En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Het algemene doel van deze procedure is om tegelijkertijd intracellulair stikstofmonoxide en superoxide-anion detecteren met behulp van de fluorescentiekleurstof DAF-2DA en DHE in vers geïsoleerde intacte muizenaorta's. Deze methode kan helpen bij het herstel van gevallen van onderzoekers in het veld van cardiovasculaire fysiologie, zoals endotheeldisfunctie en eNOS-ontkoppeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om een eenvoudige en precieze methode te bieden voor ex vivo directe detectie en visualisatie van stikstofmonoxide en superoxide-anion tegelijkertijd in intacte bloedvaten.

Voor dit protocol, bouw een orgaanbadsysteem dat verwarmd kan worden tot 37 graden Celsius en geventileerd met 95% zuurstof, 5% kooldioxidegas uit een koolgastank. Om te beginnen, bereid voldoende verse Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer voor zoals nodig is om de weefsels van belang te baden. Bijvoorbeeld, 200 milliliter is nodig voor aorta's in één experiment.

Schakel het orgaanbadsysteem in en stel de temperatuurregeling in op 37 graden Celsius. Na het wassen van de kamers met Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer, voeg vijf milliliter van de Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer toe aan elke kamer en zet het gas aan om het 30 minuten te beluchten met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Houd de kamers bedekt.

Bereid ook een fles ijskoude Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer met beluchting. Na het uitnemen van de thoracale aorta, dompel het hele weefsel onmiddellijk onder in een schaal met ijskoud Krebs-Ringer buffer. Onder een dissectiemicroscoop, verwijder het hart en de aortaboog terwijl het thoracale aortasegment in de buffer wordt gehouden.

Vervolgens, dissecteer de aorta vrij van aanhankend perivascular weefsel met behulp van chirurgische schaar en pincetten. Gebruik vervolgens pincetten om de rand van het weefsel vast te grijpen en spoel het bloed voorzichtig uit het vaatlumen met ijskoud Krebs-Ringer buffer afgeleverd vanuit een spuit. De bloedstolsels in het vaatlumen moeten worden weggespoeld omdat ze kunstmatige signalen kunnen veroorzaken en interfereren met de fluorescerende signalen, terwijl de spoelkracht tegelijkertijd moet worden gecontroleerd om de endotheellaag niet te beschadigen.

Snij nu de gereinigde aortaringen in segmenten van drie millimeter lang. Na het voorbereiden van de gereinigde aortaringen, kleuren ze. Door enkel de adventitiële zijde van de aortaringen met pincetten aan te raken, zonder de bloedvaten te klemmen, breng de gereinigde aortasegmenten over naar de voorbereide orgaanbadkamers.

Laat de aderen 30 minuten in de buffer gelijkwaardig worden. Voeg na een half uur acetylcholine toe aan het orgaanbad om een eindconcentratie van één micromolar te geven en incubeer de aderen gedurende 10 minuten met de acetylcholine. Ondertussen, bereid in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje een milliliter kleuroplossing voor met voorverwarmde Krebs buffer.

Wickel vervolgens de buis in folie om lichtblootstelling te minimaliseren en bewaar het op 37 graden Celsius. Na de acetylcholinestimulatie, breng de aortaringen over van het orgaanbad naar het buisje met kleuroplossing en laat ze 30 minuten in het donker incuberen met beluchting. Alle stappen vanaf dit punt moeten met minimale lichtblootstelling worden uitgevoerd.

Breng vervolgens de aortaringen over naar een nieuw buisje gevuld met Krebs buffer gedurende een minuut. Voer deze wasstap drie keer uit. Fixeer vervolgens de aortaringen in een bad van 4% paraformaldehyde oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Na de fixatiestap, breng de ringen gedurende drie minuten bij kamertemperatuur over naar DAPI oplossing om de tegenkleuring toe te passen. Was vervolgens de aortaringen drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt. Wees altijd gevoelig voor de kwetsbaarheid van het endotheelweefsel bij het verplaatsen van de ringen.

Snijd onder een microscoop de aortaringen longitudinaal met microchirurgische schaar op een dia. Verwijder vervolgens overtollig vocht op de aorta terwijl deze nat blijft. Druk de opgerolde aorta's plat tegen een dia met het endotheel naar beneden op de glazen dia door middel van twee microchirurgische pincetten.

Bij dit proces, beweeg de aorta's niet heen en weer. Deze stap is erg cruciaal, maar niet gemakkelijk uit te voeren. Het is beter om goed te oefenen voor het formele experiment.

Breng vervolgens het montagemedium op de aorta. Bedek de dia en verzegel het met nagellak. Na het drogen in het donker, beeld de dia's af met behulp van confocale microscopie.

Gebruik een scanneling van 200 hertz, een resolutie van 1024 x 1024 pixels, en een z-stack grootte van een kwart micron. Om de DAF-2DA te observeren, gebruik een argonlaser, stel de opwindende fluorescentie in op 488 nanometer, en de emissiedetectie op 515 nanometer. Om de DHE te observeren, stel de opwindende fluorescentie in op 514 nanometer en stel de detectie in op 605 nanometer.

Na het scherpstellen met 10x vergroting, pas het objectief aan op 40x vergroting. Definieer nu het bereik van de endotheellaag door de z-positie op het controlepaneel aan te passen, waarbij de DAPI-gekleurde kernen als oriëntatiepunt worden gebruikt. Scan vervolgens vanaf de endotheellaag aan de lumenrand door de volledige dikte van de endotheellaag en neem de beelden op.

Scan minimaal drie verschillende gezichtsvelden voor elk monster. Jonge C57 zwarte 6 muizen werden dik gemaakt door 14 weken lang een hoogvetdieet te krijgen. De controles kregen normaal veevoer.

Na 14 weken werden hun thoracale aderen onderzocht. Voor het kleuren, werden de weefsels een uur lang blootgesteld aan de eNOS-remmer L-NAME bij één nanomolar. Het signaal van DAF-2T, gezien in groen, wordt geconverteerd van niet-fluorescente DAF-2 door stikstofmonoxide.

Dus, kleuring suggereert de aanwezigheid van stikstofmonoxide in een cel. Evenzo, wanneer geoxideerd door superoxide, geeft DHE een rood fluorescerend signaal af.