Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS
April 13th, 2016
Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.
Het algemene doel van deze techniek is om verschillende metalloproteïnen in complexe standaarden te kunnen kwantificeren op basis van het gebruik van bekende metalloproteïne-standaarden. Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden over de rol van metalen in de biologie. Bijvoorbeeld, hoe verandert de metaalstatus van een eiwit bij ziekte?
Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat het je toestaat om de metaalstatus van een eiwit in zijn oorspronkelijke toestand te meten. De techniek zal worden gedemonstreerd door Amber Lothian, een PhD-student uit mijn lab. Om te beginnen, homogeniseer weefsel of celcultuur monsters door manuele downs of sonicatie gedurende vijf minuten met behulp van Tris-gebufferd zoutwater.
Verduidelijk de homogenaten door centrifugatie bij 16.000 keer G, gedurende vijf minuten. Na het verzamelen van de resulterende supernatant, normaliseer de totale hoeveelheid eiwit door de eiwitconcentraties te bepalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Warm het inductief gekoppelde plasma-maspectrometer op en stem het af, gebruik hiervoor de protocollen van de fabrikant.
Verdun de metalloproteïne-standaarden om de val binnen het bereik van nul tot 500 microgram per liter te laten vallen, met behulp van één procent salpeterzuur. Om standaarden binnen dit bereik te bereiken, gebruik geen verdunningen die hoger zijn dan een en twintig. Stel de volgorde van injecties in door eerst de zeven kalibratieniveaus te analyseren.
Concentraties variërend van nul tot 500 microgram per liter, gevolgd door de metalloproteïne-standaarden. De zeven kalibratieniveaus zijn nul, een, vijf, tien, 50, 100 en 500 microgram per liter. Selecteer vervolgens de elementen van belang.
Hier gebruiken we ijzer, koper, zink, kobalt en jodium. Omdat dit de elementen zijn waaraan de eiwitstandaarden gebonden zijn. Selecteer de elementen in de acquisitiemethode door het elementselectortabblad te openen en de elementen en hun respectieve isotoopmassa's toe te voegen die worden geanalyseerd.
Vervolgens voer je monsteranalyse uit met het instrument. De instrumentsoftware maakt automatisch de kalibratiecurven voor elk van de elementen die worden geanalyseerd. Gebruik de kalibratiecurven om de concentratie van metaal in de onbekende monsters te bepalen.
Op basis van de bulkanalyseresultaten genereer je de metalloproteïne-standaarden die de drie meest voorkomende sporenelementen in zoogdierweefsel bevatten met behulp van een mengsel van koper, zink-superoxide dismutase en ferritine. Spuit de hyperformance quick chromatografie of HPLC-pompen gedurende vijf minuten met 200 millimolair ammoniumnitraatbuffer, met een stromingssnelheid van vijf milliliter per minuut. Eenmaal het systeem is gespoeld, stel de stromingssnelheid in op nul punt één milliliter per minuut.
En verbind de zijde-uitsluitingskolom. Verbind het tegenovergestelde uiteinde van de kolom met de UV-detector, stel de gemeten absorptie in op 280 nanometer, met behulp van piekbuizen. Verhoog geleidelijk de stromingssnelheid van de kolom in stappen van nul punt één milliliter per minuut, tot een eindstromingssnelheid van nul punt vier milliliter per minuut is bereikt.
Terwijl dit gebeurt, controleer de buisverbindingen naar de kolom op lekken. Bewaak de druk van dit systeem om ervoor te zorgen dat deze de kolomvereisten niet overschrijdt door de druktrace op het chromatogram in de software te observeren. Laat de kolom vijf tot tien kolomdelenvolumes lang bij de vereiste stromingssnelheid gelijkwaardig worden.
Nadat het is geëquilibreerd, verbind de instrumenten om monsters te kunnen analyseren. Stel de HPLC-methode in om buffer A gedurende vijftien minuten met een stromingssnelheid van nul punt vier milliliter per minuut over de kolom te pompen. Plaats de ICPMS in stand-bymodus voordat je de hardware-instelling verandert.
Eenmaal in stand-bymodus, schakel de communicatie voor de autosampler uit en verander de monsterintroductie naar 'anders'. Gebruik PEEK-buizen om de uitstroom van de UV-detector rechtstreeks te verbinden met de nevelmaker op de ICPMS. Schakel de ICPMS in en laat het instrument tien tot twintig minuten opwarmen.
Zodra het plasma is ontstoken, verbind de externe kabel van de ICPMS naar de achterkant van de HPLC-autosampler. Doe dit zodra het plasma is ontstoken. Anders zal het HPLC-systeem automatisch worden uitgeschakeld, omdat de ICPMS niet is ingeschakeld.
Verander de ICPMS-methode om gegevens te verzamelen voor LC ICPMS door eerst de acquisitiemethode te wijzigen van spectrum naar tijdsoplossend acquisitie. Selecteer vervolgens de elementen die geanalyseerd moeten worden. IJzer, koper, zink, kobalt, jodium, evenals alle andere elementen van belang, en stel integratietijden in.
Nadat de elementen van belang zijn gekozen, pas de acquisitietijd aan om deze overeen te laten komen met de runtijd voor de chromatografie. Stem de ICPMS handmatig af op gevoeligheid en heliumgasstroomsnelheden in de botsingscel met een chromatografiebuffer die cesium en antimoon bevat. Zodra de metaaliontellingen zijn gestabiliseerd en de relatieve standaarddeviatiewaarden onder de vijf procent liggen, is het systeem klaar voor gebruik.
Maak monsterrunlijsten in zowel de HPLC- als ICPMS-softwareprogramma's. De monsterrunlijst bevat de volgorde waarin elk van de monsters moet worden geïnjecteerd. Evenals de naam waaronder de gegevens worden opgeslagen.
Controleer of het totale aantal monsters in de lijst overeenkomt tussen de twee programma's. Start de monsterbatch voor de ICPMS vóór de HPLC, omdat de injectie van het monster door de HPLC de ICPMS zal activeren om gegevens te verzamelen. Als dit niet in de juiste volgorde wordt gedaan, zal dit resulteren in ontbrekende gegevens.
Genereer kalibratiecurvepunten door verschillende volumes van de gemengde superoxide dismutase en ferritine-standaard te injecteren. Injectievolumes variëren van één microliter tot dertig microliters. Analyseer ten slotte elk van de onbekende monsters, zoals weefsel, plasma of celcultuur, voordat je de gegevens analyseert zoals beschreven in het tekstprotocol.
De illusie van ferritine over een bereik van 2000 tot 60.000 picogram ijzer dat op de kolom is ge
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het kwantificeren van metalloproteïnen met behulp van grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS). De techniek maakt de meting van metaalstatus in eiwitten uit biologische monsters mogelijk, waardoor inzichten worden verkregen in hun rol in verschillende biologische processen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Proteomics
Achtergrond
- Metalloproteïnen spelen cruciale rollen in biologische systemen.
- Inzicht in de metaalstatus in eiwitten kan inzichten opleveren in ziektemechanismen.
- Traditionele methoden meten mogelijk niet eiwitten in hun oorspronkelijke toestand.
- ICP-MS biedt hoge gevoeligheid en specificiteit voor metaalanalyse.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van metalloproteïnen.
- Om standaarden vast te stellen voor het schatten van moleculair gewicht en metaalgehalte.
- Om de metaalstatus van eiwitten in biologische monsters te analyseren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van metalloproteïne standaarden en homogenisatie van monsters.
- Grootte-exclusiechromatografie om eiwitten te scheiden.
- Inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie voor metaalkwantificering.
- Calibratiecurven gegenereerd voor nauwkeurige meting van metaalconcentraties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van metalloproteïnen uit verschillende biologische monsters.
- Totstandbrenging van kalibratiecurven voor meerdere metalen van belang.
- Demonstratie van het vermogen van de methode om eiwitten in hun oorspronkelijke toestand te analyseren.
- Inzichten in de rol van metalen in biologische processen en ziekte.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van metalloproteïnen.
- Het biedt een raamwerk voor toekomstig onderzoek naar metaal-eiwitinteracties.
- Verdere toepassingen kunnen de begrip van metalloproteïnen in gezondheid en ziekte verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative metalloproteomic analysis using SEC-ICP-MS enables biopharma R&D to measure metal-protein interactions in native states, supporting target validation in neurodegenerative disease research. This approach provides predictive confidence by linking trace element imbalances to protein function, informing mechanistic de-risking in Alzheimer's and Parkinson's disease programs. The method facilitates portfolio triage through reproducible, quantitative outputs that clarify metalloprotein abundance changes across disease-relevant biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by quantifying metalloprotein abundances in disease versus control samples.
- Operational Value: Establish trace element-specific calibration curves using copper-zinc SOD and ferritin standards for iron, copper, and zinc quantification.
- Strategic Value: Enable biological de-risking through native-state metal status measurement, reducing uncertainty in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream workflows by resolving metalloproteins via size exclusion prior to ICP-MS detection.
- Operational Value: Address assay standardization and reproducibility through internal standardization with cesium and antimony in chromatography buffer.
- Strategic Value: Highlight screening readiness and platform reuse by enabling 20-36 sample analyses per day after system equilibration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discuss disease relevance by analyzing human brain and plasma samples to identify metalloprotein peaks linked to copper, zinc, and iron.
- Operational Value: Describe continuity from discovery through preclinical validation by using peak area regression to convert raw counts to picograms per second for quantitative comparison.
- Strategic Value: Address risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative outputs that support go/no-go criteria in metalloprotein-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
Position SEC-ICP-MS within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, where quantitative metalloprotein data informs target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by measuring metal status changes in proteins under disease conditions using calibrated trace element detection.
- Screening: Describe assay readiness through reproducible SEC separation and element-specific quantification enabled by external calibration curves.
- Analytics: Highlight measurements and readouts such as peak area conversion to picograms per second, enabling cross-sample comparison of metalloprotein abundance.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by demonstrating applicability to human brain and plasma samples for disease-relevant target validation.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability through standardized hardware setup, software acquisition methods, and sample run list synchronization between HPLC and ICPMS platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative metalloprotein analysis in native state.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via cesium-antimony internal standards and fixed flow rate protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by clarifying metal-protein relationships early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative metalloprotein abundance data across biological systems.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in metalloprotein biochemistry, HPLC operation, and ICP-MS optimization for trace element analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including size exclusion column, UV detector at 280 nm, and ICP-MS with time-resolved acquisition mode.
- Cross-team standardization requirements for sample preparation, normalization by total protein concentration, and injection volume calibration from 1 to 30 microliters.
- Adaptation considerations across model systems such as tissue homogenization, cell culture preparation, and plasma analysis using appropriate metalloprotein standards.
- Practical limitations supported by source material including the need to avoid dilutions exceeding 1:20 for standards and monitor system pressure to prevent column damage during equilibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Bulk Analysis of Metalloprotein Standards using Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (ICP-MS)
2:41
HPLC System Setup and Size Exclusion Chromatography Column Equilibration
4:00
Setting Up and Running Size Exclusion - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (SEC-ICP-MS)
6:41
Results: Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS
8:25
Conclusion
