Name: Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer een gecombineerde glycomics- en proteomics-zuiveringsstrategie met LC-MS/MS voor gelijktijdige kwantificering van N-glycanen en eiwitten uit plasma. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid voor grootschalige biologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd genereus gefinancierd door de NIH NCI IMAT-programma Grant R33 (CA147988-02), de NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology bij NC State Grant (T32GM008776), het US Dept. of Education GAANN Fellowship-programma in Molecular Biotechnology bij NC State Grant (P200A140020), de W.M. Keck Foundation en North Carolina State University. Hennenplasma werd verkregen met de hulp van Dr. James N. Petitte en Rebecca Wysocky in het NC State University Dept. of Poultry Science.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
<li>Apweiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniProt%3A+the+Universal+Protein+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniProt: the Universal Protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).</li>
<li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

We hebben een samenwerkingsrelatie met Cambridge Isotope Laboratories (CIL) om de P2GPN-reagentia en -technologie te verspreiden naar de bredere wetenschappelijke gemeenschap in de vorm van een product (GTK-1000). We ontvangen echter geen enkele opbrengst op basis van de verkoop van dit product.

Hoge-doorvoer kwantitatieve methoden zijn nodig om routinematige glycan-analyse te vergemakkelijken. De afgelopen dertig jaar is glycomische analyse beperkt gebleven tot een subset van onderzoeksgroepen, ondanks de belangrijkheid ervan in ziekte, klinische toepassingen en farmaceutische producten. De FANGS-P2GPN-zuiverings- en taggingmethode voor glycomics en proteomics voert dezelfde analyse uit op een enkele aliquot van een monster, waardoor de kosten van benodigdheden en de hoeveelheid benodigde materialen worden verminderd (bijzonder belangrijk bij onderzoek met mensen en muizen). Bovendien zijn inspanningen om de variabiliteit in voorbereidingen te minimaliseren van cruciaal belang, aangezien elke extra stap bijdraagt aan fouten, wat belangrijke maar zeldzame veranderingen in case-control-studies kan maskeren. De koppeling van FANGS aan hydrofobe hydrazide tagging maakt het mogelijk om eiwit- en glycanmonsters op dezelfde RPLC-kolom te laten lopen, verbetert de glycanisatie, zorgt voor relatieve kwantificering en kan kwantitatief worden toegepast op plasma.
Voor N-glycan-analyse is het essentieel om het voorgestelde niveau van PNGase F te gebruiken om volledige de-glycosylering te bereiken. Hoewel glycanen blootstaan aan oplosmiddelen, helpen denaturatie van eiwitten en overtollig enzym om een efficiënte en volledige splitsing te garanderen. Voor nauwkeurige kwantificering van de glycanen is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn gedroogd na derivatisering om de reactie te stoppen en kruisreacties te voorkomen bij het mengen van de NAT- en SIL-soorten. Ten slotte is het tijdstip van de stappen van cruciaal belang bij het uitbreiden van de workflow naar glycosit-analyse om niet-specifieke deamidering te minimaliseren. De aangepaste protocollen die zijn voorgesteld voor gecombineerde glycomics- en proteomics-analyse werken consistent wanneer ze overeenkomstig worden uitgevoerd.
De workflow bereikt nauwkeurige relatieve kwantificering van N-glycanen uit plasma in vergelijking met de gouden standaard, SPE-methode. Er is geen duidelijke voorkeur in de typen glycanen die worden geëxtraheerd in termen van moleculair gewicht, hydrofiliciteit en samenstellingsstructuur. Hoewel we de kwalitatieve analyse van O-gekoppelde glycanen niet hebben onderzocht, verwachten we dat FANGS de toevoeging van een β-eliminatie stap post-PNGase F-vertering van N-gekoppelde glycanen zou kunnen ondersteunen. Procedures zouden echter aanzienlijke aanpassingen vereisen voor reiniging van reagentia voorafgaand aan massaspectrometrie, en peptidenanalyse zal aanzienlijk worden beïnvloed. Voor proteomics wordt dezelfde diepte van proteoom-dekking bereikt in vergelijking met traditionele FASP-methoden. Belangrijk is dat methoden een minimale valse ontdekkingsgraad bereiken voor N-glycandeamidering. Hoewel de methode compatibel is met 18O-labeling van Asn tijdens de PNGase-verteringsstap22,23, suggereert de lage valse ontdekkingsgraad voor glycosyleringsplaatsen dat dit misschien niet nodig is, waardoor verdere kosten en complexiteit worden verminderd.
Het proteoom is niet verrijkt met glycoproteïnen in deze methode, wat zowel voor- als nadelen heeft. Bepaalde zeldzame glycoproteïnen worden mogelijk niet gedetecteerd in de analyse. De bezetting van geglycosyleerde plaatsen per eiwit kan echter worden vergeleken tussen biologische monsters. Bovendien wordt de fout en bias geïntroduceerd door lectin-affiniteitszuivering of chemische verrijking geëlimineerd. Kortom, de koppeling van FANGS aan de individualiteit normalisatie bij het labelen met glycanhydrazide-tagsstrategie resulteert in een vereenvoudigde, kwantitatieve, hoge-doorvoer methode voor de tandem-analyse van het glycoom en proteoom met groot potentieel voor toepassing in klinische case-control-studies.

Op het gebied van proteomica, filter geholpen monstervoorbereiding (FASP) is wijd op zijn vermogen om de hoeveelheid uitgangsmateriaal minimaliseren monstervoorbereiding artefacten te verminderen en te maximaliseren monsterdoorvoer 1 aangenomen. Echter dergelijke werkwijze nog ontstaan ​​en grip te krijgen op het gebied van glycomics. Ontwikkeling van high-throughput, zijn kwantitatieve workflows nodig vanwege de integrale rol van glycosylering in biologische verdediging en de modulatie door kanker of ziekten 2,3. Bij zoogdieren worden N-glycanen samengesteld uit zich herhalende saccharide eenheden (hexosen (Hex), hexosamines (HexNAc) siaalzuren (NeuAc) en fucoses (Fuc)), die een kernstructuur versieren (Hex 3 HexNAc 2) 4 covalent gebonden asparagine. Hoewel de glycospace aanzienlijk groot als isomeren worden geteld (&gt; 10 12), is vrij klein op een samenstelling basis en molecuulgewichten gewoonlijk variëren van 1,000-8,000 Da 5 &lt;/ Sup&gt;. De samenstelling homogeniteit van de klasse en de hydrofiliciteit van glycanen vormen unieke uitdagingen voor zuivering, scheiding en massaspectrometrie (MS) werkstromen 6. Traditioneel worden N-glycanen geknipt van eiwitten of peptiden met peptide N -glycosidase F (PNGase F) en vervolgens verrijkt door lectine-affiniteitschromatografie 7, gefotografeerd door hydrazide kralen 8 of gezuiverd door vastefase-extractie (SPE) 9,10. Hoewel deze methoden zijn zeer effectief, ze introduceren extra stappen voor ontzouting en beperken het aantal monsters tegelijkertijd verwerkt. In de afgelopen tien jaar hebben een aantal high-throughput platform voor glycomics voorgesteld. Kim et al. Publiceerde een semi-automatische methode waarbij een vacuümgestuurde, SPE 96-well plaat 11. Als alternatief kan een methode affiniteit-filter (N -glyco-FASP) werd ontwikkeld door de Mann-groep, die de oorspronkelijke derivatisering van de fi vereistefilter met een samenstelling van 12 lectinen. Tenslotte stelt het Thomas-Oates groep een semi-kwantitatieve methode, het filter Geholpen N-glycan Separation (HOEKTANDEN), waarbij de samenstelling smalle afmeting van de glycospace 13 benut. Zich baserend op moleculair gewicht cut-off filters, werden kleine verontreinigingen eerst gewassen te verliezen en daarna werden de N-glycanen verteerd en uitgewassen. Gedeglycosyleerde eiwitten blijven op de filter in dit protocol en kan worden onderworpen aan in-line FASP. Identificatie en kwantificering van glycanen door electrospray ionisatie (ESI) MS vereist off-line scheidingen voor (gedeeltelijke) oplossing van isomeren en derivatisering voor detectie van lage-voorkomende soort. Etikettering in de individualiteit wanneer normaliseren met glycan hydrazide labels strategie verleent compatibiliteit met reverse-fase-vloeistofchromatografie (RPLC) 14,15. Het 4-fenethyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrofobe tag bemiddelt de hydrofiliciteit van de glycanen, enhancing ionisatie van gemiddeld vier keer 16. Hoewel andere technieken, zoals permethylation 17 of amine-reactieve tagging chemie 18, bieden soortgelijke voordelen, in het hydrazide reactie glycanen omgezet 1: 1 stoichiometrisch in gemakkelijke omstandigheden. Relatieve kwantificering bereikt door tandem analyse van monsters gederivatiseerd met natief (NAT) of 13 C 6 stabiele isotooplabels (SIL). De volgende methode evolueert HOEKTANDEN voor plasma-toepassingen en koppels naar de P2GPN hydrofobe tag voor nauwkeurige relatieve kwantificering. Bovendien werd ontworpen om jachtgeweer proteomics, deamidering profielen en kwantitatieve glycomics voeren op een enkele portie van het monster, zonder de integriteit van de analyses.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur (50%)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Burdick &amp; Jackson&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagens</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>B6916</td><td>Alternatief: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Alternatieve centrifuges die 14.000 x g bereiken zijn geschikt</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp;M in oplossing</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Alternatieve nano- of ultra hogedruk LC's produceren vergelijkbare gegevens, zoals: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters).</td></tr><tr><td>Floating Tube Rack</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuïne</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Alternatieve incubatoren die 56&nbsp;&deg;C bereiken zijn geschikt</td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE Magnetron</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Elke magnetron met instelbare vermogensinstellingen is geschikt</td></tr><tr><td>INLIGHT Glycan Tagging Kit&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>Het INLIGHT-kit biedt NAT- en SIL-versies van het P2GPN-reagens.</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2,6 mM, 100 &Aring;, C18 bulk stationaire fase</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Bulk Media</td><td>Alternatief: Elke C18 stationaire fase 5&nbsp;mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon Software en Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternatief: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Burdick &amp; Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Self-Pack Column: 360&nbsp;&#956;m, OD 75&nbsp;&#956;m ID, 15&nbsp;&#956;m tip, niet-gecoat, 5 per doos, 50 cm</td><td>New Objective</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (glycerol-vrij), 75.000&nbsp;eenheden/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Massaspectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Alternatieve hoge massa nauwkeurigheid (5&nbsp;ppm) massaspectrometers zullen vergelijkbare gegevens leveren</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine uit varkens pancreas</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Alternatieve vacuüm concentratoren zijn geschikt</td></tr><tr><td>Vivacon 500 30 kDa Filters&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>Alternatief: Amicon Ultra 0,5 Centrifugal Filter Units met Ultracel-10&nbsp;kDa Membraan (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Water, HPLC grade</td><td>Burdick &amp; Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Water, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>De toevoeging van 18O in de PNGase F verteringstap is optioneel en is mogelijk niet nodig voor deamideringsstudies die met 95% zekerheid zijn voltooid</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

een kwantitatieve glycomics en proteomics combined purification strategy

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Er is een groeiende wens in de biologische en klinische wetenschappen om meerdere klassen van biomoleculen te integreren en te correleren om biologie te ontrafelen, paden te definiëren, behandeling te verbeteren, ziekte te begrijpen en biomarkerontdekking te ondersteunen. N-gekoppelde glycosylering is een van de belangrijkste en robuuste post-translationele modificaties op eiwitten en reguleert kritieke celfuncties zoals signalering, adhesie en enzymatische functie. Analytische technieken om N-glycanen te zuiveren en te analyseren zijn de afgelopen tien jaar relatief statisch gebleven. Hoewel nauwkeurig en effectief, vereisen ze gewoonlijk aanzienlijke expertise en middelen. Hoewel enkele hoge-doorvoer zuiveringsschema's zijn ontwikkeld, hebben ze nog geen brede acceptatie gevonden en zijn vaak afhankelijk van de verrijking van glycopeptiden. Een veelbelovende methode, ontwikkeld door Thomas-Oates et al., filterondersteunde N-glycan-scheiding (FANGS), werd kwalitatief aangetoond op weefsels. Hierin hebben we FANGS aangepast aan plasma en gekoppeld aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met de glycanhydrazide-tags strategie om nauwkeurige relatieve kwantificering door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en verbeterde elektrospray-ionisatie te bereiken. Verder hebben we nieuwe functionaliteit ontworpen in het protocol door tandem, shotgun-proteomics en glycosyleringsplaatsanalyse op kipplasma te bereiken. We toonden aan dat N-glycanen, gezuiverd op filter en gederivatiseerd door hydrofobe hydrazide-tags, vergelijkbaar waren in termen van abundantie en klasse met die door vastefase-extractie (SPE); de laatste wordt beschouwd als een gouden standaard in het veld. Belangrijk is dat de variabiliteit in de twee protocollen niet statistisch verschillend was. Proteomische gegevens die samen met glycomische gegevens werden verzameld, hadden dezelfde diepte vergeleken met een standaard trypsine-vertering. Peptideendeamidatie wordt geminimaliseerd in het protocol, waardoor niet-specifieke deamidatie die wordt gedetecteerd bij glycosyleringsmotieven wordt beperkt. Dit maakte directe glycosyleringsplaatsanalyse mogelijk, hoewel het protocol ook 18O-plaatslabeling kan accommoderen. Al met al hebben we een nieuw in-line, hoog-doorvoer, onbevooroordeeld, filtergebaseerd protocol voor kwantitatieve glycomics- en proteomicsanalyse gedemonstreerd.

<img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Figuur 1:. De regeling van de HOEKTANDEN-P2GPN hydrofobe tagging gekoppeld methode (methode A) voor gecombineerde proteomics en glycomics analyse wordt gegeven Stappen die verschillen tussen glycomics-enige vorm van verwerking en tandem glycomics en proteomics analyse, met glycosylatieplaats identificatie, worden gemarkeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> De in-line proteoomanalyse en glycomics, filter-gebaseerde P2GPN hydrofobe tagging methode (methode A) werd gevalideerd voor de identificatie, kwantificering en molecuulgewicht voorspanning waarbij gebundelde hen plasmamonsters (Figuur 1). Voor uitsluitend glycomics experimenten, glycanen onderlinge vergelijkingen in de abundanties van N gewonnen door MethodA Carbograph SPE (gouden standaard, methode B) werden gemaakt (figuur 2). Er waren geen significante verschillen in de dichtheden van glycanen tussen beide methoden. De intra-variabiliteit werd ook beoordeeld door het kwantificeren van de SIL: NAT verhouding glycanen geëxtraheerd volgens dezelfde werkwijze. De log 2 -distributions van beide methoden waren Gaussian, gecentreerd op nul en niet significant verschillend (Figuur 3A-B). Het molecuulgewicht varieert tussen de twee protocollen volledig overlappende, wat suggereert dat het filter niet discrimineren N-glycanen basis van moleculaire gewichtsbereik en hydrofiliciteit (figuur 4). <img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Figuur 2: Een equimolair mengsel van NAT en SIL N-glycanen geëxtraheerd volgens werkwijze A of werkwijze B werd bereid uit 2,5 pl hen plasma (N = 4) De monsters waren anal.yzed door UPLC-MS volgens de aanbevolen parameters in paragraaf 6. De abundances per glycan voorgesteld, in elke NAT / SIL kanaal, berekend door integratie van de oppervlakte onder de geëxtraheerde ionenchromatogram (MMA = 3 ppm) en corrigeert de moleculaire gewicht overlap, en aanpassen door de TGNF. Deze ratio&#39;s worden getoond met hun standaard fouten. De dichtheden van Methode B: Methode A N-glycanen waren niet significant verschillend (p&gt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Figuur 3: De intra-variabiliteit in de (A) Methode A (N = 133) of (B) Methode B (N = 123) strategieën vergeleken. NAT en SIL equimolaire mengsels van N-glycanen, uit dezelfde extractie schemaWerden geanalyseerd via drie technische replicaten. De log 2 -distributions werden gecentreerd op nul en waren niet significant verschillend tussen de twee workflows. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Figuur 4: Het molecuulgewicht varieert van glycanen van elke strategie vergeleken. De twee workflows leverde glycanen verspreid over hetzelfde gewicht bereik moleculaire. N-glycanen aangetroffen in een protocol ten opzichte van de andere viel net boven de detectielimiet (1 x 10 5 overvloed) en komen niet overeen met systematische vooringenomenheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.binnen-page = &quot;1&quot;&gt; Behoud van het gedeglycosyleerde eiwitten door het molecuulgewicht filter ingeschakeld in-line proteoom brede analyse en glycosyleringsplaats identificatie. Meerdere protocollen voor gecombineerde zuivering van glycanen en eiwitten werden vergeleken met een traditionele FASP preparaat zonder deglycosylering (Tabel 5). Onze typische 18 uur filter gebaseerd PNGase F vertering, gevolgd door FASP trypsine digestie (Std protocol) geleid tot aanzienlijke niveaus van niet-specifieke deamidering, die kunnen interfereren met de identificatie van glycosites. Daarom is een methode waarbij een kortere incubatietijd bij verhoogde temperatuur (50 ° C) en een PNGase F piek in stap (SPI protocol) werd onderzocht als alternatief, samen met een microgolfontsluiting protocol (MD protocol), die niet-minimaliseren specifieke deamidering. De glycanen waargenomen in de nieuwe digestiemethoden waren niet significant verschillend in samenstelling of abundanties van de standaard 18 uur, 37 ° C filter PNGase F digest ( <strong&gt; Figuur 5). Gecombineerd met een korte trypsine incubatie werd aspecifieke deamidering aanzienlijk verminderd, met een vals positieven voor glycosites &lt;5% (Tabel 5). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> eiwitten </td><td></td><td colspan="4"> peptiden </td><td></td><td colspan="4"> gedeamideerde Peptiden </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glycoproteïnen </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tabel 5: Vergelijkingen van proteomics data van een standaard trypsine verteren ten opzichte van de in-line HOEKTANDEN-P2GPN tagging methode werden voorbereidingen getroffen werden uitgevoerd met (+) en zonder (-) PNGase F op de achtergrond de tarieven van de niet-specifieke deamidering en de raming te bepalen glycosite vals positieve tarieven. Eiwitten werden geïdentificeerd met 1% valse ontdekking tarief (FDR); peptiden werden gefilterd op basis van peptide vertrouwen &quot;hoog&quot; in Proteome Discoverer 1,4 (q &lt;0,01); glycosites werden identified basis van unieke sequenties die deamidering van het geconserveerde motief glycosylering (NXS / T); en glycoproteïnen werden gedefinieerd als geïdentificeerde eiwitten die ten minste één geïdentificeerde glycosite. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Figuur 5: Verkorte protocollen voor glycanen werden ontwikkeld om deaminering in de monsters te minimaliseren en vergeleken met de 18 uur HOEKTANDEN PNGase F vertering. De gemiddelde verschillen waren in dichtheden 10% en 5% van de MD (2.2.3) en SPI (2.2.2) protocollen, respectievelijk. Van de 48 glycanen geïdentificeerd, 90% weergegeven minder dan 1,5-voudige variatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Het algemene doel van deze workflow op basis van een enkel filter is om N-glycanen en eiwitten in tandem eenvoudig en kwantitatief te zuiveren uit biologische monsters voor massaspectrometrische analyse. De schaalbaarheid, snelheid en analytische reproduceerbaarheid van deze methode maken deze direct toegankelijk voor biologische massaspectrometrie-laboratoria wat betreft middelen en vaardigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om glycomica, de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen en proteomics-vraagstukken gelijktijdig te onderzoeken in grootschalige high-throughput biologische studies.We hebben de uitdagingen van N-glycaanmetingen overwonnen door deze methode te koppelen aan een op massaspectrometrie afgestemde derivatiseringsstrategie, wat resulteerde in een nauwkeurige, relatieve kwantificering tussen kanker- en controletoestanden. Door de verminderde analytische variabiliteit kunnen nieuwe biologische interacties tussen het glycoom en het proteoom worden opgehelderd, wat belangrijke inzichten in ziektebeelden en nieuwe mogelijkheden voor de ontdekking van biomarkers oplevert. Begin met het laden van 2.5 µL plasma op een filter.Voeg vervolgens 2 µL van een 1M dithiothreitol-oplossing toe aan elk monster in het filter. Verdun het monster met 200 µL van een 100-mM ammoniumbicarbonaat PNGase-digestiebuffer. Sluit de monsterbuis van het filter af en vortex deze lichtjes, waarbij u er zorg voor draagt dat het filter niet uit zijn houder raakt.Incubeer het monster 30 minuten bij 56 °C om de eiwitten en glycoproteïnen te denatureren. Voeg voor de alkylering van de monsters 50 µL 1M iodoacetamide toe om een eindconcentratie van ongeveer 200 mM te verkrijgen. Incubeer vervolgens 60 minuten bij 37 °C.Concentreer het gedenatureerde glycoproteïne op het filter door de monsters 40 minuten lang te centrifugeren bij 14, 000 x g voordat het filtraat wordt weggegooid. Was het monster met 100 µL PNGase-digestiebuffer. Concentreer het glycoproteïne op het filter en gooi het filtraat weg.Herhaal de was- en concentratiestap twee keer voor een totaal van drie keer, zodat er een concentraat in het dode volume van het filter ontstaat. Gooi al het doorstroomvolume en het opvangbuisje weg zodra de wasstappen zijn voltooid. Voeg vervolgens 2 µL glycerolvrije peptide N-glycosidase F of PNGase F toe aan het filter nadat dit is overgebracht naar een nieuw opvangbuisje.Voeg 98 µL PNGase-digestiebuffer toe zodat het totale volume 100 µL wordt, en pipetteer voorzichtig op en neer op het filter om te mengen. Voor het spike-in-digestieprotocol worden de monsters 2 uur geïncubeerd bij 50 °C. Verwijder de monsters snel en voeg 2 µL glycerolvrije PNGase F toe. Vortex de monsters kort gedurende 1 tot 2 seconden om te mengen.Incubeer de monsters nog 2 uur bij 50 °C. Nadat de glycanen zijn geëlueerd door het monster te centrifugeren bij 20 °C, voegt u 100 µL PNGase-digestiebuffer toe aan het filter en centrifugeert u opnieuw. Verzamel de wassing met de resterende N-gekoppelde glycanen in hetzelfde opvangbuisje als het eluaat.Herhaal dit proces twee keer, verwijder vervolgens het filter en plaats dit in een nieuw opvangbuisje voor de proteomiek-preparatie. Incubeer de glycaanmonsters daarna in de vriezer bij 80 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten totdat ze bevroren zijn. Droog de monsters vervolgens volledig bij kamertemperatuur in een vacuümconcentrator gedurende 4 tot 6 uur.Spoel het filter met de gedegymineerde peptiden af met 400 µL 8M ureumbuffer. Sluit het opvangbuisje af en vortex kort om te mengen. Concentreer de peptiden op het filter voordat u al het doorloopvolume weggooit.Nadat de wasbeurt met ureumbuffer nog twee keer is herhaald, spoelt u het filter met de gedeamineerde peptiden spoelt u met Trypsin digest buffer. Sluit het opvangbuisje af en vortex licht om te mengen voordat u de vloeistof opnieuw op het filter concentreert zoals voorheen. Gooi al het filtraat weg en herhaal dit nog 2 keer voor in totaal 3 wasbeurten met Trypsin digest buffer.Verzamel alle toekomstige eluentia en wasstappen in een nieuw opvangkolfje. Voeg vervolgens 50 microliters porcine-gemodificeerd Trypsin toe in een Trypsin-proteïne-verhouding van 1:50 voor discovery proteomics of een Trypsin-proteïne-verhouding van 1:5 voor kwantitatieve proteomics-experimenten. Sluit het opvangkolfje af en vortex lichtjes om te mengen.Na het incuberen van de monsters bij 37 °C gedurende 2 uur, moeten de monsters snel worden verwijderd en aangevuld met nog eens 50 µL Trypsine in de juiste Trypsine-proteïneverhouding. Vortex de monsters kort gedurende 1 tot 2 seconden om te mengen. Incubeer vervolgens nogmaals 2 uur bij 50 °C.Na het elueren van de peptiden door centrifugatie zoals voorheen gedurende 20 minuten, worden de resterende peptiden van het filter gespoeld met Quench-buffer. Elueer deze van het filter door centrifugatie zoals voorheen gedurende 15 minuten. Na het kwantificeren van de peptideconcentratie in de monsters, worden de peptide-monsters geïncubeerd in de vriezer op 80 degree Celsius tot ze bevroren zijn.Droog vervolgens volledig bij kamertemperatuur in een vacuümconcentrator gedurende 4 tot 6 uur. Los daarna de tryptische eiwitten vlak voor de vloeistofchromatografie-massaspectrometrie of LCMS-analyse op in Mobiele fase A tot de gewenste concentratie. Tryptische peptideconcentraties uit 2,5 µL plasma variëren van 100 tot 300 ng/µL.Reconstitueer vóór de glycaananalyse de gedroogde, met stabiele isotopen gelabelde 4-fenethylbenzohydrazide-reagentia, evenals de native P2GPN-reagentia, in één milliliter derivatiseringsoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 0,25 milligram per milliliter. Het kan tot 10 minuten duren voordat de reagentia volledig zijn opgelost. Vortex uitgebreid om volledige solubilisatie te garanderen.Markeer de gedroogde N-glycanen met 200 µL stabiel-isotoop-gelabeld of natuurlijk P2GPN-reagens. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de gedroogde glycanen opnieuw te suspenderen. Vortex vervolgens de monsters en centrifugeer deze gedurende ongeveer 5 seconden in een benchtop-centrifuge.Laat de glycanen 3 uur lang reageren met het reagens bij 56 °C. Verplaats de glycanen onmiddellijk van de incubator naar de vacuümconcentrator en droog deze volledig gedurende 3 tot 5 uur bij 55 °C. Resuspendeer de gelabelde N-glycaan in 25 tot 50 µL water vlak voor de analyse met vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.Pipette herhaaldelijk op en neer om te zorgen dat de N-glycanen volledig zijn opgelost. Na het centrifugeren van de monsters gedurende 5 minuten, zoals eerder beschreven, wordt het supernatant verwijderd, waarbij erop wordt gelet dat de pipetpunt de bodem van de centrifugebuis niet raakt. Combineer een paar van native en met stabiele isotopen gelabelde monsters in een verhouding van 1:1 voor relatieve quantificatie tandemanalyse.Bereid 2 verschillende LCMS-methoden voor de proteomics- en glycomics-workflows. Injecteer voor proteïneanalyse ongeveer 400 nanogram proteïne in NPA op de kolom. Analyseer het monster bij 300 nanoliter per minuut, met een equilibratie van de pre-kolom van 1 microliter en een equilibratie van de analytische kolom van 5 microliter.Ioniseer de proteïnen onder de MS-condities die in het tekstprotocol worden vermeld. Injecteer voor glycaananalyse 5 µL van de opnieuw gesuspendeerde P2GPN-getagde native en stabiel-isotoop-gelabelde equi-M monsters op de kolom. Analyseer het monster bij 300 nL per minuut met 2 µL pre-kolomequilibratie en een 5 µL analytische kolomequilibratie.Ionise vervolgens de glycanen onder de MS-condities die in het tekstprotocol worden vermeld. Het op filtering gebaseerde zuiveringsprotocol werd vergeleken met de standaard methode voor vaste-fase-extractie en de abundanties van plasma-glycanen die tussen de twee protocollen werden gedetecteerd, vertoonden geen significant verschil. Bij beide methoden werden dezelfde glycanen aangetroffen nabij de detectielimiet, waar de variabiliteit toeneemt.De intervariabiliteit voor equiM-mengsels van plasma dat was gezuiverd via het filtergebaseerde of het standaard vastestoffase-extractieprotocol werd beoordeeld. Beide protocollen vertoonden Gaussiaanse distributies waarvan de gemiddelden niet significant verschilden van nul. 80 procent van de glycanen viel binnen een tweevoudige verandering.De molecuulgewichtverdelingen van glycanen die werden aangetroffen in de nieuwe en traditionele zuiveringsprotocollen waren niet significant verschillend en bestreken hetzelfde bereik. Kwalitatief werd er geen bias tussen glycanen waargenomen. Plasmaproteïnen werden geprepareerd via standaard filter-ondersteunde monstervoorbereiding en meerdere in-line protocollen.Het aantal geïdentificeerde eiwitten was vergelijkbaar voor de verschillende protocollen. Niet-specifieke deamidering werd bij de protocollen voor magnetronvertering en spike-indigestion beperkt tot minder dan 10 procent. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een nauwkeurige bepaling van de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen afhankelijk is van het minimaliseren van de blootstelling aan hitte en tijd.Zodra de methode onder de knie is, kan de inline pecurikene N-glycaanpurificatie in 2 dagen worden voltooid. Door deze procedure te volgen, kunnen nauwkeurige kwantificering van eiwit-N-glycanen en de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen worden geïntegreerd en gemodelleerd met behulp van statistische technieken van een hogere orde. Deze techniek biedt de mogelijkheid om snel de complexe taal van de kankerbiologie te ontcijferen, verschillen in therapeutische eiwitten kwantitatief te vergelijken en het belang van glycosylering in een biologische context echt te onthullen.

a-quantitative-glycomics-and-proteomics-combined-purification-strategy

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Leer een gecombineerde glycomics- en proteomics-zuiveringsstrategie met LC-MS/MS voor gelijktijdige kwantificering van N-glycanen en eiwitten uit plasma. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid voor grootschalige biologische studies.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Meer video's verkennen