HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

Het algemene doel van deze methode is om te observeren hoe virus-gemedieerde genoverdracht de gedragsfenotypen beïnvloedt die heterodimerisatie van G-eiwitgekoppelde receptoren vereisen in muismodellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de neuro- en psychofarmacologie, specifiek hoe G-eiwitgekoppelde receptoren op moleculair niveau met elkaar interageren.

Door deze methode te gebruiken kunnen we begrijpen hoe deze interactie het gedrag beïnvloedt in modellen van psychiatrische stoornissen, zoals schizofrenie en depressie. Met behulp van deze methode zullen we specifiek kijken naar serotonine 2a en de metabotrope glutamaatreceptor 2, waarvan beide betrokken zijn gebleken bij het werkingsmechanisme van geneesmiddelen die worden gebruikt om patiënten met schizofrenie te behandelen. Begin met het correct anesthetiseren van de muis volgens goedgekeurde methoden.

Bevestig dat een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt door een knijpprik aan de teen uit te voeren en vast te stellen dat er geen reactie optreedt. Breng vervolgens ooggel aan om de ogen te beschermen. Bevestig de muis in het stereotactische frame, waarbij de kanteling van de kop zorgvuldig wordt ingesteld zodat de schedel waterpas en vlak ligt.

Breng povidonjodium aan op de blootgestelde hoofdhuid. Maak met een scalpel een sagittale incisie langs de middenlijn van de schedel binnen het blootgestelde geschoren gebied. Bevestig vervolgens pureit-klemmen aan de huid bij de incisiesite om ervoor te zorgen dat de schedel blootgesteld blijft.

Breng waterstofperoxide aan om het periosteum op te lossen en de skullsuturen bloot te leggen. Nu het bregma en de suturen zichtbaar zijn, dient het stereotactisch frame te worden bijgesteld om er zeker van te zijn dat de schedel waterpas staat. Lijn de naaldpunten van de spuiten uit met het bregma en noteer de coördinaten van het bregma.

Om de frontale cortex bilateraal te injecteren, voegt u 1,6 mm toe aan de geregistreerde rostrale caudale bregma-coördinaat en 2,6 mm aan de geregistreerde mediale laterale bregma-coördinaat. Markeer de injectieplaatsen op de schedel en boor vervolgens kleine gaatjes op deze posities. Gebruik een wattenstaafje om eventueel overtollig bloed of botfragmenten weg te vegen.

Breng de naald naar het oppervlak van de hersenen en zak af naar de diepte van de dorsoventrale coördinaat. Injecteer vervolgens langzaam de inhoud van de spuit door aan de zuiger van de naald te draaien, waarbij 0,1 µL per minuut gedurende vijf minuten wordt toegediend voor een totale injectie van 0,5 µL. Laat de spuit vijf minuten op zijn plaats staan.

Verwijder na de vastgestelde tijd het dier uit het stereotaxische frame, sluit de incisie en plaats het dier op een warmtemat. Dien postoperatieve analgesie toe volgens uw goedgekeurde dierprotocol. Voer de gedragstests twee tot drie dagen na de stereotactische injectie van virale lacticles uit.

Laat de muizen ten minste vier uur voor aanvang van het experiment wennen aan de ruimte. Begin met het oplossen van DOI in een 0,9 procent zoutoplossing tot een concentratie van twee milligram per kilogram. Richt een thuiskooi in zonder strooisel en stel met behulp van een statief een camera zo in dat deze zich direct boven de thuiskooi bevindt.

Kalibreer de camera zodanig dat de volledige thuiskooi zich in het gezichtsveld bevindt. Weeg de muis en injecteer intraperitoneaal de passende dosis van ofwel 0,9 procent zoutoplossing of DOI. Plaats de muis tien minuten lang terug in de thuiskooi.

Plaats de muis na tien minuten in het midden van de lege thuiskooi en zorg ervoor dat er geen blinde vlekken zijn in het gezichtsveld van de camera. Start de opname op de camcorder en verlaat de ruimte. Stop na 30 minuten de opname en plaats de muis terug in de oorspronkelijke thuiskooi.

Herhaal de gedragstest bij de volgende muis. Laat de scheidsrechter de video's beoordelen zonder kennis van de experimentele condities. Noteer handmatig elke hoofdschok gedurende de gehele video.

Een hoofdtrek is gedefinieerd als een snelle schuddende hoofdbeweging uitgevoerd door een muis. Verwerk de gegevens zoals beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol. Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van HSV-gemedieerde transgene expressie in de frontale cortex.

HSV mGlu2 GFP werd geïnjecteerd in de frontale cortex en de GFP-expressie werd aangetoond via immunocytochemie. Deze schaalbalk vertegenwoordigt 200 microns. Deze afbeelding toont een western blot van HSV-gemedieerde transgeenexpressie en anti-mGlu2-reactiviteit in de frontale cortex van mGlu2-knockoutmuizen.

Hier hebben we de immunoreactiviteit van mGlu2 als monomeer gemeten. Dit histogram laat zien dat virale expressie van mGlu2 in de frontale cortex van mGlu2-knockoutmuizen de head-twitch respons, geïnduceerd door de hallucinogene serotonine 2a-receptoragonist DOI, significant herstelt, terwijl dit niet het geval is bij chimere mGlu2. De meest kritieke stappen bij dit experiment zijn de timing tussen de virale injecties, de head-twitch respons en het moment waarop de muizen worden geofferd.

Elke vertraging kan de resultaten van het experiment beïnvloeden of onduidelijkheid in de gegevens veroorzaken. Zodra de procedure onder de knie is, zal de chirurgische ingreep bij de muis ongeveer 30 minuten duren om het virus te injecteren. Het experiment met het hoofdschudden zou per muis ook ongeveer 35 minuten in beslag moeten nemen.

Het wordt aanbevolen om de operaties te spreiden, ofwel door op meer dan één muis tegelijk te opereren. Op deze manier kan een tijdlijn worden gehanteerd die toelaat dat de head twitch-experimenten worden uitgevoerd in de drie tot vier dagen na de operatie, wat de periode is van maximale expressie van het virale construct. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.