Name: Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer een drukinjectiemethode voor neurofarmacologisch onderzoek bij wakke makaakaapen. Deze techniek maakt farmacologische manipulatie nabij corticale registratiesites mogelijk voor cognitieve neurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft door de Collaborative Research Center 889 &quot;cellulaire mechanismen van Sensory Processing&quot; naar ST (Project C04). Wij danken Sina Plümer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse, Klaus Heisig en Ralf Brockhausen om technische en diergerelateerde support en onze medewerkers in de Stem Cell Unit van de Duitse Primate Center, Dr. Katharina Debowski en Anna Magerhans om technische bijstand in de filtratie proces.

Dierenverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving met betrekking tot de verzorging van dieren en door het district regering van Braunschweig, Nedersaksen, Duitsland goedgekeurd. Opmerking: Als het experiment wordt uitgevoerd in vivo, is het cruciaal om de hoogst mogelijke hygiëne te handhaven. Waar mogelijk werken onder steriele omstandigheden. 1. Voorbereiding van de Injectie / Recording System <ol><li> Steriliseer de buis die de micropipet verbindt met de spuit. Gebruik de kortste lengte van de buis mogelijk in de experimentele set-up tussen de injectiepomp en elektrofysiologische opname systeem. </li><li> Reinig de geleidingsbuizen van de opname-systeem met behulp van reiniging draden. Dompel ze in steriele siliconenolie en voeden hen door de afzonderlijke geleidebuizen meerdere malen. </li><li> Steek het kwartsglas micropipet in een geleidingsbuis van het opnamesysteem. Zie figuur 1A. </li><li> Na vaststelling van de micropipet inhet opnamesysteem, bevestig de steriele buis naar de metalen pin van de micropipet. Wees voorzichtig; hoewel de micropipet in het systeem wordt vastgesteld kan gemakkelijk breken bij het bevestigen van de buis. Gebruik twee steriel pincet om gelijke druk uit te oefenen op de pin en de buis. </li><li> Vloeibare super lijm op de kruising tussen de buis en micropipet af te dichten. Wacht tenminste 3 uur voor de lijm uitharden alvorens het vullen van de micropipet met vloeistof. </li><li> Invoegen micro-elektroden (bijvoorbeeld kwarts glas geïsoleerde platina wolfram) in andere standen van het opnamesysteem voor of na het inbrengen micropipet. </li></ol> 2. De voorbereiding van de chemische stof <ol><li> Steriliseren 1,5 ml microcentrifugebuizen voor latere opslag van injectieoplossingen gebruik van een autoclaaf of andere betrouwbare procedure. </li><li> Weeg de bijbehorende stof scopolamine hydrochloride tot 5 ml van een 0,1 molaire oplossing te bereiden. Oplossen in steriele zoutoplossing (0,9% NaCl). </li><li> Onder steriele omstandigheden ina zuurkast, filteren de oplossing met behulp van een injectiespuit filter met een voldoende grote poriën diameter, bijvoorbeeld 0,2 urn. </li><li> Onder de zuurkast aliquot de oplossing in hoeveelheden voldoende voor een enkel experiment, bijvoorbeeld voor scopolamine, 500 pl in steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik donkere buisjes om de stof te beschermen tegen het licht; als alternatief, wikkel tubes in aluminiumfolie. Voor scopolamine Bewaar de oplossing tot 14 dagen bij 4 ° C. </li></ol> 3. Dagelijks Voorbereiding van de Injectie / Recording System Opmerking: Bij montage in het opnamesysteem, worden de elektroden en micropipet opgeslagen in een enzymoplossing (Tergazyme, 1% oplossing met gedeïoniseerd water) tussen opnames. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elke opname. <ol><li> Verzamel een buis van de te injecteren substantie. Laat het RT bereiken als gekoeld. </li><li> Verwijder de injectie / opnamesysteem van de enzymoplossing en spoel elektrodenen micropipet met gedeïoniseerd water om volledig schoon enzymoplossing. </li><li> Verwijder de voorkant van het opnamesysteem om visueel te controleren de afdichting tussen micropipet en de buis. </li><li> Toepassen steriele siliconenolie aan de geleidebuis spleet (zie figuur 1A) en de uiteinden van de elektroden en micropipet om het systeem te smeren voor soepele bewegingen. </li><li> Controleer tips van de elektroden en micropipet met behulp van een microscoop te zorgen dat ze intact zijn. Lijn de elektroden en de micropipet onder de microscoop, zodat ze uit de geleidebuizen uitbreiden dezelfde lengte. Drijf ze in de geleidingsbuizen, zodra zij niet meer toegankelijk te stoppen. Hieronder wordt verstaan ​​elektrodepositie nul. Stel de diepte van de elektroden en micropipet aan 0 in de software. </li><li> Vul een steriele spuit met een steriele zoutoplossing en steek de naald in de buis, het verzorgen van de wand van de buis niet te doorboren. Rij de micropipet uit de geleidebuis voor visual controle van de stof flow. </li><li> Spoelen tenminste 2 ml steriele zoutoplossing door de buis en micropipet geen lucht waarborgen in de spuit of in de buis. Niet te veel druk niet op de zuiger van de spuit. Zorg ervoor dat de verbinding tussen buis en micropipet is verzegeld. Als lekkage zichtbaar is, re-lijm de splitsing (zie stap 1.5) en de opname uit te stellen. </li><li> Vul een nieuwe steriele spuit met de oplossing te injecteren en uitwisseling met de loop van de zoutoplossingspuit, dat wil zeggen, houdt de naald van de spuit met zoutoplossing in de buis. Zorg ervoor dat er geen lucht wordt overgedragen in het systeem. Dit wordt het best bereikt door het vullen van de naaldnaaf met zoutoplossing na verwijdering van de zoutoplossing gevulde vat. </li><li> Spoel het systeem met 250 ul van de oplossing te injecteren, om de zoutoplossing uit de buis te verwijderen. </li><li> Met de motor besturingssoftware intrekken elektroden en micropipet in de guidetubesto een diepte van ten minste -500 urn. </li><li&gt; Laat de geleidebuis ring (Figuur 1A) naar de bodem van de geleidingsbuizen hun vaste relatieve positie te handhaven. </li><li> Reinig de basis van het systeem met ethanol, in het bijzonder wanneer de aap opname kamer zal raken. </li><li> Sluit het opnamesysteem door het vervangen van de voorklep en de schroeven. </li></ol> 4. Validatie van het injectiesysteem Let op: Hoewel het bedrijf kalibreert het systeem, is het raadzaam om de uitgeworpen volumes met de gebruikte in de experimentele set-up (buizen, spuiten enz.) Materialen te valideren. <ol><li> Bereid het systeem zoals beschreven in stap 3, waarbij elektroden en micropipet uitgebreid uit de geleiding buizen. Een diepte van tenminste 7000 urn wordt geadviseerd om verlies van meetvolume voorkomen door hechting langs het buitenoppervlak van de micropipet en de elektroden. </li><li> Plaats het opnamesysteem op de plaats zal worden gebruikt tijdens het experiment en zet de syringe in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit. </li><li> Met behulp van de software-gestuurde motor-eenheid, werpen een volume groot genoeg is om nauwkeurig te meten, bijv., 1000 nl. Het verdient de voorkeur een enkele stap om het totale volume te werpen om de effecten van capillaire werking langs de micropipet oppervlak voorkomen. Zeer lage snelheden (1 nl / s) kan ook leiden tot dit effect tijdens de validatieprocedure. </li><li> Verzamel het totale volume in een bak onder de micropipet geplaatst, of zorgvuldig direct verzamelen van de uitgeworpen daling van de punt van de micropipet. Schat de uitgeworpen volume met behulp van een pipet of door weging, met een precisieweegschaal. </li><li> Herhaal deze procedure een paar keer om metingen te bevestigen. </li></ol> 5. Acute Recordings <ol><li> Stel de xy positievan het opnamesysteem. Dit bepaalt het punt waarop de geleidebuizen bereikt de dura mater binnen de chronisch geïmplanteerde opname kamer. Zorg ervoor dat de gids buizen zijn volledig ingeschoven (geleidebuis z stand 0). </li><li> Breng het opnamesysteem in positie en plaats de spuit in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit. Als een druppel stof zichtbaar aan het uiteinde van de geleidingsbuizen voorzichtig verwijderen met een steriel wattenstaafje. </li><li> Bereid het dier voor het opnemen volgens de procedure van het laboratorium (zie 18 bijvoorbeeld richtlijnen). </li><li> Te monteren de opname-systeem op de opname kamer van de aap. </li><li> Langzaam handmatig de geleidebuizen laten zakken in de opname kamer tot de dura wordt bereikt, dan rijden de elektroden met behulp van de motor control software. </li><li> Aangezien het niet mogelijk is de impedantie van de micropipet meten rijden eerst met elektroden en controleren hun impedanties regelmatig op verschillende diepten. Na penetratie van de dura met succes wordt uitgevoerd zonder beschadiging van de elektroden vooraf de micropipet. </li><li> Rij de elektroden en de micropipet de doelelektrode diepte waarop het hersengebied plaats wordt verwacht worden. vooraf langzaam de elektrode totdat deze dicht genoeg bij de activiteit van een eenheid op te nemen, zoals blijkt uit een goede signaal-ruisverhouding in het opgenomen signaal. Belangrijker plaats de registratie-elektrode en de micropipet op dezelfde diepte om de minimale afstand tussen elektrode en micropipet waarborgen. <ol><li> Indien mogelijk, houdt de elektroden en micropipet op deze diepte voor de gehele opname. Indien de enige manier om de signaalkwaliteit van de geregistreerde-cel is met de elektroden bewegen, dan rijdt de elektroden en de micropipettegelijkertijd de afstand tussen hen te handhaven. </li></ol></li></ol> 6. Ruimtelijke Aandacht Task <ol><li> In een reeks proeven onderhavige twee bewegende puntpatronen op het scherm, een gepositioneerd in het receptieve veld van de opgenomen neuron en andere daarbuiten, alsmede een centraal gepresenteerde bevestigingspunt dat het dier moet foveate in elk proces 19, 20. Opmerking: De aap is getraind om te reageren op een verandering van richting in de cued dot patroon (het doel event), terwijl het negeren van elke richting overgaand in de andere dot patroon, en wordt beloond met een druppel vloeistof voor elke succesvolle afronding van een proef 19, 20. Als een zintuiglijke controle conditie, de aap heeft een luminantie verandering van de fixatie te melden terwijl het negeren van zowel bewegende stip patronen (zie figuur 2 voor een meer gedetailleerde beschrijving van de taak). </li></ol> 7. Farmacologische Manipulatie tijdens het opnemen <p&gt; Let op: Terwijl de aap is het uitvoeren van de taak, injecteer de stof in een bloksgewijs manier. Drie opeenvolgende blokken gedefinieerd: controle, die fungeert als basis; injectie, waarbij een stof wordt uitgestoten; en herstel, waarbij de cellen waarop het injectie terugkeer naar de basislijn. <ol><li> Tijdens een injectieblok injecteren een vooraf bepaalde hoeveelheid van de stof regelmatig bv., 2 nl elke minuut met een snelheid van 2 nl / s. Voor dit voorbeeld gebruiken scopolamine hydrochloride. Het injectieproces wordt via software die verscheidene opties biedt. Gebruik bijvoorbeeld de stap functie aan de injectie volume te definiëren, en druk op de knop injectie elke minuut op basis van de klok van de opname software. Opmerking: De exacte duur van de injectieblok substantie en experiment afhankelijk, bijvoorbeeld voor gebruik scopolamine 2 nl injecties per minuut gedurende 10 min (20 nl in totaal).. Het verdient de voorkeur de elektroden en micropipet duri niet om door te gaanng van de injectie blok. </li><li> Noteer de tijd en het proces waarin de stof wordt geïnjecteerd, de diepte van de elektroden en micropipet, en de hoeveelheid uitgestoten stof. </li><li> Volg de injectieblok een herstel blok, waarin geen substantie geïnjecteerd. De duur van het herstel blok stof specifiek en moet worden gedefinieerd in de pre-testen. Bewaken en de opnamekwaliteit van de geselecteerde afzonderlijke eenheden handhaven tot het einde van de herstelperiode blok. </li><li> Herhaal de drie blokken voor zo lang als de opname kwaliteit en motivatie van de aap mogelijk te maken. </li></ol> 8. Bericht Opname Procedures <ol><li> Na de registratie van de gegevens, in te trekken elektroden en micropipet in de geleiding buizen en vervolgens handmatig de geleidebuizen trekken. Verwijder de opname-systeem van de opname kamer van de aap. Maak de spuit uit de inspuitpomp en het systeem dragen aan de bereidingsruimte te reinigen. </li><li> Behandel het dier(inclusief reinigen van de opname kamer 18) volgens de standaard procedures van het laboratorium en terug naar de behuizing faciliteit. </li><li> Spoel de buitenzijde van de geleidingsbuizen met waterstofperoxide (3%) en vervolgens met gedeïoniseerd water. Drive elektroden en micropipet uit de geleiding buizen, spoelen met waterstofperoxide en vervolgens gedemineraliseerd water. </li><li> Wisselen de cilinder van de spuit met een cilinder van een injectiespuit gevuld met steriele zoutoplossing, waarbij de naald in de buis. Spoel de buis en de micropipet met 1-2 ml zoutoplossing. Na het spoelen, verwijder dan het vat en vul deze met lucht. Plaats het vat in de naald en droog de buis en de micropipet van binnenuit diept lucht door. </li><li> Bewaar de geleidingsbuizen uitgebreid elektroden en micropipet ondergedompeld in de enzymoplossing om uitdroging te voorkomen en om de afbraak van organisch materiaal te waarborgen. </li></ol>

<ol><li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromodulators+in+selective+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of neuromodulators in selective attention.</a> Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).</li>
<li>Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+receptor+activation+supports+persistent+firing+in+layer+III+neurons+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex.</a> Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).</li>
<li>Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cholinergic+and+GABAergic+mechanisms+to+direction+tuning%2C+discriminability%2C+response+reliability%2C+and+neuronal+rate+correlations+in+macaque+middle+temporal+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area.</a> J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).</li>
<li>Thienel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+antagonist+effects+on+executive+control+of+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic antagonist effects on executive control of attention.</a> Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).</li>
<li>Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+muscarinic+receptor-G+protein+coupling+is+a+general+property+of+liquid+volatile+anesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics.</a> Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).</li>
<li>Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+ion+channels%3A+molecular+models+and+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).</li>
<li>Herr, N. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+examining+rapid+dopamine+signaling+with+iontophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis.</a> Front Biosci. 5, 249-257 (2013).</li>
<li>Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+contribution+of+iontophoresis+and+electro-osmosis+to+the+electrophoretic+release+of+noradrenaline+from+multi+barrelled+micropipettes+%5Bproceedings%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings].</a> Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).</li>
<li>Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmotic+flow+and+its+contribution+to+iontophoretic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery.</a> Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).</li>
<li>Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electrode-pipette+design+for+simultaneous+recording+of+extracellular+spikes+and+iontophoretic+drug+application+in+awake+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).</li>
<li>Lalley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLalley%2C+PM+%22Microiontophoresis+and+Pressure+Ejection%3A+Modern+Techniques+in+Neuroscience%22">Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience</a>. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).</li>
<li>Malpeli, J. G., Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).</li>
<li>Malpeli, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Dias, E. C., Segraves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pressure+system+for+the+microinjection+of+substances+into+the+brain+of+awake+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys.</a> J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).</li>
<li>Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+protein+kinase+C+inhibitor+H-7on+membrane+properties+and+synaptic+responses+of+neocortical+neurons+of+awake+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats.</a> Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).</li>
<li>Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lntracellular+injection+of+cGMP-dependent+protein+kinase+results+in+increased+input+resistance+in+neurons+of+the+mammalian+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex.</a> Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).</li>
<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).</li>
<li>Association of Primate Veterinarians. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cranial+Implant+Care+Guidelines+for+Nonhuman+Primates+in+Biomedical+Research%22">Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf">http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li>Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature-based+attention+influences+motion+processing+gain+in+macaque+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex.</a> Nature. 399, 575-579 (1999).</li>
<li>Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature-based+attention+increases+the+selectivity+of+population+responses+in+primate+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex.</a> Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we in detail hoe betrouwbaar en nauwkeurig injecties en hoogwaardige eencellige opnamen uitgevoerd met een &quot;off-the-shelf&quot; druk injectiesysteem. Hoewel deze wijze van geneesmiddelafgifte is eerder gebruikt gedragen apen (besproken in 17), het hier gepresenteerde systeem heeft voordelen, hieronder besproken. Zoals getoond in figuur 4A, kan het hier beschreven systeem stabiele meting van één neuron activiteit en zonder farmacologische injecties in de directe nabijheid van de opname site. Zoals getoond in figuur 4B, de injectie van een bestrijdingsmiddel, zoutoplossing, leidde niet tot een verandering van vuren. Deze controle blijkt dat het injectieproces zelf geen merkbare invloed hebben op de eigenschappen afvuren van de neuronen opgenomen. De ruimtelijke configuratie van neuron, registratie-elektrode en micropipet van essentieel<html> belang in deze experimenten. Hoewel een precieze meting van de relatieve posities in het weefsel tijdens het opnemen is niet mogelijk, kunnen we overwegen en controle voor mogelijke bronnen van variantie. Eerst, tijdens geïnjecteerde volume bestaat het risico dat de neuron plaats weg verplaatst kan worden van de registratie-elektrode, die de stabiliteit van de geregistreerde signalen. Om die reden is het verstandig om de vuursnelheid te vergelijken voor en na de injectie blok om het signaal stabiliteit te controleren. Ten tweede, de geleidingsbuis configuratie van het opnamesysteem definieert de afstand tussen elektroden en micropipet (bijv., 305 urn in de concentrische 3-kanaalsysteem gebruikt in dit experiment). Als het systeem zorgt voor een nauwkeurige positieregeling voor de diepte van de elektroden en micropipet in het weefsel, kan de afstand daartussen worden geminimaliseerd door zorgvuldig kalibreren relatieve diepte voor het opnemen (stap 3,5), en waardoor ze een gemeenschappelijke diepte tijdens opnames. ent &quot;&gt; Mogelijke beperkingen Naast interne kwaliteitscontrole door de fabrikant van het systeem moet worden bevestigd onder laboratoriumcondities, zoals verschillende merken van buizen, kunnen spuiten enz. Worden gebruikt en kan leiden tot verschillen in uitgeworpen volumes. Hoewel het systeem kan worden gebruikt om kleine volumes in het hier getoonde experiment injecteren, zijn onder de minimumhoeveelheid die kan worden bevestigd door praktische limieten meting in een normale laboratoriumomgeving. Echter kunnen grotere injectievolumes worden gebruikt om de relatie tussen de softwareradio volume en het volume van de hardware uitgeworpen afleiden. Als transparante buizen worden gebruikt, als extra visuele controle van het injectieproces is mogelijk door de verplaatsing van een visuele markering. Plaatsen van de micropipet in het systeem is veeleisender dan elektrodeplaatsingsinstrument, als de diameter van de micropipet is iets groter en het materiaal is kwetsbaarder. Daarnaast,verbinden van de buis met de pin van de micropipet is een uitdaging omdat het een hoog risico van het breken van de bovenkant van de micropipet meebrengt. De levensduur van een succesvol geladen micropipet is enkele maanden, zelfs bij dagelijks gebruik. In de praktijk hebben we nog niet gestuit op een blokkade in het inspuitsysteem tijdens post-opname reiniging van het systeem. Niettemin geen &quot;online&quot; check is mogelijk, en er is een risico dat een fysieke blokkade (zoals weefsel op de micropipet tip) stof injectie kunnen verhinderen. Het zou daarom wenselijk om de gegevens te analyseren conservatief, zoals dat het alleen die cellen meer onderzoek dat aanzienlijke veranderingen in bakken weer tussen controle en injectie blokken van het experiment tonen. Ondanks hun kleine diameter, zal micro-elektroden en pipetten hersenweefsel verdringen en kunnen sommige lokale weefselbeschadiging veroorzaken. Dit kan worden geminimaliseerd door het handmatig positioneren van de punt van the geleidebuizen net boven de dura mater. De elektroden dringen dan de dura en de intactheid wordt afgeleid door online meten van hun impedanties. Daarna wordt de micropipet gestoken. Bij gebruik van deze benadering wordt regelmatige afvoer van weefsel boven de dura aanbevolen om het risico van elektrode of pipet breuk verder te verminderen. Vergelijking met alternatieve methoden Het systeem gebruikt hier laat zien duidelijke voordelen ten opzichte van andere druk inspuitsystemen. Een sterk voordeel is de diameter van de micropipet (ongeveer 100 um), die de helft kleiner dan andere beschikbare probes 17 en minimaliseert derhalve neurale weefselbeschadiging. In tegenstelling tot eerdere ontwerpen wendt het huidige systeem ruimtelijk gescheiden registratie-elektrode en micropipet. Hoewel andere systemen een kleinere afstand tussen elektrode en pipet, het hier beschreven systeem maakt onafhankelijke ingrijpende wijzigingen van de elektroden en pipet, waardoor Permin de sla variabele relatieve afstanden binnen een opnamesessie. Belangrijk, geen compromis met betrekking opnamekwaliteit moet worden gemaakt, als het injectiesysteem is een uitbreiding van een bestaande opnameapparaat. Terwijl slechts een micropipet en dus een stof wordt gebruikt in dit protocol, is het mogelijk om verschillende stoffen te injecteren in een experimentele procedure. Hiervoor kunnen meerdere micropipetten worden geschroefd in afzonderlijke geleidebuizen en verbonden spuiten aangebracht in afzonderlijke injectiepompen. Tenslotte besturen van het systeem eenvoudig, aangezien slechts een computerprogramma is nodig om de elektroden en micropipet bevorderen, en om tevens injectie voeren tijdens het experiment. Vergeleken druk injectie iontoforese, er relatieve voordelen en nadelen. Bijvoorbeeld, druk injectie van grotere volumes worden ingebracht in het weefsel dan iontoforese, waardoor het risico van neuronale verplaatsing verhogen. De huidige protocol gebruikt volumes in NL range, en we zelden meegemaakt merkbare veranderingen in een opgenomen cel van de kwaliteit van het signaal. Het systeem maakt het ook mogelijk grotere hoeveelheden te injecteren, die potentieel bruikbaar zijn voor gedrags manipulaties maar kon beïnvloeden de stabiliteit van neuronale opname. Een duidelijk voordeel van druk injectie gedurende iontoforese is de grotere verscheidenheid van bruikbare stoffen er geen vereiste om geladen stoffen gebruiken. Er moet echter pH-waarden worden gecontroleerd en vergeleken tussen experimentele en controle stoffen (bv., Zoutoplossing). De vraag zou kunnen ontstaan ​​waarom de reeds lang gevestigde methode van de druk injectie in plaats van nieuwere technieken te gebruiken, zoals optogenetics voor het manipuleren van neurale activiteit. Hoewel goed ingeburgerd in knaagdieren, optogenetics is nog niet betrouwbaar vastgesteld bij resusapen. In het bijzonder is het niet toelaat dat de lokale manipulatie van cellen selectief voor een bepaalde neurotransmitter type. Op de langere termijn zien wegroot potentieel voor de combinatie van de voordelen van farmacologische manipulaties met de voordelen van optogentic manipulaties in het ophelderen van de neurale basis van cognitieve functies. Hier hebben we aangetoond hoe druk injectie kan worden gebruikt om een ​​lokaal beperkt gebied in de hersenen van wakker farmacologisch manipuleren, gedragen resusapen. Wij hopen dat deze methode inspireert andere wetenschappers om neuromodulatory bijdragen aan de dynamiek van de neuronale activiteit te onderzoeken.

In corticale en subcorticale gebieden wordt neuronale activiteit beïnvloed door verschillende neuromodulatoren, bijvoorbeeld acetylcholine1. Deze modulerende effecten op neuronale reacties zijn gemeld in in vitro studies2, evenals in elektrofysiologische opnames van verdovde dieren3 en systemische farmacologische manipulaties bij mensen4. Niettemin is de exacte rol van verschillende neuromodulatoren en de betrokkenheid van verschillende receptorsubtypes grotendeels onbekend. Om de effecten van specifieke neuromodulatoren op de activiteit van enkele neuronen te meten, is het wenselijk om een tijdelijke verandering van neuromodulator zo dicht mogelijk bij de opname-elektrode te induceren. Bovendien is het belangrijk dat deze manipulaties worden uitgevoerd bij wakkere dieren, omdat cognitieve functies alleen aanwezig zijn bij afwezigheid van anesthesie. Bovendien werkt anesthesie samen met cholinerge en GABAerge systemen5,6 en kan het leiden tot veranderingen in neurale activiteit3.
In de afgelopen decennia zijn twee belangrijke methoden voor lokale medicijntoediening ontwikkeld en verfijnd: iontoforese en drukinjectie. Bij beide methoden worden geneesmiddelen afgegeven via micropipetten gemaakt van glas of staal. Bij iontoforese regelt een elektrische stroom de afgifte van het medicijn7. Bovendien is er een significante bijdrage van elektro-osmose aan de totale hoeveelheid uitgeworpen moleculen8, in correlatie met de tipdiameter9 van de micropijp en de concentratie8 van de gebruikte stof. Iontoforese is een krachtig hulpmiddel om snel en nauwkeurig kleine volumes van zenuwweefsel te manipuleren. Voor iontoforetische injecties worden meestal micropipetten met meerdere vaten gebruikt10, waarbij één als opnameapparaat dient en de andere posities als afgiftepijp. Een beperking van deze methode is dat alleen geladen moleculen kunnen worden gebruikt, wat de selectie van geneesmiddelen ernstig beperkt.
Drukinjectie maakt gebruik van luchtcompressie of mechanische druk om een stof uit een micropijp te werpen. Met deze methode kan elke oplosbare stof, geladen of ongeladen, worden gebruikt, inclusief grote moleculen. De methode van drukinjectie werd voor het eerst beschreven door Reyniers in 1933 en verder verfijnd in de jaren 1950 (zie Lalley11 voor een overzicht). In de jaren 1980 werd de methode verder verfijnd om leveringen in het nanoliterbereik (voornamelijk lidocaïne12) naar een gedefinieerd hersengebied te kunnen uitvoeren13, terwijl tegelijkertijd opname van één cel werd uitgevoerd. Het uitgeworpen volume werd meestal gemonitord door het bewegen van een marker te observeren, zoals de meniscus in het bovenste deel van de pijp13. Drukinjectie werd voor het eerst in de jaren 1990 gebruikt bij wakkere dieren, zowel extracellulair14 als intracellulair15,16. Op basis van de cumulatieve expertise die in deze studies is opgedaan, is het nu mogelijk om betrouwbaar opname uit verschillende hersengebieden te maken in combinatie met farmacologische manipulatie (zie17 voor een vergelijking van recente drukinjectiesystemen).
Een blijvend probleem voor beide medicijntoedieningsmethoden is de moeilijkheid om het precieze geïnjecteerde volume te bepalen. Dit is een nog grotere uitdaging voor experimenten met wakkere, gedragende resusaapjes waarbij het dier de experimentele taak uitvoert in een aparte kamer. Dit kan worden verlicht door gebruik te maken van een softwaregestuurd systeem in plaats van te vertrouwen op een visuele marker om een injectie continu te monitoren.
Het hier beschreven systeem is een uitbreiding van een goed gevestigd elektrofysiologisch opnamesysteem (Mini Matrix System) en combineert een injectiepijp met meerdere evenwijs georiënteerde opname-elektroden op gedefinieerde afstanden in een aanpasbare opstelling. Farmacologische manipulatie van het weefsel nabij de opname-elektrode is mogelijk met behulp van slechts een kleine hoeveelheid substantie, wat een snelle herstel mogelijk maakt en meerdere blokken injectie en controle/herstel binnen de beperkte tijdsvenster die wordt geboden door de gedragstaak van het dier.

<table><tbody><tr><td>(-)-Scopolamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-16-3</td><td>Mr 339,81 g/mol</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%&nbsp;</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>3079870</td><td>5ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>enzymdetergenz</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Roth</td><td></td><td>Gebruikt in 3% oplossing met gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemie-Vertieb Hannover</td><td>104642</td><td>70%</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt 40 Duo</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9166432V</td><td>Spuit en naald&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.191</td><td>1,5ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwartspijp micropipet</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opname-elektrode</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>kwarts/platina-wolfraamvezel elektrode; impedantiewaarde 1-2 M&Omega;&nbsp; en 0,3-0,5 M&Omega;</td></tr><tr><td>PharmedBPT-Schlauch</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics&nbsp;</td><td>3702003</td><td>&nbsp;Grootte: 0,25 x 2,05 mm (Bd: 0,9mm)</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>233641</td><td>Superlijm</td></tr><tr><td>Silicone olie</td><td>Thomas Recording</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC15</td><td>Sartorius</td><td>17761----------R</td><td>Spuitfilter</td></tr><tr><td>Multichannel Micro Injectie Systeem</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>multichannel microelektrode manipulator “System Eckhorn” uitgerust met microelektroden en micropipetten en een precisie multichannel micro-injectiepomp</td></tr><tr><td>McLab</td><td>op maat</td><td></td><td>interne lab software om de stimuluspresentatie te controleren</td></tr></tbody></table>

een pressure injection systeem voor het onderzoeken van de neurofarmacologie van information processing in awake behaving makaak monkey cortex

A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

De top-down modulatie van feed-forward corticale informatieverwerking is functioneel belangrijk voor veel cognitieve processen, inclusief de modulatie van sensorische informatieverwerking door aandacht. Er is echter weinig bekend over welke neurotransmittersystemen betrokken zijn bij dergelijke modulaties. Een praktische manier om deze vraag aan te pakken is om single-cel opname te combineren met lokale en tijdelijke neurofarmacologische manipulatie in een geschikt diermodel. Hier demonstreren we een techniek die acute single-cel opnamen combineert met de injectie van neurofarmacologische agentia in de directe omgeving van de opname-elektrode. De video toont de voorbereiding van het drukinjectie/opnamesysteem, inclusief de voorbereiding van de te injecteren substantie. We tonen een rhesusaap die een visuele aandachtstaak uitvoert en de procedure van single-eenheid opname met blok-gewijze farmacologische manipulaties.

Figuur 2 geeft de ruimtelijke aandacht taak van de aap uitgevoerd terwijl het injectieproces werd uitgevoerd. De aap werd opgeleid bij te wonen om ofwel de prikkel gelegen binnen de receptieve veld van de opgenomen neuron (wonen-in), de prikkel zich buiten de receptieve veld (wonen-out) of de fixatie (wonen-fix). Deze omstandigheden maken een vergelijking van de neuronale activiteit in verschillende staten van aandacht. Figuur 3 toont een peri-stimulus time histogram van een monster neuron in een experiment met scopolamine, een muscarinische cholinerge antagonist. De plot toont de respons onderdrukking tijdens scopolamine injectie versus geen injectie, wanneer een patroon bewegen in voorkeursrichting van de cel in receptieve veld het neuron wordt gepresenteerd en wordt bijgewoond door het dier. De eerste twee pieken vertegenwoordigt de neuron9; s reactie op de on- en offset van de ruimtelijke cue, dat verschijnt in de receptieve veld. Dit wordt gevolgd door de reactie op de bewegende patroon dat op het scherm 500 ms na aanvang cue. De grijs gearceerde gebied geeft de onderzochte periode wordt gebruikt om de gemiddelde vuursnelheid voor elke proef te berekenen. De groene omgeving benadrukt de onderdrukkende invloed van scopolamine injectie in de cel vuursnelheid. De donkergroene gebied toont de onderdrukking in de onderzochte periode. Figuur 4A toont het effect van scopolamine op de gemiddelde verbrandingssnelheid van het monster neuron in elk van de drie voorwaarden van aandacht. De neuron verbrandingssnelheid voor de twee ruimtelijke aandachtcondities (aandacht binnen of buiten het receptieve veld van de opname neuron) en voor de sensorische aandoening (let op bevestigingspunt) daalde kort na de eerste injectie van de injectieblok (grijs gearceerd zijna) en tijdens het herstel blokkeren gestegen na een vertraging van het niveau van voor de injectie. Figuur 4B een regelschema opneemt van een tweede monster neuron waarin zoutoplossing (0,9% NaCl) werd geïnjecteerd met hetzelfde protocol als voor de injectie scopolamine. Tijdens de injectieblok geen verandering in de neuron vuursnelheid waargenomen vergeleken met het besturingsblok. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig1.jpg" /> Figuur 1. Set-up gebruikt voor farmacologische manipulatie tijdens het opnemen. (A) toont de micro-injectie pomp en de elektrofysiologische opname systeem uitgerust met elektroden en micropipet. De guidetube spleet, waarin siliconenolie wordt ingebracht om de elektroden en micropipet smeren getoond vergroot. (B) Geeft een voorbeeld micropipet (boven)en registratie-elektrode (hieronder). Voor grootte vergelijking, een eurocent (diameter: 16 mm). Daaronder is geplaatst <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig2.jpg" /> Figuur 2. Taak ontwerp tot ruimtelijke aandacht te begeleiden. Apen werden getraind om een beweging richting overgaand in de cued puntpatroon detecteren. De cue was ofwel geplaatst in receptieve veld van de neuron (wonen in), zoals getoond in de figuur, of daarbuiten (wonen-out). Als een zintuiglijke controle werd de aap getraind om een luminantie verandering van de fixatie op te sporen (wonen-fix). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> &lt;<html> img alt = &quot;Figuur 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg&quot; /&gt; Figuur 3. Invloed van antagonist scopolamine op vuursnelheid. De peri-stimulus time histogram voor een monster neuron getoond voor de attend in staat (aandacht in het receptieve veld van het neuron opgenomen) gedurende de injectieblok en tijdens het besturingsblok. De x-as toont de tijd in milliseconden na cue begin en de y-as de mate van verbranding in spikes / sec. Het grijze gebied geeft de onderzochte periode (300-800 ms na stimulus onset) gebruikt om het proces gemiddelde vuursnelheid te berekenen. De groene gearceerde gebied toont de onderdrukking in het afvuren tarief over de twee voorwaarden. De donkergroene kleur benadrukt de onderdrukking in de onderzochte periode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Effect van scopolamine en zout op vuursnelheid. (A) Antagonist scopolamine injectie. Het proces gemiddelde verbrandingssnelheid van de monstercel van figuur 3 in de loop van het experiment wordt de preferente stimulus voor alle drie attentional omstandigheden. De x-as geeft de proef start in minuten en de y-as geeft het apparaat vuursnelheid in spikes per seconden. Symbolen ( <img alt="Plus" src="/files/ftp_upload/53724/53724plussign.jpg" /> wonen-in, <img alt="Cirkel" src="/files/ftp_upload/53724/53724circle.jpg" /> wonen-fix, <img alt="Trianle" src="/files/ftp_upload/53724/53724triangle.jpg" /> wonen-out) vertegenwoordigen de neuron&#39;s afvuren tarief binnen de onderzochte periode in elk succes uitgevoerd proces, en horizontale lijnen (doorgetrokken lijn: wonen-in, stippellijn: wonen-fix, onderbroken lijn: wonen-out) tonen gemiddelde vuursnelheid voor de drie verschillende experimentele blocks (controle, injectie, herstel). De grijs gearceerde gebied geeft het injectieblok, vanaf de eerste injectie en eindigt 1 minuut na de laatste injectie. Tijdens de injectie blok 2 nL van 0,1 molair scopolamine werden geïnjecteerd elke minuut met een injectie snelheid van 2 nl / s. (B) Saline injectie. Het vuren van een cel in de loop van het controle-experiment wordt getoond de voorkeur stimulus voor alle drie attentional omstandigheden. Grijs gearceerde gebied visualiseert het blok van zout injectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier tonen we de drukinjectie van neurofarmacologische substanties tijdens opname van enkele cellen bij een wakkere, zich gedragende makaak. Deze procedure maakt farmacologische manipulatie mogelijk in de directe omgeving van een corticale opnameplaats.

Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation ...

Het algemene doel van deze drukinjectieprocedure is om de directe omgeving van de registratieplaats betrouwbaar farmacologisch te manipuleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de cognitieve neurowetenschappen, zoals het aantonen van de specifieke bijdrage van neurotransmitters aan de top-down modulatie van feedforward corticale informatieverwerking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we in staat zijn om de directe omgeving van de registratie-elektrode gedurende een gedefinieerde tijdsperiode betrouwbaar te manipuleren, met een brede selectie van agonisten en antagonisten.De modulatie van feedforward corticale informatieverwerking is functioneel belangrijk voor veel cognitieve processen, waaronder de top-down modulatie van sensorische informatieverwerking door aandacht. De resusaap is een goed geschikt diermodel om de betrokkenheid van neurotransmittersystemen bij dergelijke modulaties te onderzoeken. Terwijl het dier een cognitieve taak uitvoert, worden single-cell registraties uitgevoerd in combinatie met lokale en tijdelijke neurofarmacologische manipulatie.Het hier beschreven systeem maakt een stabiele meting mogelijk van de activiteit van een enkel neuron, met en zonder farmacologische injecties in de directe nabijheid van de registratieplaats in een wakkere, actieve aap. Om deze procedure te starten, reinigt u de geleidingsbuisjes van het registratiesysteem door de reinigingsdraden in steriele siliconenolie te dopen en deze meerdere keren door de individuele geleidingsbuisjes te halen. Plaats vervolgens de kwartsglas-micropipet in een geleidingsbuisje van het registratiesysteem.Nadat de micropipet in het registratiesysteem is vastgezet, bevestigt u de steriele buis aan de metalen pin van de micropipet. Pas twee steriele pincetten toe om een gelijke druk op de pin en de buis uit te oefenen, om te voorkomen dat de micropipet breekt. Gebruik vervolgens secondelijm om de verbinding tussen de buis en de micropipet af te dichten.Wacht ten minste drie uur tot de lijm is uitgehard voordat u de micropipet met vloeistof vult. Plaats na de insertie van de micropipet de microelectroden in andere posities van het registratiesysteem. Verzamel vóór elke registratie de buis met de te injecteren stof en laat deze op kamertemperatuur komen indien deze gekoeld bewaard is.Breng vervolgens steriele siliconenolie aan op de opening van de geleidingsbuis en op de uiteinden van de elektroden en de micropipet om het systeem te smeren voor een soepele beweging. Controleer daarna de uiteinden van de elektroden en de micropipet onder een microscoop om er zeker van te zijn dat ze intact zijn. Lijn de elektroden en de micropipet zo uit dat ze in dezelfde mate uit de geleidingsbuizen steken.Om de elektroden en de micropipet in de nulpositie te plaatsen, schuift u deze in de geleidingsbuizen tot ze niet meer zichtbaar zijn. Stel vervolgens de diepte van de elektroden en de micropipet in de software in op nul. Vul daarna een steriele spuit met steriele zoutoplossing en voer de naald in de buis in, waarbij u erop let dat u de wand niet doorboort.Schuif de micropipet uit de geleidingsbuis om de vloeistofstroom visueel te kunnen controleren. Spoel vervolgens ten minste twee milliliter steriele zoutoplossing door de buis en de micropipet om er zeker van te zijn dat er geen lucht in de spuit of in de buis achterblijft. Oefen niet te veel druk uit op de zuiger van de spuit en zorg ervoor dat de verbinding tussen de buis en de micropipet luchtdicht is.Vul daarna een nieuwe steriele spuit met de te injecteren oplossing. Vervang de spuit met zoutoplossing door deze nieuwe spuit en zorg ervoor dat er geen lucht in het systeem terechtkomt. Om de zoutoplossing volledig uit de slang te verwijderen, spoelt u het systeem door met 250 µL van de te injecteren oplossing.Trek nu, met behulp van de aansturingssoftware voor de motor, de elektroden en de micropipet tot een diepte van ten minste 500 micrometer terug in de geleidebuizen. Laat vervolgens de ring van de geleidebuis naar de bodem van de geleidebuizen zakken om hun vaste relatieve positie te behouden. Maak de basis van het systeem schoon met ethanol, in het bijzonder op de plek waar deze de registratiekamer van de aap zal raken.Sluit vervolgens het registratiesysteem door de voorkantbeplating terug te plaatsen en de schroeven aan te draaien. Stel bij deze procedure de x-y-positie van het registratiesysteem in om het punt te bepalen waar de geleidingsbuizen de dura bereiken, binnen de chronisch geïmplanteerde registratiekamer. Zorg ervoor dat de geleidingsbuizen volledig zijn teruggetrokken.Breng vervolgens het registratiesysteem in positie en plaats de spuit in de microinjectiepomp. Schuif het beweegbare deel van de pomp tot het stevig op zijn plaats zit achter de zuiger van de spuit. Als er een druppel van de stof zichtbaar is aan de punt van de geleidingsbuisjes, verwijder deze dan voorzichtig met een steriel wattenstaafje.Monteer vervolgens het opnamesysteem stevig op de opnamekamer van de aap. Laat de geleidingsbuizen langzaam in de opnamekamer zakken tot ze de dura bereiken. Stuur daarna de elektroden aan met behulp van de software voor motorbesturing.Controleer regelmatig de impedantie van de elektroden op verschillende dieptes. Nadat de elektroden succesvol door de dura zijn gedrongen, kan de micropipet verder worden geschoven. Breng de elektroden en de micropipet naar de diepte van het betreffende interessegebied.Drijf vervolgens de elektroden en de micropipet langzaam aan totdat een elektrode dicht genoegbij is om de activiteit van een enkele unit met een goede signaal-ruisverhouding vast te leggen; houd erbij dat de registratie-elektrode en de micropipet op dezelfde diepte worden geplaatst, zodat de afstand tussen beide minimaal is. Injecteer tijdens een injectieblok een vooraf bepaalde hoeveelheid van de substantie met regelmatige intervallen, waarbij het injectievolume via de stapfunctie wordt gedefinieerd. Druk vervolgens elke minuut op de injectieknop volgens de klok van de registratiesoftware.Noteer het tijdstip en de trial waarin de stof wordt geïnjecteerd, de diepte van de elektroden en de micropipet, alsmede de hoeveelheid uitgestoten stof. Volg het injectieblok met het herstelblok, waarin geen stof wordt geïnjecteerd. Monitor en handhaaf de opnamekwaliteit van de geselecteerde enkelvoudige units tot het einde van het herstelblok.Trek na het opnemen de elektroden en de micropipet terug in de geleidingsbuizen en trek vervolgens de geleidingsbuizen handmatig terug. Verwijder daarna het opnamesysteem uit de opnamekamer van de aap. Maak vervolgens de spuit los van de injectiepomp en breng het systeem naar het voorbereidingsgebied voor reiniging.We hebben dit systeem gebruikt om farmacologische effecten op de neuronale activiteit in verschillende aandachtstoestanden te onderzoeken. Deze figuur toont het effect van scopolamine op de gemiddelde vuursnelheid van het geselecteerde neuron in elk van de drie attentiecondities. De vuursnelheid van de neuronen voor de twee ruimtelijke aandachtcondities, evenals voor de sensorische conditie, daalde kort na de eerste injectie van het injectieblok en nam tijdens het herstelblok, na een vertraging, weer toe tot hetzelfde niveau als vóór de injectie.Deze figuur toont een controlemeting van een tweede monsterneuron waarin saline werd geïnjecteerd volgens hetzelfde protocol als voor de scopolamine-injectie. Tijdens het injectieblok werd geen verandering in de vuursnelheid van het neuron waargenomen in vergelijking met het controleblok. Hier hebben we in detail geïllustreerd hoe betrouwbare, vooraf bepaald volume-injecties en hoogwaardige single-cell opnames kunnen worden uitgevoerd met een standaard drukinjectiesysteem.We hopen dat deze methode andere wetenschappers inspireert om de neuromodulatoire bijdragen aan de dynamiek van neuronale activiteit te onderzoeken.

a-pressure-injection-system-for-investigating-neuropharmacology

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Elektrofysiologische eigenschappen van de neuronale antwoorden is van belang voor het begrijpen van de hersenfunctie en voor het geleiden van de plaatsing van kleurstoffen voor route tracing. Er zijn echter vele studies uitgevoerd in verdoofde dieren. Om de hersenfunctie te begrijpen zonder verdoving, ontwikkelden we een methode om neuronale respons-eigenschappen op te nemen en te injecteren kleurstoffen in wakkere muis.

Voorbereiding van een Awake Muis voor opnemen Neurale Reacties en injecteren van Tracers

This protocol outlines the assembly and use of an injectrode for precise drug delivery into targeted brain regions of an anesthetized rat, followed by monitoring of neuronal activity through recorded electrical signals.

Drug Microinjection with Electrophysiological Recording in a Rat Brain

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Lai, J., et al. Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a microinjection-based technique for simultaneous neuronal recording and inhibition in the rat superior colliculus. The procedure involves stereotaxic targeting, skull drilling, and the insertion of an injectrode, which delivers an inhibitory neurotransmitter while recording neuronal activity. Light stimulation evokes...

Inhibition of Neuronal Activity and Its Detection Using Electrophysiology in a Rat

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de chirurgische implantatie van een hoofdbevestigingsmechanisme om neuronale activiteit in subcorticale hersenstructuren bij alerte ratten te monitoren. Het beschrijft procedures om afzonderlijke neuronen in de juxtaculaire configuratie te isoleren en om hun anatomische locaties efficiënt te identificeren.

Juxtacellular Monitoring en lokalisatie van Single neuronen in Sub-corticale hersenstructuren van Alert, Head ingetogen Ratten

Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

We presenteren een microinjectrode systeem ontworpen voor elektrofysiologie en geassisteerde levering van experimentele sondes (dat wil zeggen, nano sensoren, micro-elektroden), met optionele drug Infusion. Op grote schaal beschikbare microfluïdische componenten worden gekoppeld aan een canule met de sonde. Een stap-voor-stap protocol voor de microinjectrode constructie is inbegrepen, met resultaten tijdens infusie van muscimol in de makaak cortex.

Microinjectrode systeem voor gecombineerde geneesmiddel infusie en elektrofysiologie

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Een gedetailleerde nieuwe procedure voor functionele beeldvorming van wakkere, op het hoofd gefixeerde ratten wordt beschreven.

Hoofdimplantaten voor de neuroimaging van wakkere, op het hoofd gefixeerde ratten

Dit protocol presenteert een op microcontrollers gebaseerde gedragsbox om prepulsinhibitie (PPI) te beoordelen door versnellingsgegevens te verzamelen van een sensor onder de box. Deze gegevens evalueren sensorische poorttekorten bij sociaal geïsoleerde ratten, met een toegevoegde methode voor het synchroniseren van gegevens met neuronale activiteit om neurofysiologische studies naar gedragsstoornissen vooruit te helpen.

Het ontwikkelen van een gedragsbox voor het beoordelen van prepulsinhibitie en neurale activiteit in psychiatrische diermodellen

Leer een drukinjectiemethode voor neurofarmacologisch onderzoek bij wakke makaakaapen. Deze techniek maakt farmacologische manipulatie nabij corticale registratiesites mogelijk voor cognitieve neurowetenschap.

Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex (Video) | JoVE Journal

Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex

Meer video's verkennen