Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network
16 februari 2016
We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.
Het algemene doel van deze methode is om gingivale immuuncellen te isoleren voor de diepgaande karakterisering van de immuunreacties gerelateerd aan orale immuniteit en parodontitis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van orale immuniteit, zoals welke cellulaire factoren betrokken zijn bij de pathogenese van parodontitis. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de evaluatie van het orale immuuncelnetwerk mogelijk maakt en de isolatie van voldoende levensvatbare cellen voor verdere in-vitro-onderzoeken.
Als eerste stap van dit protocol, begin met het plaatsen van pinnen om het lichaam van de muis te immobiliseren en open de thoracale en abdominale holtes om het hart en de interne organen bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de vena cava en gebruik een 3-milliliter spuit, uitgerust met een 27-gauge naald, om profus 3 milliliter PBS via de linker ventrikel te injecteren. Wanneer al het bloed is weggespoeld, prik het hoofd van de muis op een dissectiepad, met de maag omhoog.
Gebruik vervolgens een schaar om elke commissure van de lip naar de nek te snijden, waardoor de huid die de onderkaak en nekregio bedekt, wordt gescheiden en de onderliggende weefsels en spieren worden blootgelegd. Snijd tussen de onderste snijtanden om beide zijden van de onderkaak te scheiden. Immobiliseer elke zijde van de gescheiden onderkaak met 25-gauge naalden om toegang tot de mondholte te krijgen.
Na het identificeren van het gehemelte, gebruik een chirurgisch mes nummer 10 om verticale incisies te maken net voor de eerste kies en achter de derde kies. Ontleed vervolgens het weefsel van de neusholte en ontleed ook de blokken van de onderkaak. Vervolgens verwijdert u het overtollige weefsel van de rand van het tandvlees en brengt u de maxillaire en mandibulaire blokken over in een 50-milliliter kegelbuis met 5 milliliter collageenase en DNase op ijs.
Verteer het weefsel in een shakerincubator bij 37 graden Celsius gedurende een uur, voeg tijdens de laatste vijf minuten 50 microliter 0,5 molaire EDTA toe. Voeg vervolgens 5 milliliter koud DNase-medium toe aan de weefsels en meng de inhoud van de buis voorzichtig door het rondslingeren. Breng vervolgens de vier weefselblokken over in een petrischaal.
En bedek ze met 500 microliter vers DNase-medium. Gebruik een scalpel om het tandvlees van elk weefselblok te verwijderen. En breng de hele inhoud van de schaal over in een 70 micron celstrainer bovenop een 50-milliliter buis.
Was de petrischaal en strainer met 3 tot 5 milliliter vers DNase-medium. Gebruik vervolgens de plunjer van een steriele, 3-milliliter spuit om het gingivale weefsel tegen het gaas van de strainer te drukken. Spoel de strainer af met 30 tot 35 milliliter koud DNase-medium en centrifugeer het filtraat.
Suspenseer vervolgens het gehemelte in 1 milliliter compleet medium en bepaal het aantal levensvatbare cellen. De isolatie en verwerking van immuuncellen zoals zojuist gedemonstreerd, levert een voldoende aantal cellen op om een ex-vivo stimulatie en karakterisering van de cytokine-afscheidingspatronen van gingivale cellen uit te voeren bij zowel wildtype als parodontitis-gevoelige dieren. Inderdaad kan de muisige gingivale immuuncelsamenstelling worden geanalyseerd zoals gedemonstreerd in deze dichtheidsplots die de t- en natuurlijke killercelcompartimenten evalueren in parodontitis-gevoelige LFA-knockoutmuizen.
Met behulp van de juiste gatingstrategieën kan de intracellulaire cytokineproductie van TCR bèta CD4 positieve, TCR bèta CD8 positieve en TCR gamma delta positieve t-cellen, evenals NK en intrinsieke lymfoïde cellen, ook worden bepaald. Eenmaal onder de knie, kunnen de cellen in drie uur worden geïsoleerd voor immunokleuring als de techniek correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen efficiënt en snel te voltooien en de cellen op ijs te houden wanneer ze niet worden gemanipuleerd.
Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals celsortering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de functie van de specifieke celsubsets.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een techniek voor het isoleren en karakteriseren van immuuncellen uit murine gingivale weefsel. De methode heeft tot doel het begrip van orale immuniteit en parodontitis te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Orale biologie
- Parodontologie
Achtergrond
- Het begrijpen van immuunresponsen in de mondholte is cruciaal voor het aanpakken van parodontale aandoeningen.
- Gingivale immuuncellen spelen een belangrijke rol in de orale immuniteit.
- Huidige methoden bieden mogelijk niet voldoende levensvatbare cellen voor gedetailleerde analyse.
- Deze techniek streeft ernaar die lacune te vullen door diepgaande functionele studies mogelijk te maken.
Doel van het onderzoek
- Het isoleren van gingivale immuuncellen voor karakterisering.
- Het onderzoeken van cellulaire factoren betrokken bij de pathogenese van parodontitis.
- Het evalueren van het orale immuuncelnetwerk.
Gebruikte methoden
- Immobilisatie van de muis en blootstelling van inwendige organen.
- Snede in de vena cava voor bloedspoeling.
- Gebruik van een spuit om overvloedig PBS via het linkerventrikel te pompen.
- Voorbereiding van de muis voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare gingivale immuuncellen.
- Karakterisering van immuunresponsen gerelateerd aan orale gezondheid.
- Inzichten in de pathogenese van parodontitis.
- Mogelijkheden voor downstream in-vitro onderzoek.
Conclusies
- Deze techniek biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van orale immuniteit.
- Het verbetert het begrip van de dynamiek van immuuncellen in gingivale weefsels.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken voor diepere inzichten in parodontale aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precise isolation and functional profiling of gingival immune cells enables mechanistic de-risking in oral immunology and supports target validation for inflammatory disease research. This workflow provides high-viability cell populations for quantitative phenotyping and ex vivo functional assays, strengthening predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions in immunology and oral health R&D by enabling robust interrogation of tissue-resident immune networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell subsets implicated in oral inflammatory pathogenesis.
- Supports functional target validation through ex vivo cytokine secretion assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune cell contributions to disease models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers viable, phenotypically characterized immune cells for downstream assay development.
- Supports reproducible preparation of biological samples for standardized screening workflows.
- Enables quantitative readouts of immune function for compound evaluation.
- Improves scalability and assay readiness for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant oral models for translational continuity.
- Enables functional biomarker discovery in preclinical oral immunopathology studies.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting oral tissues.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality immune cell preparations for both mechanistic studies and functional screening in oral disease models.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on immune cell roles in oral tissue homeostasis and pathology.
- Screening: Supplies reproducible, viable cell populations for assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine secretion and immune cell phenotypes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant oral models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse oral immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oral immune research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune cell isolation for cross-study comparability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of oral immunology assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and approaches in oral and mucosal immunology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and immune cell handling.
- Demands access to flow cytometry and ex vivo functional assay infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible cell isolation and analysis.
- Adaptation to other mucosal tissues may require protocol optimization.
- Cell viability and yield are sensitive to procedural timing and temperature control.
