden en herhaal het schoonmaken van de spuit. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Maak de muis om de stereotaxische frame, en zorg ervoor dat de stereotaxische kader aan te passen, zodat de schedel is vlak en waterpas. Toepassen povodine jodium blootgestelde hoofdhuid. Met behulp van een scalpel, maak een sagittale incisie langs de middellijn van de schedel binnen het blootgestelde geschoren gebied. Bevestig vervolgens de Buret klemmen om de huid op de incisie site om ervoor te zorgen dat de schedel blijft blootgesteld. </li><li> Gebruik H 2 O 2 om weg te ontbinden het beenvlies aan de hechtingen van het blootstellenschedel. Nu de bregma en hechtingen zichtbaar zijn, moet u de stereotaxische kader aangepast om ervoor te zorgen dat de schedel niveau. </li><li> Lijn de naaldpunten van de spuiten met de bregma en de coördinaten van de bregma nemen. Bereken de coördinaten waar de naalden zullen worden ingevoegd. <ol><li> Voor de Rostral-Cauldal (RC) vlak, voeg 1,6 mm om de opgenomen RC bregma coördinaten (1,6 van Bregma). Voor de dorsale-ventrale (DV) vlak aftrekken 2,4 mm uit de opgenomen DV bregma coördinaten (-2,4 van Bregma). </li><li> Tot slot, voor de mediale laterale (ML) vlak, voeg 2,6 mm om de opgenomen ML bregma coördinaten (2,6 van Bregma). Voor alle coördinaten zeker zowel links als rechts coördinaten nemen, aangezien dit een bilaterale injectie. </li></ol></li><li> Breng de naald op de gewenste coördinaten. Markeer de plaatsen waar de naalden zullen worden ingebracht en met een boor, boor de gemarkeerde gebieden. </li><li> Met een wattenstaafje applicator wipe weg overtollige bloed of bot fragment. </li><li> Breng de naalden aan de schedel waar de uiteinden van de naalden het oppervlak van de hersenen raken. Laat dan de naalden naar de gewenste coördinaten te langzaam verlaagd. </li><li> Zodra de naalden in de gewenste coördinaten injecteer langzaam de inhoud van de spuit door het verdraaien van de zuiger van de naald 0,1 gl per minuut in de loop van 5 min (in totaal 0,5 ui). </li><li> Zodra de injectie heeft plaatsgevonden laat de spuit in cortex nog eens 5 min. </li></ol></li><li> Closing Up / Verzorging <ol><li> Verwijder de naalden uit de muis cortex gelijkmatig en langzaam. Verwijder vervolgens de muis uit de stereotaxische frame. </li><li> Solliciteer cyanoacrylaat (dermal lijm) aan de basis flappen van de huid van de incisie en vervolgens met een pincet grijpen de kleppen van de huid en leg ze samen. </li><li> Laat de cyanoacrylaat drogen. Plaats de muis in de kooi meer dan een verwarmingselement (verwarmingselement is facultatief indien de surgical suite wordt gehouden in het kader van RT van 37 ° C - anders niet nodig). Zorg ervoor dat de muis te plaatsen op een papieren handdoek om ervoor te zorgen dat beddengoed niet houden aan chirurgische plaats. </li><li> Afhankelijk van de lengte van de chirurgische procedure op dat de muizen van anesthesie binnen 30 - 60 minuten na behandeling. Na de operatie wordt het dier geplaatst in zijn eigen kooi en gevolgd totdat het bewuste alvorens terug te keren naar de kamer te herstellen wordt. Nr analgetica gebruikt postoperatief, omdat de resultaten van onze experimenten kan wijzigen door het wijzigen van enkele van de hersenen biochemische routes. Echter, worden de dieren gecontroleerd tot ze herstellen van narcose op de dag van de operatie, en dagelijks na de operatie op tekenen van infectie en evaluatie van pijn / distress. </li></ol></li></ol> 3. Head Twitch Response Experiment <ol><li> Opstelling <ol><li> Voer alle gedrags-testen 10:00-14:00, 2-3 dagen na stereotaCTIC injectie van virale deeltjes. </li><li> Te (±) -1- (2,5-dimethoxy-4-joodfenyl) -2-aminopropaan hydrochloride (DOI) in een 0,9% zoutoplossing tot 2,0 mg / kg. Ook bereiden een 0,9% zoutoplossing. </li><li> Bereid een kooi (28 x 18 x 15 cm) zonder beddengoed en het gebruik van een tri-pod, stel een camera, zodat het zicht van de videocamera is direct boven de kooi. </li><li> Wennen de muizen om de kamer ten minste 4 uur voor het begin van het experiment. </li><li> Het opzetten van een camcorder op het hoofd twitch opnemen. </li></ol></li><li> Experiment <ol><li> Plaats de camera, zodat het direct boven een kooi. Kalibreer de camera zodat de gehele kooi in het gezichtsveld. </li><li> Weeg muis en injecteer muis intraperitoneaal met geschikte dosis van ofwel 0,9% zoutoplossing of DOI (0,01 ml / g). Opmerking: Als een muis weegt 25 gram, dienen dosis tot een totaal volume van 0,25 ml. </li><li> Plaats elke muis terug in hun eigen kooi for 10 min. Na 10 min, plaats muis in het midden van de lege kooi en valideren dat er geen dode hoeken in het gezichtsveld van de camera. Druk op record op de camcorder. Verlaat de kamer. LET OP: de muis bewegingen en verschillende gedragsreacties daarin (... Hoofd trillen, oor scratch, etc Raadpleeg aanvullende gegevens tabel 1 van Gonzalez-Maeso et al 2007 voor de volledige lijst van gedragsreacties veroorzaakt door DOI) 3, zal worden opgenomen voor 30 minuten. Daarom is het belangrijk dat er geen dode hoeken in het gezichtsveld opgenomen. </li><li> Na 30 min stoppen met opnemen op de camcorder en plaats de muis terug in de oorspronkelijke huis kooi. Herhaal dit proces voor elke muis. </li></ol></li><li> recensie <ol><li> Laat elke scheidsrechter beoordeling van de tapes te verblinden voor de experimentele omstandigheden van de muis (bijv., Drugs gebruikt tijdens het hoofd twitch experiment of virus gebruikt tijdens intracraniële injectie)). Handmatig op te nemen elk hoofd twitch throughout van de video. OPMERKING: Head-kramp wordt gedefinieerd als een snelle schudden hoofdbewegingen uitgevoerd door een muis (aanvullende video). </li><li> Voor elke muis, het gemiddelde van de laatste HTR reactie van de drie totalen van de blinde scheidsrechters. Toen de groep deze waarden door de experimentele conditie en het uitvoeren van statistische analyses (bijv., T-test of ANOVA). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fribourg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+Signaling+of+a+GPCR+Heteromeric+Complex+Reveals+a+Unifying+Mechanism+of+Action+of+Antipsychotic+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs.</a> Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+serotonin%2Fglutamate+receptor+complex+implicated+in+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis.</a> Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+Recruit+Specific+Cortical+5-HT%282A%29+Receptor-Mediated+Signaling+Pathways+to+Affect+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens Recruit Specific Cortical 5-HT(2A) Receptor-Mediated Signaling Pathways to Affect Behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+fingerprints+distinguish+hallucinogenic+and+nonhallucinogenic+5-hydroxytryptamine+2A+receptor+agonist+effects+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome fingerprints distinguish hallucinogenic and nonhallucinogenic 5-hydroxytryptamine 2A receptor agonist effects in mouse somatosensory cortex.</a> J Neurosci. 23 (26), 8836-8843 (2003).</li>
<li>Moreno, J. L., Holloway, T., Albizu, L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+mGlu2+receptor+is+necessary+for+the+pharmacological+and+behavioral+effects+induced+by+hallucinogenic+5-HT2A+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate mGlu2 receptor is necessary for the pharmacological and behavioral effects induced by hallucinogenic 5-HT2A receptor agonists.</a> Neurosci Lett. 493 (3), 76-79 (2011).</li>
<li>Moreno, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Three+Residues+Essential+for+5-HT2A-mGlu2+Receptor+Heteromerization+and+its+Psychoactive+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Three Residues Essential for 5-HT2A-mGlu2 Receptor Heteromerization and its Psychoactive Behavioral Function.</a> J Biol Chem. 287, 44301-44319 (2012).</li>
<li>Geyer, M. A., Vollenweider, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+research%3A+contributions+to+understanding+psychoses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin research: contributions to understanding psychoses.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (9), 445-453 (2008).</li>
<li>Nichols, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens.</a> Pharmacol Ther. 101 (2), 131-181 (2004).</li>
<li>Hanks, J. B., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+serotonergic+psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of serotonergic psychedelics.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (1), 33-42 (2013).</li>
<li>Fiorella, D., Rabin, R. A., Winter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+the+stimulus+effects+of+hallucinogenic+drugs.+II%3A+Reassessment+of+LSD+false+positives%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Role of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in the stimulus effects of hallucinogenic drugs. II: Reassessment of LSD false positives.</a> Psychopharmacology (Berl). 121 (3), 357-363 (1995).</li>
<li>Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., Hell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin+induces+schizophrenia-like+psychosis+in+humans+via+a+serotonin-2+agonist+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action.</a> Neuroreport. 9 (17), 3897-3902 (1998).</li>
<li>Moreno, J. L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptors+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (23), 3777-3785 (2009).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC2+regulates+atypical+antipsychotic+responses+through+the+modulation+of+mGlu2+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity.</a> Nat Neurosci. 15 (9), 1245-1254 (2012).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressive+Epigenetic+Changes+at+the+mGlu2+Promoter+in+Frontal+Cortex+of+5-HT2A+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Repressive Epigenetic Changes at the mGlu2 Promoter in Frontal Cortex of 5-HT2A Knockout Mice.</a> Mol Pharmacol. 83 (6), 1166-1175 (2013).</li>
<li>Rives, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+GABAB+and+mGlu1a+receptors+reveals+new+insight+into+GPCR+signal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between GABAB and mGlu1a receptors reveals new insight into GPCR signal integration.</a> Embo J. 28 (15), 2195-2208 (2009).</li>
<li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence%2C+Maintenance+and+Relevance+of+GPCR+Oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Prevalence, Maintenance and Relevance of GPCR Oligomerization.</a> Mol Pharmacol. (84), Epub ahead of print 158-169 (2013).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacol Rev. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomers+in+pharmacology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomers in pharmacology and signaling.</a> Mol Brain. 4 (1), 20(2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+a+GPCR+heteromers+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Family a GPCR heteromers in animal models.</a> Front Pharmacol. 5, 226(2014).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 12060-12065 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Fonseca, J. M., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+a+class+a+G+protein-coupled+receptor+oligomer+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Instability of a class a G protein-coupled receptor oligomer interface.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1296-1299 (2009).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2693-2698 (2010).</li>
<li>Hlavackova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+inter-+and+intrasubunit+rearrangements+during+activation+of+dimeric+metabotropic+glutamate+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Sequential inter- and intrasubunit rearrangements during activation of dimeric metabotropic glutamate receptor 1.</a> Sci Signal. 5 (237), 59(2012).</li>
<li>Irannejad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+biosensors+reveal+GPCR+signalling+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes.</a> Nature. 495 (7442), 534-538 (2013).</li>
<li>Calebiro, D., Nikolaev, V. O., Persani, L., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+internalized+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling by internalized G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (5), 221-228 (2010).</li>
<li>Celada, P., Puig, M. V., Diaz-Mataix, L., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallucinogen+DOI+reduces+low-frequency+oscillations+in+rat+prefrontal+cortex%3A+reversal+by+antipsychotic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The hallucinogen DOI reduces low-frequency oscillations in rat prefrontal cortex: reversal by antipsychotic drugs.</a> Biol Psychiatry. 64 (5), 392-400 (2008).</li>
<li>Béïque, J. -C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (23), 9870-9875 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Overzicht van eerdere bevindingen in mGlu2-KO muizen 5, de resultaten mGlu2 en mGlu2 / mGlu3 chimere constructen die de 5-HT2A -mGlu2 receptorcomplex in gekweekte cellen vormen suggereren dat de 5-HT2A -mGlu2 heteromere receptorcomplex muis frontale cortex is nodig om het hoofd-twitch gedrag te induceren door LSD-achtige hallucinogene 5-HT 2A receptor agonisten. Een beperking van deze methode is dat het niet dicht moleculaire omgeving heeft gemeten op een subcellulair niveau n...

Hallucinogenen zoals LSD, psilocybine en mescaline leiden tot significante veranderingen in het menselijk bewustzijn, cognitie en emotie 7-9. Inactivering van serotonine 5-HT2A receptor signalering door hetzij genetische of farmacologische benaderingen veroorzaakt aanzienlijk verzwakt gedragsreacties hallucinogenen zowel diermodellen 3,10 en 11 mens. Hoewel hallucinogenen binden andere receptorsubtypen 8, wordt de 5-HT2A receptor geacht voor de unieke gedragsactiviteit van deze stoffen. Groep II metabotrope glutamaatreceptoren (bijv., MGlu2 en mGlu3) hebben het doelwit van veel aandacht met betrekking tot de moleculaire mechanisme van hallucinogenen en hun integrale rol onderliggende psychose 12 geweest. Eerder is aangetoond dat muizen zonder expressie van mGlu2 eiwit (mGlu2-KO muizen) ongevoelig zijn voor de cellulaire en gedragseffecten van hallucinogens 5. Ook is gesuggereerd dat het 5-HT2A en mGlu2 receptoren vormen een specifiek heteromeer complex waardoor serotonine en glutamaat liganden moduleren het patroon van G-eiwit koppelen in levende cellen 1,2. Structureel, transmembraan (TM) domeinen 4 en 5 van mGlu2 speelt een fundamentele rol in heteromerische formatie met de 5-HT 2A receptor 5. Bovendien, verder onderzoek aangetoond dat drie residuen die aan het intracellulaire eind TM4 van mGlu2 noodzakelijk om de 5-HT2A receptor -mGlu2 heterocomplex in levende cellen 6 vormen. Op basis van deze bevindingen waargenomen bij heterologe expressiesystemen Hier beschrijven we het gebruik van HSV-gemedieerde expressie van wildtype mGlu2 en mGlu2 / mGlu3 chimere constructen in de frontale cortex van mGlu2-KO muizen te testen of heteromere vorming tussen 5-HT2A mGlu2 en is nodig voor dehead-twitch gedrag geïnduceerd door hallucinogene 5-HT 2A receptor agonisten.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 bicitronisch herpes simplex virus (HSV) vector&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 en mGlu2DTM4N werden gesubcloneerd in de bicitronische HSV-GFP virus vector p1005+ HSV die GFP tot expressie brengt onder controle van de CMV promotor. Virale deeltjes werden geproduceerd door de Viral Core Facility van het McGovern Institute (MIT). Voor meer informatie, neem contact op met de directeur, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta;TM4N bicitronisch herpes simplex virus (HSV) vector&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 en mGlu2DTM4N werden gesubcloneerd in de bicitronische HSV-GFP virus vector p1005+ HSV die GFP tot expressie brengt onder controle van de CMV promotor. Virale deeltjes werden geproduceerd door de Viral Core Facility van het McGovern Institute (MIT). Voor meer informatie, neem contact op met de directeur, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP bicitronisch herpes simplex virus (HSV) vector&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 en mGlu2DTM4N werden gesubcloneerd in de bicitronische HSV-GFP virus vector p1005+ HSV die GFP tot expressie brengt onder controle van de CMV promotor. Virale deeltjes werden geproduceerd door de Viral Core Facility van het McGovern Institute (MIT). Voor meer informatie, neem contact op met de directeur, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Lloyd</td><td>Lijst nr. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10</td><td>1.35 ml van ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml van xylazine (20 mg/ml) worden verdund in 12.0 ml van 0.9% zoutoplossing</td></tr><tr><td>Ketamine&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06</td><td>1.35 ml van ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml van xylazine (20 mg/ml) worden verdund in 12.0 ml van 0.9% zoutoplossing</td></tr><tr><td>Ophthalmisch gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Burret clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Feather chirurgisch mes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; Kleine Hub Verwijderbare Nadelen (33 Ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>Snoerloze Micro Boor</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Dermaal Adhesief</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodofenyl)-2-aminopropaan hydrochloride (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>Opgelost in 0.9% zoutoplossing tot de concentratie van 2.0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

hsv-mediated transgene expressie van chimere constructen tot behavioral functie van gpcr heteromeren in muizen studie

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Het heteromere receptorcomplex tussen 5-HT2A en mGlu2 is betrokken gebleken bij sommige van de gedragsfenotypes in muismodellen van psychose1,2. Bijgevolg vertegenwoordigt het onderzoek naar structurele details van de interactie tussen 5-HT2A en mGlu2 die schizofrenie-gerelateerd gedrag beïnvloedt, een krachtig translationeel hulpmiddel. Zoals eerder is aangetoond, wordt de head-twitch reactie (HTR) bij muizen veroorzaakt door hallucinogeen drugs en dit gedragsreactie ontbreekt in 5-HT2A knockout (KO) muizen3,4. Bovendien werd door het conditioneel tot expressie brengen van de 5-HT2A receptor alleen in de cortex aangetoond dat 5-HT2A receptor-afhankelijke signaalroutes op corticale piramideneuronen voldoende zijn om head-twitch gedrag te veroorzaken in reactie op hallucinogeen drugs3. Ten slotte is aangetoond dat de head-twitch gedragsreactie geïnduceerd door de hallucinogenen DOI en lyserginezuurdiethylamide (LSD) significant verminderd is in mGlu2-KO muizen5. Deze bevindingen suggereren dat mGlu2 ten minste gedeeltelijk noodzakelijk is voor de 5-HT2A receptor-afhankelijke psychose-achtige gedragseffecten geïnduceerd door LSD-achtige drugs. Dit levert echter geen bewijs of het 5-HT2A-mGlu2 receptorcomplex noodzakelijk is voor dit gedragsfenotype. Om deze vraag aan te pakken, werden herpes simplex virus (HSV) constructen gebruikt om het mGlu2 of mGlu2ΔTM4N (mGlu2/mGlu3 chimerische construct dat het 5-HT2A-mGlu2 receptorcomplex niet vormt) in de frontale cortex van mGlu2-KO muizen tot expressie te brengen om te onderzoeken of dit GPCR heteromere complex noodzakelijk is voor de gedragseffecten geïnduceerd door LSD-achtige drugs6.

Eerdere bevindingen tonen aan dat het hoofd-kramp murine gedragsreactie betrouwbaar en robuust opgewekt door hallucinogenen, en het is afwezig bij 5-HT2A -Ko 3 muizen. Verder is aangetoond dat het hoofd-spierrespons opgewekt door hallucinerende 5-HT2A agonisten DOI en LSD significant verlaagd in mGlu2-KO muizen 5. Hoewel eerdere bevindingen overtuigend aangetoond dat 5-HT 2A en mGlu2 geassembleerd als een heteromeer complex in vi...

In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren te injecteren in de muis frontale cortex gedragsproblemen assays die GPCR heteromere vorming nodig te testen.

HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Het algemene doel van deze methode is om te observeren hoe virus-gemedieerde genoverdracht de gedragsfenotypen beïnvloedt die heterodimerisatie van G-eiwitgekoppelde receptoren vereisen in muismodellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de neuro- en psychofarmacologie, specifiek hoe G-eiwitgekoppelde receptoren op moleculair niveau met elkaar interageren.Door deze methode te gebruiken kunnen we begrijpen hoe deze interactie het gedrag beïnvloedt in modellen van psychiatrische stoornissen, zoals schizofrenie en depressie. Met behulp van deze methode zullen we specifiek kijken naar serotonine 2a en de metabotrope glutamaatreceptor 2, waarvan beide betrokken zijn gebleken bij het werkingsmechanisme van geneesmiddelen die worden gebruikt om patiënten met schizofrenie te behandelen. Begin met het correct anesthetiseren van de muis volgens goedgekeurde methoden.Bevestig dat een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt door een knijpprik aan de teen uit te voeren en vast te stellen dat er geen reactie optreedt. Breng vervolgens ooggel aan om de ogen te beschermen. Bevestig de muis in het stereotactische frame, waarbij de kanteling van de kop zorgvuldig wordt ingesteld zodat de schedel waterpas en vlak ligt.Breng povidonjodium aan op de blootgestelde hoofdhuid. Maak met een scalpel een sagittale incisie langs de middenlijn van de schedel binnen het blootgestelde geschoren gebied. Bevestig vervolgens pureit-klemmen aan de huid bij de incisiesite om ervoor te zorgen dat de schedel blootgesteld blijft.Breng waterstofperoxide aan om het periosteum op te lossen en de skullsuturen bloot te leggen. Nu het bregma en de suturen zichtbaar zijn, dient het stereotactisch frame te worden bijgesteld om er zeker van te zijn dat de schedel waterpas staat. Lijn de naaldpunten van de spuiten uit met het bregma en noteer de coördinaten van het bregma.Om de frontale cortex bilateraal te injecteren, voegt u 1,6 mm toe aan de geregistreerde rostrale caudale bregma-coördinaat en 2,6 mm aan de geregistreerde mediale laterale bregma-coördinaat. Markeer de injectieplaatsen op de schedel en boor vervolgens kleine gaatjes op deze posities. Gebruik een wattenstaafje om eventueel overtollig bloed of botfragmenten weg te vegen.Breng de naald naar het oppervlak van de hersenen en zak af naar de diepte van de dorsoventrale coördinaat. Injecteer vervolgens langzaam de inhoud van de spuit door aan de zuiger van de naald te draaien, waarbij 0,1 µL per minuut gedurende vijf minuten wordt toegediend voor een totale injectie van 0,5 µL. Laat de spuit vijf minuten op zijn plaats staan.Verwijder na de vastgestelde tijd het dier uit het stereotaxische frame, sluit de incisie en plaats het dier op een warmtemat. Dien postoperatieve analgesie toe volgens uw goedgekeurde dierprotocol. Voer de gedragstests twee tot drie dagen na de stereotactische injectie van virale lacticles uit.Laat de muizen ten minste vier uur voor aanvang van het experiment wennen aan de ruimte. Begin met het oplossen van DOI in een 0,9 procent zoutoplossing tot een concentratie van twee milligram per kilogram. Richt een thuiskooi in zonder strooisel en stel met behulp van een statief een camera zo in dat deze zich direct boven de thuiskooi bevindt.Kalibreer de camera zodanig dat de volledige thuiskooi zich in het gezichtsveld bevindt. Weeg de muis en injecteer intraperitoneaal de passende dosis van ofwel 0,9 procent zoutoplossing of DOI. Plaats de muis tien minuten lang terug in de thuiskooi.Plaats de muis na tien minuten in het midden van de lege thuiskooi en zorg ervoor dat er geen blinde vlekken zijn in het gezichtsveld van de camera. Start de opname op de camcorder en verlaat de ruimte. Stop na 30 minuten de opname en plaats de muis terug in de oorspronkelijke thuiskooi.Herhaal de gedragstest bij de volgende muis. Laat de scheidsrechter de video's beoordelen zonder kennis van de experimentele condities. Noteer handmatig elke hoofdschok gedurende de gehele video.Een hoofdtrek is gedefinieerd als een snelle schuddende hoofdbeweging uitgevoerd door een muis. Verwerk de gegevens zoals beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol. Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van HSV-gemedieerde transgene expressie in de frontale cortex.HSV mGlu2 GFP werd geïnjecteerd in de frontale cortex en de GFP-expressie werd aangetoond via immunocytochemie. Deze schaalbalk vertegenwoordigt 200 microns. Deze afbeelding toont een western blot van HSV-gemedieerde transgeenexpressie en anti-mGlu2-reactiviteit in de frontale cortex van mGlu2-knockoutmuizen.Hier hebben we de immunoreactiviteit van mGlu2 als monomeer gemeten. Dit histogram laat zien dat virale expressie van mGlu2 in de frontale cortex van mGlu2-knockoutmuizen de head-twitch respons, geïnduceerd door de hallucinogene serotonine 2a-receptoragonist DOI, significant herstelt, terwijl dit niet het geval is bij chimere mGlu2. De meest kritieke stappen bij dit experiment zijn de timing tussen de virale injecties, de head-twitch respons en het moment waarop de muizen worden geofferd.Elke vertraging kan de resultaten van het experiment beïnvloeden of onduidelijkheid in de gegevens veroorzaken. Zodra de procedure onder de knie is, zal de chirurgische ingreep bij de muis ongeveer 30 minuten duren om het virus te injecteren. Het experiment met het hoofdschudden zou per muis ook ongeveer 35 minuten in beslag moeten nemen.Het wordt aanbevolen om de operaties te spreiden, ofwel door op meer dan één muis tegelijk te opereren. Op deze manier kan een tijdlijn worden gehanteerd die toelaat dat de head twitch-experimenten worden uitgevoerd in de drie tot vier dagen na de operatie, wat de periode is van maximale expressie van het virale construct. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

hsv-mediated-transgene-expression-chimeric-constructs-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Het enterische zenuwstelsel wordt gevormd door neurale crestcellen die zich vermenigvuldigen, migreren en het darmkanaal koloniseren. Neurale crestcellen differentiëren zich in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitterfenotype. Dit protocol beschrijft een techniek voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van het muis embryonale gastro-intestinale kanaal om de expressie van enterische zenuwstelsel neurotransmitters te visualiseren.

Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

Leer hoe HSV-gemedieerde transgenexpressie van chimere constructen het gedrag van GPCR-heteromeren in muizen bestudeert. Deze methode onthult de rol van 5-HT2A-mGlu2-complexen in hallucinogeen-geïnduceerde reacties.

HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

Meer video's verkennen