Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy
8 maart 2016
Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.
Het algemene doel van deze op een enkele filter gebaseerde workflow is om N-glycanen en eiwitten gemakkelijk en kwantitatief uit biologische monsters te zuiveren voor massaspectrometrie-analyse. De schaalbaarheid, snelheid en analytische reproduceerbaarheid van deze methode maakt het direct toegankelijk in termen van bronnen en vaardigheden voor biologische massaspectrometrie laboratoria. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om glycomics, glycosyleringsplaatsbezetting en proteomics vragen tegelijkertijd te onderzoeken in grootschalige, hoogdoorvoer biologische studies.
We hebben de uitdagingen van N-glycan metingen overwonnen door deze methode te koppelen aan een op massaspectrometrie afgestemde derivatisatiestrategie, resulterend in nauwkeurige, relatieve kwantificering tussen kanker en controletoestanden. Met verminderde analytische variabiliteit kunnen nieuwe biologische interacties worden verklaard tussen het glycoom en proteoom, wat sleutelinzichten oplevert in ziektetoestanden en nieuwe mogelijkheden voor biomarkerontdekking. Om te beginnen, laadt u 2,5 microliter plasma op een filter.
Voeg vervolgens 2 microliters 1M dithiothreitol-oplossing toe aan elk monster in de filter. Verdun het monster met 200 microliter 100-mM ammoniumbicarbonaat PNGase-digestiebuffer. Sluit de filtermonsterbuis af en vortex licht, waarbij u voorzichtig moet zijn om de filter niet van zijn plaats te verstoren.
Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius om de eiwitten en glycoproteïnen te denatureren. Om de monsters te alkileren, voegt u 50 microliter 1M Iodoacetamide toe voor een eindconcentratie van ongeveer 200 mM. Incubeer vervolgens gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius.
Concentreer het gedenatureerde glycoproteïne op de filter door de monsters te centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 40 minuten voordat u de flowthrough weggooit. Was het monster met 100 microliter PNGase-digestiebuffer. Concentreer het glycoproteïne op de filter en gooi de flowthrough weg.
Herhaal de was- en concentratiestap twee keer voor een totaal van drie keer, wat resulteert in een concentraat in het dode volume van de filter. Gooi alle flowthrough en de opvangbuis weg zodra de wasbeurten voltooid zijn. Voeg vervolgens 2 microliter glycerol-vrije peptide N-glycosidase F of PNGase F toe aan de filter na overbrenging naar een verse opvangbuis.
Voeg 98 microliter PNGase-digestiebuffer toe om het totale volume op 100 microliter te brengen, en pipet gedurende licht op en neer op de filter om te mengen. Voor het spike-in-digestieprotocol incubeert u de monsters gedurende 2 uur bij 50 graden Celsius. Verwijder snel de monsters en voeg nog eens 2 microliter glycerol-vrije PNGase F toe. Vortex de monsters licht gedurende 1 tot 2 seconden om te mengen.
Incubeer de monsters gedurende nog eens 2 uur bij 50 graden Celsius. Nadat de glycanen zijn geëlueerd door de monster te centrifugeren bij 20 graden Celsius, voegt u 100 microliter PNGase-digestiebuffer toe aan de filter en centrifugeert u opnieuw. Verzamel de was met eventueel overgebleven N-gekoppeld glycaan in dezelfde opvangbuis als de eluent.
Na twee keer herhalen, verwijdert u de filter en plaatst u deze in een nieuwe opvangbuis voor de voorbereiding van proteomics. Vervolgens incubeert u de glycamonsters in de vriezer van 80 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten tot ze bevroren zijn. Droog vervolgens in een vacuümconcentrator gedurende 4 tot 6 uur bij kamertemperatuur tot het volledig is opgedroogd.
Spoel de filter met de gedenatureerde peptiden met 400 microliter 8M ureumbuffer. Sluit de opvangbuis af en vortex licht om te mengen. Concentreer de peptiden op de filter voordat u alle flowthrough weggooit.
Nadat u de ureumbufferwas nog twee keer hebt herhaald, spoelt u de filter met de gedenatureerde peptiden met Trypsine-digestiebuffer. Sluit de opvangbuis af en vortex licht om te mengen voordat u opnieuw op de filter concentreert zoals eerder. Gooi alle flowthrough weg en herhaal 2 extra keren voor een totaal van 3 Trypsine-digestiebuffer wasbeurten.
Verzamel alle toekomstige eluenten en wasbeurten in een nieuwe opvangbuis. Voeg vervolgens 50 microliter varkensgemodificeerd Trypsine toe in een 1:50 Trypsine-naar-eiwitverhouding voor ontdekkingsproteomics of een 1:5 Trypsine-naar-eiwitverhouding voor kwantitatieve proteomics experimenten. Sluit de opvangbuis af en vortex licht om te mengen.
Nadat u de monsters gedurende 2 uur bij 37 graden Celsius heeft geïncubeerd, werkt u snel om de monsters te verwijderen en nog eens 50 microliter Trypsine toe te voegen met de juiste Trypsine-naar-eiwitverhouding. Vortex de monsters licht gedurende 1 tot 2 seconden om te mengen. Incubeer vervolgens gedurende nog eens 2 uur bij 50 graden Celsius.
Na elutie van de peptiden door centrifugatie zoals eerder gedurende 20 minuten, spoelt u de resterende peptiden van de filter met Quench-buffer. Elueer van de filter door opnieuw te centrifugeren gedurende 15 minuten. Na kwantificering van de peptideconcentratie in de monsters, incubeert u de peptidemonsters in de vriezer van 80 graden Celsius tot ze bevroren zijn.
Droog vervolgens in een vacuümconcentrator gedurende 4 tot 6 uur bij kamertemperatuur tot het volledig is opgedroogd. Breng vervolgens de tryptische eiwitten vlak voor de vloeistofchromatografie massaspectrometrie of LCMS analyse in mobiele fase A naar de gewenste concentratie. Tryptische peptideconcentraties van 2,5 microliter plasma variëren van 100 tot 300 nanogram per microliter.
Voorafgaand aan glycaanalyse, reconstrueert u de gedroogde stabiele isotoopgelabelde 4-fenethyl benzohydrazide reagentia, evenals de inheemse P2GPN reagentia in één milliliter derivatisatieoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 0,25 milligram per milliliter. De reagentia zullen maximaal 10 minuten nodig hebben om volledig op te lossen. Vortex uitgebreid om volledige solubilisatie te garanderen.
Label de gedroogde N-glycanen met 200 microliter stabiele isotoopgelabel
Overzicht
Dit artikel presenteert een high-throughput protocol voor de gelijktijdige zuivering en kwantificering van N-glycanen en proteïnen uit plasma met behulp van LC-MS/MS. De methode verbetert de nauwkeurigheid van N-glycaanmetingen en faciliteert het onderzoek naar glycomics en proteomics in biologische studies.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Glycomics
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Traditionele methoden voor het analyseren van glycosylering zijn vaak beperkt in schaalbaarheid.
- Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen is cruciaal voor het begrijpen van biologische interacties.
- High-throughput technieken kunnen de analyse van complexe biologische monsters stroomlijnen.
- Massaspectrometrie is een krachtig instrument voor gedetailleerde moleculaire karakterisering.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol dat gecombineerde analyse van glycomics en proteomics mogelijk maakt.
- Het verbeteren van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de N-glycaankwantificering.
- Het faciliteren van grootschalige biologische studies die relevant zijn voor ziektebeelden.
Gebruikte methoden
- De monstervoorbereiding omvat denaturatie en alkylering van proteïnen.
- N-glycanen worden gezuiverd met behulp van een filtergebaseerde methode.
- Massaspectrometrie wordt ingezet voor kwantificatie en analyse.
- Stabiele isotopenmarkering wordt gebruikt voor nauwkeurige glycaanlabeling.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt gelijktijdige analyse van proteïnen en N-glycanen mogelijk.
- Er werd een nauwkeurige kwantificering bereikt tussen kanker- en controlemonsters.
- Verminderde analytische variabiliteit verhoogt de betrouwbaarheid van de resultaten.
- Er zijn inzichten verkregen in glycaan-proteïne-interacties, wat bijdraagt aan de ontdekking van biomarkers.
Conclusies
- Deze methode met hoge doorvoersnelheid is toegankelijk voor diverse biologische laboratoria.
- Het biedt een robuust kader voor het onderzoeken van glycomics en proteomics.
- De bevindingen kunnen leiden tot nieuwe mogelijkheden in ziekteonderzoek en biomarkeridentificatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
De integratie van kwantitatieve glycomics- en proteomics-workflows is essentieel voor het ontrafelen van complexe biologische mechanismen, het verbeteren van de mapping van ziektepaden en het bevorderen van biomarker-ontdekking in biofarmaceutische R&D. Dit high-throughput, filtergebaseerde protocol maakt gelijktijdige, onbevooroordeelde zuivering en kwantificering van N-glycanen en eiwitten uit plasma mogelijk, wat robuuste vergelijkende studies en translationeel onderzoek ondersteunt. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen en de besluitvorming over portfolio's door reproduceerbare, gemultiplexte moleculaire gegevens te leveren die relevant zijn voor therapeutische ontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar glycosyleringsafhankelijke biologische pathways en doelmechanismen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen en de eiwitovervloed te kwantificeren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door geïntegreerde glycomische en proteomische profilering.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde monsters uit plasma voor voor downstream LC-MS/MS workflows.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten voor zowel glycaan- als proteïne-analieten.
- Maakt high-throughput screening mogelijk en biedt platformschaalbaarheid voor grote monsterreeksen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt glycomische en proteomische gegevens uit voor de identificatie van ziekterelevante biomarkers.
- Behoudt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door analytische variabiliteit te minimaliseren.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling met robuuste, gemultiplexte moleculaire readouts.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en translationeel onderzoek door gelijktijdige, kwantitatieve analyse van glycosylering en eiwitexpressie in plasmaproeven mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de integratie van glycomische en proteomische gegevens.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve output die geschikt is voor comparatieve en high-throughput studies.
- Analytics: Levert multiplex LC-MS/MS-metingen voor robuuste statistische analyse en vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers en ziekterelevante moleculaire profilering.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Biedt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is voor verschillende biologische monstertypes en studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets en biomarkers.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoer voor gemultiplexte moleculaire analyses.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door de integratie van multi-omische datastromen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van discovery- en translationele programma's mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in massaspectrometrie en kwantitatieve proteomics/glycomics-workflows.
- Toegang tot LC-MS/MS-instrumentatie en analytische infrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de protocollen voor monstervoorbereiding en data-analyse.
- Aanpasbaar aan diverse biologische matrices, maar optimalisatie kan nodig zijn voor monsters die geen plasma zijn.
- Het minimaliseren van hitteblootstelling en tijd is cruciaal om nauwkeurige metingen van de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen te garanderen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Protein and Glycoprotein Denaturation and Alkylation
2:15
N-linked Glycan Enzymatic Digestion
3:29
Elution of N-glycans and Protein Filter Aided Sample Preparation (FASP) Digestion
6:37
Derivatization of N-linked Glycans with Hydrophobic Hydrazide Tags
8:19
Ultra-high Pressure Liquid Chromatography and Mass Spectrometry Analysis
9:27
Results: Analysis of the Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy
10:44
Conclusion
