Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Het algemene doel van deze methode is het isoleren van gingivale immuuncellen voor de diepgaande karakterisering van de immuunresponsen die verband houden met orale immuniteit en parodontitis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van orale immuniteit, zoals welke cellulaire factoren betrokken zijn bij de pathogenese van parodontitis. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de evaluatie van het orale immuuncelnetwerk mogelijk maakt en dat er voldoende levensvatbare cellen kunnen worden geïsoleerd voor daaropvolgende in-vitro onderzoeken.

Begin dit protocol door als eerste stap pinnen te gebruiken om het lichaam van de muis te immobiliseren en de borst- en buikholte te openen om het hart en de interne organen bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de vena cava en gebruik een spuit van 3 milliliter, voorzien van een naald van 27 gauge, om 3 milliliters PBS via de linker ventrikel door te spoelen. Wanneer al het bloed is uitgespoeld, wordt de kop van de muis met pinnen op een dissectieblok vastgezet, met de buik naar boven.

Gebruik vervolgens een schaar om elke mondhoek richting de nek door te knippen, waarbij de huid die de onderkaak en de nekregio bedekt wordt gescheiden, zodat de onderliggende weefsels en spieren bloot komen te liggen. Knip tussen de onderste snijtanden om beide zijden van de onderkaak te scheiden. Immobiliseer elke zijde van de gescheiden onderkaak met 25-gauge naalden om toegang te krijgen tot de mondholte.

Nadat het palatum is geïdentificeerd, gebruikt u een chirurgisch mesje nummer 10 om verticale incisies te maken vlak anterior van de eerste molaar en posterior van de derde molaar. Dissekeer vervolgens het weefsel weg van de neusholte en dissekeer ook de blokken los van de mandibula. Verwijder daarna het overtollige weefsel van de rand van het gingiva en breng de maxillaire en mandibulaire blokken over in een conische buis van 50 milliliter die 5 milliliter collagenase en DNase op ijs bevat.

Verteer het weefsel in een schudincubator bij 37 °C gedurende één uur, waarbij in de laatste vijf minuten 50 µL 0,5 M EDTA wordt toegevoegd. Voeg vervolgens 5 mL koud DNase-medium toe aan het weefsel en meng de inhoud van de buis voorzichtig door te wervelen. Breng daarna de vier weefselblokken over naar een petrischaal.

Bedek ze vervolgens met 500 µL vers DNase-medium. Gebruik een scalpel om het tandvlees van elk stuk weefsel te verwijderen. Breng vervolgens de gehele inhoud van de schaal over in een cellzeef van 70 µm op een 50 ml buis.

Was de petrischaal en de zeef met 3 tot 5 milliliter vers DNase-medium. Gebruik vervolgens de zuiger van een steriele spuit van 3 milliliter om het tandvleesweefsel tegen het gaas van de zeef te pletten. Spoel de zeef af met 30 tot 35 milliliter koud DNase-medium en centrifugeer het filtraat.

Resuspendeer het pellet vervolgens in 1 milliliter compleet medium en bepaal het aantal levensvatbare cellen. De isolatie en verwerking van immuuncellen zoals zojuist gedemonstreerd, levert een voldoende aantal cellen op om een ex-vivo stimulatie en karakterisering van de cytokine-secretiepatronen van gingivale cellen uit te voeren bij zowel wild-type als periodontitis-gevoelige dieren. De samenstelling van de murine gingivale immuuncellen kan inderdaad worden geanalyseerd, zoals aangetoond in deze dichtheidsplots waarin de T-cel- en natural killer-celcompartimenten in periodontitis-gevoelige LFA-knockout-muizen worden geëvalueerd.

Met behulp van de juiste gating-strategieën kan ook de intracellulaire cytokinproductie van TCR beta CD4-positieve, TCR beta CD8-positieve en TCR gamma delta-positieve T-cellen, evenals NK-cellen en aangeboren lymfoïde cellen, worden bepaald. Eenmaal onder de knie, kunnen de cellen in drie uur worden geïsoleerd voor immunokleuring, mits de techniek correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen efficiënt en snel te voltooien, waarbij de cellen op ijs worden bewaard wanneer ze niet worden gemanipuleerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cel-sortering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de functie van de specifieke celpopulaties.