Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

Het algemene doel van deze indirecte immunofluorescentie-assay is om de lokalisatie en kwantificering van endogene en exogene centromeer-kinetochore-eiwitten te optimaliseren, inclusief centromeer-eiwit A en flag-gelabelde exogene CENP-A-eiwitten in menselijke cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe centromeer-kinetochore-eiwitten geïdentificeerd en gekwantificeerd kunnen worden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om verschillende niveaus van centromeer-kinetochore-expressie te kwantificeren, afhankelijk van de geselecteerde anafase van belang.

18 uur na het zaaien, was de gekweekte cellen één keer met PBS en voeg 500 microliter gereduceerd serummedium toe aan elke put van de zes-puts polystyreen kweekplaat. Transfecteer vervolgens de cellen in elke put met vers bereide A en B mengseloplossing en incubeer de culturen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na vier en een half uur, ververs het medium naar hoog glucose DMEM aangevuld met FBS en antibiotica en plaats de plaat terug in de celkweekincubator.

48 tot 72 uur later, aspireer het celkweekmedium en spoel de cellen één keer met PBS, waarbij het zoutoplossing langs de zijden van de kweekputten wordt toegevoegd om verstoring van de cellen te voorkomen. Bevestig vervolgens de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Aan het einde van de fixatieperiode, spoel de cellen twee keer met Kb2 buffer en permeabiliseer de monsters in Kb1 buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Spoel vervolgens de cellen één keer met Kb2 buffer en blokkeer eventuele niet-specifieke binding met de toevoeging van verse Kb2 buffer. Gebruik na vijf minuten bij kamertemperatuur pincetten om de gezaaide dekglazen uit elk van de putten te verwijderen en gebruik een hydrofobe barrièrepen om hydrofobe barrières rond elk dekglasmonster te tekenen. Breng de dekglazen over in een nieuwe zes-puts polystyreen plaat en dompel de monsters gedurende één uur bij 37 graden Celsius in het juiste primaire antilichaam.

Spoel vervolgens de cellen drie keer met Kb2 buffer en label ze met het juiste secundaire antilichaam voor nog eens een uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, spoel de monsters met vijf 6 minuten wasbeurten in Kb2 buffer. Label vervolgens de celkernen met Kb3 buffer bevattende DapE gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door één tot twee wasbeurten in Kb2 buffer en het opnieuw vullen van de putten met Kb2 buffer.

Plaats nu een druppel montagemedium in het midden van een microscoopglas voor elk dekglas van cellen en verwijder eventueel vocht van de celmonsters. Plaats tenslotte elke monster voorzichtig op het midden van een van de voorbereide microscoopglazen en verwijder eventueel overtollig montagemedium met een papieren handdoek. Zoals waargenomen in dit representatieve experiment, waren de niveaus van endogene CENP-A eiwitexpressie in de totale cellysaten van CUL4A siRNA getransfecteerde cellen vergelijkbaar met de niveaus van CENP-A expressie in Luciferase siRNA getransfecteerde cellen.

Verder waren de eiwitniveaus van endogene CENP-A in de totale cellysaten van RBX1 siRNA getransfecteerde cellen vergelijkbaar met de endogene CENP-A niveaus van de Luciferase siRNA getransfecteerde cellen, wat suggereert dat de CUL4A RBX1 E3 ligase vereist is voor de lokalisatie van CENP-A naar de centromeren. CENP-A lysine mutanten verliezen hun vermogen om zich binnen de centromeren te lokaliseren, wat suggereert dat CENP-A K124 ubiquitylatie essentieel is voor de lokalisatie van CENP-A naar de centromeren. Belangrijk is dat exogene monoubiquitine fusie van CENP-A eiwit de delocalisatie CENP-A K124R mutant redde, waardoor het eiwit terugging naar zijn centromerische locatie.

Eenmaal onder de knie, kunnen de celfixatie- en immunofluorescente kleuringsprocedures in vijf tot zes uur worden voltooid als ze goed worden uitgevoerd. Vergeet niet om alle oplossingen voorzichtig op de zijden van de putten aan te brengen, zodat de cellen niet van hun dekglazen worden losgemaakt tijdens het spoelen of onderdompelen van de monsters. Vergeet niet dat het werken met verwarmd paraformaldehyde buiten een geventileerde ruimte of dat brandbare materialen in de buurt van vuur buitengewoon gevaarlijk kan zijn en dat de juiste voorzorgsmaatregelen altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.