Name: Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Leer hoe je gingivale immuuncellen isoleert en karakteriseert uit muizen om orale immuniteit en parodontitis te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in het immuuncelnetwerk van het tandvlees.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs werden gedeeltelijk gefinancierd door het intramural programma van NIDCR (N.M.M) en ondersteund door een Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B aan J.E.K) en door een Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research-subsidie (aan J.E.K). De auteurs danken Teresa Wild voor het kritisch beoordelen van het manuscript.

Alle in dit protocol beschreven experimentele gevolgde procedures vereiste richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, NIDCR / NIH. 1. Bereid in Advance <ol><li> Bereid compleet medium: RPMI aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% FBS. </li><li> Bereid DNase media: 50 ml RPMI medium aangevuld met 7,5 ug DNase (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde). </li><li> Bereid Collagenase-DNase media: 5 ml DNase media plus 3,2 mg / ml van Collagenase Type IV (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde). </li><li> Pre-cool FACS buffer: 0,5% FBS verdund in PBS. </li><li> Pre-cool centrifuge tot 4 ° C. </li><li> Warm shaker incubator op 37 ° C. </li></ol> 2. Isolatie, Dissection en Cell Isolatie van Gingival Blocks <ol><li> Euthanaseren muizen door ze bloot te stellen aan CO 2 in een geschikte kamer, volgens de richtlijnen ARAC. </li> &lt;li&gt; Open de borst- en buikholte naar het hart en de inwendige organen bloot. Te perfuseren, een insnijding in de onderste vena cava en perfuseren 3 ml PBS via de linker ventrikel met een 3 ml spuit met een 27 G naald. </li><li> Immobiliseren van het lichaam en het hoofd van de muis op een pad met de buik naar boven. </li><li> Snij elke commissure van de lip in de richting van de hals met een schaar, het scheiden van de huid die betrekking heeft op de onderkaak en halsgebied, het blootstellen van de onderliggende weefsels en spieren. Ontleden de onderlip aan de onderkaak bloot te leggen. </li><li> Snijd tussen de onderste snijtanden aan beide zijden van de onderkaak scheiden en immobiliseren weerszijden om de mondholte. </li><li> Visualiseren en ontleden de mond weg van de neusholte. </li><li> Ontleden gebieden met een mes 10 en omvatten bovenkaak en onderkaak molaire gebieden met omgeving gingiva (figuur 1). Voeg verticale incisies anterieure en posterieure molaire eerste naar de derde molair en een horizontale snede inde rand van het tandvlees (witte kraag van weefsel rondom de tanden). </li><li> Plaats de bovenkaak en onderkaak blokken in een 50 ml conische buis met 5 ml Collagenase / DNase (te houden op het ijs). </li><li> Incubeer in een shaker incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur en gedurende de laatste 5 minuten incubatie voeg 50 ul van 0,5 M EDTA. </li><li> Voeg 5 ml koude DNase media om de 50 ml buis met weefsels en draai voorzichtig te mengen. </li><li> Breng de 4 blokken van weefsel op een petrischaal en bedek met 500 ul van DNase media. Verwijderen gingiva uit elk blok van weefsel, met behulp van een scalpel en wijst het mes in de gingivale en interdentale ruimten. </li><li> Breng de weefsels en de inhoud van de petrischaal en de vorige DNase media tijdens dissectie, een nieuwe 50 ml buis door de cel zeef (70 um grootte). Wassen met DNase media (3-5 ml), alle van de gebruikte instrumenten en filter. </li><li> Met de plunjer van een steriele 3 ml spuit, mash het weefsel tegen de zeef,filtering met koude DNase media (30-35 ml). </li><li> Was de cel zeef met koud DNase media. </li><li> Centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 6 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml van complete media. </li><li> Tellen cellen (het verwachte bedrag moet liggen tussen 8 x 10 5-1,2 x 10 6 cellen met een levensvatbaarheid van&gt; 80%) met behulp van een geautomatiseerde cel teller. </li></ol> 3. Stimulatie en FACS kleuring van Gingival Cells <ol><li> Stimuleren van de enkele celsuspensie met PMA (50 ng / ml) en Ionomycine (2,5 ug / ml) in aanwezigheid van 1 ul / ml Brefeldine A. </li><li> Incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Spin down en wassen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C; 314 g gedurende 6 minuten. </li><li> Vlekken op de cellen met een levensvatbaarheid kleuring de instructies van de fabrikant. </li><li> Vlek voor extracellulaire merkers (CD45, TCRγδ, TcR, CD4, CD8, TCRγδ of mieribodies keuze) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Was de cellen met koude FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min. </li><li> Voorzichtig vortex de celpellet verstoren. </li><li> Fixeer de cellen met 2% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met koude FACS-buffer, centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 minuten en kleuring voor intracellulaire cytokinen. <ol><li> Vul het FACS buizen met een oplossing van koude 0,5% saponine verdund in FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min. </li><li> Voeg 300 ul van 0,5% saponine oplossing voor de FACS buizen, incubeer 15 min in het donker bij 4 ° C en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min. </li><li> Vlekken op de cellen voor intracellulaire merkers (IL-17A en IFNy of cytokines keuze) volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen met 0,5% saponine-oplossing en centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min. </li><li> Was opnieuw met FACSbuffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de cellen in 300 pl FACS-buffer. </li></ol></li><li> Analyseer resultaten op een flowcytometer. </li></ol> 4. Flowcytometrieanalyse <ol><li> Visualiseren cellen die moeten worden geanalyseerd op vooruit (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SCC) en de poort naar puin uit te sluiten. </li><li> Selecteer enkele cellen met voorwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) vs. hoogte (FSC-H) parameters. </li><li> Poort levende cellen die (zoals aangeduid door levensvatbaarheid kleuring) en positief voor de marker CD45 + hematopoietische voor verdere analyse (Figuur 2A en 2C) zijn. </li><li> Continue analyse van specifieke markers zoals getoond in figuur 2 en figuur 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen

De huidige techniek succes een groot aantal immuuncellen (van één enkele muis) geschikt oplevert, niet alleen voor de fenotypische karakterisatie, maar ook voor functionele studies ex vivo. Een andere groep eerder gepubliceerd protocol voor het isoleren en karakteriseren van muizen gingivale immuuncellen en introduceerde de waarde van het gebruik multicolor flowcytometrie in de studie van parodontitis in diermodellen 9. Na aanzienlijke problemen de belangrijkste wijziging in dit protocol werd dissect...

Gingivale weefsel rondom de menselijke en murine gebit en worden voortdurend blootgesteld aan het complex biofilm van de tand 1. De immuuncel netwerk toezicht op de gingivale barrière is essentieel voor het handhaven weefselintegriteit, waardoor homeostase met de lokale commensale microben en, tegelijkertijd, doeltreffende immuniteit tegen pathogene challenge 2. Om homeostase, wordt het immuunsysteem nauwkeurig afgestemd op de gingivale milieu waardoor een sterk gespecialiseerde immuuncel netwerk, maar weinig detail bekend van de gingivale immuuncelpopulaties en hun rol bij het ​​handhaven weefsel immuniteit 2. Wanneer immuun homeostase wordt verstoord op het tandvlees, hetzij door middel van verhoogde vatbaarheid gastheer en / of de aanwezigheid van dysbiotic microbiële gemeenschappen, een inflammatoire aandoening, parodontitis ontstaat 3 4. Parodontitis een gemeenschappelijke ontstekingsziekte, wat leidt tot verlies van tanden supporting structuren. In haar ernstige vormen het wordt gezien in ongeveer 10% van de bevolking 5. Ontrafeling van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij parodontitis gevoeligheid en de progressie is moeilijk gebleken 6. Echter diermodellen uiterst nuttig bij het ​​begrijpen van de mechanismen van parodontitis initiatie en progressie 7 geweest. Modellen kunnen worden gebruikt om de sleutel celpopulaties en moleculaire mediatoren die essentieel voor immuun homeostase en aandrijving ontwikkeling van parodontitis zijn gedefinieerd. Dergelijke inzichten zal ons begrip van gingiva-specifieke controle van het immuunsysteem homeostase transformeren en verder ons huidige begrip van de ziekte pathogenese.

<table><tbody><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine science tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>Fine science tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades #10</td><td>Fine science tools</td><td>10010-00</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Splinter Forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Naalden met reguliere bevel&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, 12,7 mm lengte</td></tr><tr><td>Monoject spuiten</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Luer-lock tip, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Zonder L-glutamine</td></tr><tr><td>DNase I van bovien pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase type IV</td><td>Gibco (door Life technologies)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine 50 mg/ml</td><td>Quality biological</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco (door Life technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco (door Life technologies)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Quality biological</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml buizen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polypropyleen, steriele</td></tr><tr><td>70 &mu;M Cell Strainers</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>5 ml FACS buizen</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Bevat brefeldine A oplossing</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristaat 13-Acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Calcium Zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponin uit quillaja schors</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse gamma delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IFN-&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees immune cell network

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immuuncellnetwerken in weefsels spelen een essentiële rol bij het mediëren van lokale immuniteit en het handhaven van weefselhomeostase, toch is er weinig bekend over de residente immuuncelpopulaties in het mondslijmvlies en het tandvlees. We hebben een techniek ontwikkeld voor het isoleren en bestuderen van immuuncellen uit muis-gingivalweefsel, een gebied met constante microbiële blootstelling en een kwetsbare plaats voor een veelvoorkomende ontstekingsziekte, parodontitis. Ons protocol staat een gedetailleerde fenotypische karakterisering toe van de immuuncelpopulaties die in het tandvlees aanwezig zijn, zelfs in rusttoestand. Onze procedure levert ook voldoende cellen met hoge levensvatbaarheid op voor gebruik in functionele studies, zoals de beoordeling van cytokinesecretie ex vivo. Deze combinatie van fenotypische en functionele karakterisering van het immuuncelnetwerk in het tandvlees zou moeten helpen bij het onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij orale immuniteit en parodontale homeostase, maar zal ook ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij lokale immunopathologie bevorderen.

De toepassing van het protocol illustreren, tonen we representatieve resultaten onderzoeken de immuuncel netwerk in de gingiva van muizen met en zonder parodontitis (WT versus LFA - / - figuur 2A - C). Representatieve FACS plots tonen levende CD45 + hematopoietische cellen in de gingiva (Figuur 2A, 2C). Isolatie en verwerking van immuuncellen met dit protocol levert voldoende cellen ex vivo...

We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Het algemene doel van deze methode is het isoleren van gingivale immuuncellen voor de diepgaande karakterisering van de immuunresponsen die verband houden met orale immuniteit en parodontitis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van orale immuniteit, zoals welke cellulaire factoren betrokken zijn bij de pathogenese van parodontitis. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de evaluatie van het orale immuuncelnetwerk mogelijk maakt en dat er voldoende levensvatbare cellen kunnen worden geïsoleerd voor daaropvolgende in-vitro onderzoeken.Begin dit protocol door als eerste stap pinnen te gebruiken om het lichaam van de muis te immobiliseren en de borst- en buikholte te openen om het hart en de interne organen bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de vena cava en gebruik een spuit van 3 milliliter, voorzien van een naald van 27 gauge, om 3 milliliters PBS via de linker ventrikel door te spoelen. Wanneer al het bloed is uitgespoeld, wordt de kop van de muis met pinnen op een dissectieblok vastgezet, met de buik naar boven.Gebruik vervolgens een schaar om elke mondhoek richting de nek door te knippen, waarbij de huid die de onderkaak en de nekregio bedekt wordt gescheiden, zodat de onderliggende weefsels en spieren bloot komen te liggen. Knip tussen de onderste snijtanden om beide zijden van de onderkaak te scheiden. Immobiliseer elke zijde van de gescheiden onderkaak met 25-gauge naalden om toegang te krijgen tot de mondholte.Nadat het palatum is geïdentificeerd, gebruikt u een chirurgisch mesje nummer 10 om verticale incisies te maken vlak anterior van de eerste molaar en posterior van de derde molaar. Dissekeer vervolgens het weefsel weg van de neusholte en dissekeer ook de blokken los van de mandibula. Verwijder daarna het overtollige weefsel van de rand van het gingiva en breng de maxillaire en mandibulaire blokken over in een conische buis van 50 milliliter die 5 milliliter collagenase en DNase op ijs bevat.Verteer het weefsel in een schudincubator bij 37 °C gedurende één uur, waarbij in de laatste vijf minuten 50 µL 0,5 M EDTA wordt toegevoegd. Voeg vervolgens 5 mL koud DNase-medium toe aan het weefsel en meng de inhoud van de buis voorzichtig door te wervelen. Breng daarna de vier weefselblokken over naar een petrischaal.Bedek ze vervolgens met 500 µL vers DNase-medium. Gebruik een scalpel om het tandvlees van elk stuk weefsel te verwijderen. Breng vervolgens de gehele inhoud van de schaal over in een cellzeef van 70 µm op een 50 ml buis.Was de petrischaal en de zeef met 3 tot 5 milliliter vers DNase-medium. Gebruik vervolgens de zuiger van een steriele spuit van 3 milliliter om het tandvleesweefsel tegen het gaas van de zeef te pletten. Spoel de zeef af met 30 tot 35 milliliter koud DNase-medium en centrifugeer het filtraat.Resuspendeer het pellet vervolgens in 1 milliliter compleet medium en bepaal het aantal levensvatbare cellen. De isolatie en verwerking van immuuncellen zoals zojuist gedemonstreerd, levert een voldoende aantal cellen op om een ex-vivo stimulatie en karakterisering van de cytokine-secretiepatronen van gingivale cellen uit te voeren bij zowel wild-type als periodontitis-gevoelige dieren. De samenstelling van de murine gingivale immuuncellen kan inderdaad worden geanalyseerd, zoals aangetoond in deze dichtheidsplots waarin de T-cel- en natural killer-celcompartimenten in periodontitis-gevoelige LFA-knockout-muizen worden geëvalueerd.Met behulp van de juiste gating-strategieën kan ook de intracellulaire cytokinproductie van TCR beta CD4-positieve, TCR beta CD8-positieve en TCR gamma delta-positieve T-cellen, evenals NK-cellen en aangeboren lymfoïde cellen, worden bepaald. Eenmaal onder de knie, kunnen de cellen in drie uur worden geïsoleerd voor immunokleuring, mits de techniek correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen efficiënt en snel te voltooien, waarbij de cellen op ijs worden bewaard wanneer ze niet worden gemanipuleerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cel-sortering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de functie van de specifieke celpopulaties.

isolation-characterization-functional-examination-gingival-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

This video demonstrates the isolation procedure of the gingival immune cell network from a mouse model. The enzymatic digestion releases the gingival tissue from the attached teeth and bone, which is further mechanically digested, releasing immune cells from the gingiva. The isolated cells are ready for immunological experiments.

Isolation of Gingival Immune Cell Network from Murine Teeth Blocks

Deze studie beschrijft een efficiënte techniek voor het isoleren en verwerken tandvleesweefsels van de muis mondholte om een-celkweek produceren. De resulterende cellen kunnen verder worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse en moleculaire studies.

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

Dit artikel presenteert twee protocollen: een om anaërobe bacteriën te meten die succesvol kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en de andere om anaërobe bacteriën te visualiseren die interageren met gastheercellen. Dit onderzoek kan worden toegepast op elke cultiveerbare anaëroob en elk type eukaryotische cel.

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Het doel van het protocol is het bouwen van een inflammatoire menselijke tandvlees model in vitro. Dit weefsel model cultiveert samen drie soorten menselijke cellen, HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, driedimensionale omstandigheden. Dit model kan worden toegepast op het onderzoek naar parodontale ziekten, zoals gingivitis en Parodontitis.

Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees

In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.

Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.

Isolatie van groep 2 aangeboren lymfoïde cellen van muis neusslijmvlies om de expressie van CD226 te detecteren

Het doel van dit protocol is een gestandaardiseerde benadering te bieden voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van de muisachtige gingivale epitheliale barrière door topisch fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgroottes op het gingivale oppervlak in vivo toe te passen, gevolgd door ex vivo beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem.

Functionele beoordeling van de muis-gingivale epitheliale barrière met behulp van fluorescerende tracers

Leer hoe je gingivale immuuncellen isoleert en karakteriseert uit muizen om orale immuniteit en parodontitis te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in het immuuncelnetwerk van het tandvlees.

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Meer video's verkennen