Name: Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Leer indirecte immunofluorescentie om centromeer-kinetochoor eiwitten in menselijke cellen te lokaliseren en te kwantificeren. Deze methode optimaliseert detectie van endogene en exogene CENP-A eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​GM68418.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

De laatste jaren zijn veel studies verschillende kwantitatieve microscopie assays ontwikkeld voor gefixeerde cellen. 42 Progress in centromeer-kinetochoor biologie vereist vaak een begrip van de centromeer-specifieke of kinetochoor specifieke functie van eiwitten waarvan subcellulaire ruimtelijk-temporele regulering weerspiegelt de veranderende functies deze eiwitten tijdens celcyclus. Daarom hier ontwikkelden wij werkwijzen IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat de relatieve niveaus ...

&quot;Centromeren&quot; werden klassiek gedefinieerd als gebieden onderdrukt meiotische recombinatie in de genetica en later gezien als het belangrijkste vernauwing van mitotische chromosomen, die een essentiële rol speelt nauwkeurige chromosoomsegregatie in mitose. &quot;Kinetochoren&quot; werden beschreven als het meerlagige structuren die binden aan microtubuli aan het oppervlak centromeren, zoals aangetoond door elektronenmicroscopie; &quot;Kinetochoren&quot; werden later gedefinieerd als macromoleculaire complex localiseert in het centromeer van mitotische chromosomen. Ondanks een dramatisch verschil in centromeer DNA-sequenties bij vertebraten, kinetochoor structuur en samenstelling sterk geconserveerd. Een dynamische interactie tussen spindel microtubuli en het kinetochoor vereist voor trouwe segregatie van chromosomen tijdens de mitose en defecten in centromeer-kinetochoor functie leidt tot aneuploïdie en daardoor kanker. Het centromeer in de meeste eukaryotengeen gedefinieerde DNA-sequentie, maar is samengesteld uit grote arrays (0,3-5 Mb) repeterende alphoid DNA bestaat uit 171 bp α-satelliet DNA. Behalve in gist, wordt centromeer identiteit bereikt niet de DNA-sequentie, maar door de aanwezigheid van een speciale nucleosomen die de histon H3 variant CenH3 bevat (centromeer eiwit A [CENP-A] bij de mens). 5 CENP-A nucleosomen lokaliseren de binnenste plaat van zoogdier kinetochoren 7 en binden aan de 171-bp α-satelliet DNA. Actieve centromeres vereisen CENP-A-bevattende nucleosomen voor de aanwerving van een constitutieve-centromeer geassocieerd netwerk (CKan) en de kinetochoor eiwitten te leiden, die samen reguleren van de aanhechting van de chromosomen van de mitotische spindel en de daarop volgende cyclus progressie door de spil checkpoint. In het licht van het bovenstaande bewijs heeft CENP-A voorgesteld om de epigenetische merkteken van het centromeer 8 zijn; echter, het proces waardoor CENP-A opgenomen into centromeer DNA en de factoren die tot deze opname nog niet goed gekarakteriseerd. Een korte-centromeer doeldomein (CATD) ligt in het histon voudige regio CENP-A, en vervanging van het overeenkomstige gebied van H3 de CATD zorgdragen om H3 het centromeer. 9 Verschillende studies suggereerde functionele rol voor post-translationele modificatie (PTM) van CENP-A 12-16; De moleculaire mechanismen van deze PTMs van CENP-A in de rekrutering van centromeren nog niet opgehelderd. We hebben eerder gemeld dat CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase activiteit is vereist voor CENP-A K124 ubiquitinering en lokalisatie van CENP-A naar centromeres. 17 De ontdekking en karakterisering van kinetochore eiwitten hebben geleid tot nieuwe inzichten over chromosoomscheiding. 18 meer dan 100 kinetochoor componenten zijn in gewervelde cellen die door verschillende benaderingen. 19,20 Een onderstaande hoe kinetochoren assembleren en functie komt ook uit het karakteriseren van de cellulaire functies van elke centromeer-kinetochoor eiwitten en eiwit-eiwit netwerk in cellen. 19 Directe visualisatie en geavanceerde imaging werkwijzen fluorescentiemicroscopie bieden opmerkelijke resolutie van centromeer-kinetochore componenten en laat directe observatie van de specifieke moleculaire componenten van de centromeren en kinetochoren. Bovendien, de methoden van indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring met behulp van specifieke antilichamen zijn cruciaal voor deze waarnemingen. Ondanks talrijke rapporten over IIF protocollen weinig besproken problemen specifieke centromeer-kinetochore eiwitten. 1-4 Zo ontwikkelen en rapporteringsmethoden van IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat elke centromeer-kinetochoor eiwit is zeer belangrijk. In IIF kleuring, moet men overgaan tot de kleuringsprotocol verlies van het eiwit van belang voorkomen ofde rest van de cel. Echter, fixatie vernietigt antigene plaatsen af en verschillende antilichaam-antigeen combinaties werken slecht met een fixatief, maar zeer goed met elkaar, en 21 keuze fixeermiddel hangt grotendeels af van de eiwit (ten) van belang. Daarom verschillende fixerende methoden zijn van cruciaal belang in IIF kleuring van centromeer-kinetochoor eiwitten. Hier geoptimaliseerde werkwijzen voor indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring en een test om lokalisatie van endogeen centromeer-kinetochore eiwitten, waaronder CENP-A en Flag-tagged exogene CENP-A eiwitten en kwantificering van deze eiwitten in menselijke cellen aanpakken ontwikkeld. Deze methoden kunnen worden toegepast op de analyse van centromeer-kinetochore eiwitten in andere species.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>transfectiereagens I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>transfectiereagens II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Gereduceerd serum medium, opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>High-glucose DMEM (Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>high-glucose DMEM, opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fetaal bovien serum)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine, 0,1% w/v, in water</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Steriele weefselkweekkwaliteit water&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Dekglas (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-well polystyreen plaat&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Hydrofobe barrière pen (voor een waterafstotende barrière in immunofluorescente kleuring)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol voor mitotische celanalyse</td></tr><tr><td>TN-16, microtubule inhibitor (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 voor mitotische celanalyse</td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Blokkader</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Detergens voor permeabilisatie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fixatiereagens</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Voor nucleaire kleuring</td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Voor montagemedium</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro slides&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CENP-A antibody</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF, methanol/aceton fixatie)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixatie)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B antibody&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF, methanol/aceton fixatie)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixatie)</td></tr><tr><td>Anti-centromere antibody (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Menselijke centromeer antiserum; verdunningsverhouding van 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H antibody</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H antibody</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-I antibody</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anti-KNL1 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 antibody</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 antibody</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Ska1 antibody</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Flag antibody</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-Flag antibody</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A antibody</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anti-RBX1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (Affiniteit-gezuiverd secundair antilichaam)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (Affiniteit-gezuiverd secundair antilichaam)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam

immunofluorescentie analyse van endogene en exogene centromere-kinetochoor eiwitten

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeren" en "kinetochoren" verwijzen naar de plaats waar chromosomen zich tijdens de celdeling met de spindel verbinden. Directe visualisatie van centromeer-kinetochoor-eiwitten tijdens de celcyclus blijft een fundamenteel hulpmiddel bij het onderzoek naar de mechanismen van deze eiwitten. Geavanceerde beeldvormingsmethoden in fluorescentiemicroscopie bieden opmerkelijke resolutie van centromeer-kinetochoor-componenten en maken directe observatie van specifieke moleculaire componenten van de centromeren en kinetochooren mogelijk. Bovendien zijn methoden voor indirecte immunofluorescente (IIF) kleuring met specifieke antilichamen cruciaal voor deze observaties. Echter, ondanks talrijke rapporten over IIF-protocollen, hebben weinigen in detail gediscussieerd over problemen met specifieke centromeer-kinetochoor-eiwitten.1-4 Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om endogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te kleuren door gebruik te maken van paraformaldehyde-fixatie en IIF-kleuring. Verder beschrijven we protocollen om Flag-gelabelde exogene CENP-A-eiwitten in menselijke cellen te detecteren die zijn onderworpen aan aceton- of methanol-fixatie. Deze methoden zijn nuttig voor het detecteren en kwantificeren van endogene centromeer-kinetochoor-eiwitten en Flag-gelabelde CENP-A-eiwitten, inclusief die in menselijke cellen.

Immunofluorescentie analyse van endogene CENP-A ondersteunt de hypothese dat CUL4A-E3 ligase nodig voor het lokaliseren van CENP-A centromeren Onze recente studies is gebleken dat CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase activiteit is vereist voor ubiquitinering van lysine 124 (K124) op CENP-A en lokalisatie van CENP-A centromeren. 17 Aanvankelijk interfase-centromeer complex (Icen) werd geïsoleerd door anti-CENP-a: natieve chromatine immunoprecipitatie, 32-34</...

Hier beschrijven we protocollen om endogene en exogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te detecteren en deze eiwitniveaus op centromeren-kinetochoren te kwantificeren door indirecte immunofluorescente kleuring door het gebruik van fixatie (paraformaldehyde, aceton of methanol fixatie).

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Het algemene doel van deze indirecte immunofluorescentie-assay is het optimaliseren van de lokalisatie en kwantificering van endogene en exogene centromeer-kinetochore proteïnen, waaronder centromeerproteïne A en flag-getagde exogene CENP-A proteïnen in menselijke cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het identificeren en kwantificeren van centromeer-kinetochore proteïnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om verschillende niveaus van centromeer-kinetochore expressie te kwantificeren, afhankelijk van de geselecteerde anafase van belang.Was 18 uur na het uitplaten de gekweekte cellen één keer met PBS en voeg 500 microliters serumarm medium toe aan elke put van de zes-well polystyreen kweekplaat. Transfect vervolgens de cellen in elke put met een vers bereide mengoplossing van A en B en incubeer de culturen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang na vier en een half uur het medium door high glucose DMEM aangevuld met FBS en antibiotica en plaats de plaat terug in de cellenkweekincubator.Aspirer na 48 tot 72 uur het celcultuurmedium en spoel de cellen één keer met PBS, waarbij de zoutoplossing l

immunofluorescence-analysis-endogenous-exogenous-centromere

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.

Imaging Centrosomes in Fly Testikels

Hier wordt een nieuwe kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld om veranderingen in het niveau van een specifiek eiwit op centrosomen te meten door de fluorescentie-intensiteit van dat eiwit te normaliseren naar die van een geschikte interne standaard.

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

We hebben een strategie om te zuiveren en het beeld van een groot aantal centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor super-resolutie microscopie en single-deeltje gemiddeld ontwikkeld.

Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

We rapporteren een DNA-FISH metafaseverspreidingsprotocol dat visueel het aantal locuskopieën en locatie binnen het genoom detecteert. Deze aanpak maakt enkelcelresolutie van amplificatietoestanden mogelijk, specifiek in kankercellijnen die extrachromosomaal DNA bevatten en gebieden homogeen kleuren.

DNA-FISH-metafase verspreidt zich om extrachromosomaal DNA te onderscheiden van homogene kleuringsgebieden in menselijke kankercellijnen

Leer indirecte immunofluorescentie om centromeer-kinetochoor eiwitten in menselijke cellen te lokaliseren en te kwantificeren. Deze methode optimaliseert detectie van endogene en exogene CENP-A eiwitten.

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

Meer video's verkennen