Name: Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe u metalloproteïnen kwantitatief analyseert met size exclusion chromatografie gekoppeld aan ICP-MS. Deze methode meet metalen in hun native toestand in biologische monsters voor inzicht in ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de steun van operationele infrastructuur Support Program Victoriaanse regering, de Australian Research Council Linkage Projecten Scheme (met Agilent Technologies), de Australische National Health en Medical Research Council, de Victoriaanse hersenen bank, Cooperative Research Centre for Mental Health en de Neuroproteomics erkennen faciliteit.

1. Bereiding van Buffers en voorbeelden <ol><li> Bereid 500 ml buffer, 200 mM ammoniumnitraat pH 7,6-7,8 (pH ingesteld met ammoniumhydroxide (NH4OH)) met cesium (Cs) en antimoon (Sb) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 10 ppb. Gebruik cesium en antinomy als interne standaarden om te letten op drift in de reactie van ICP-MS. Filter buffer vóór gebruik door een 0,22 urn filter. </li><li> Bereid monster afhankelijk van het type monster: vloeistof, weefsel- of celkweek. <ol><li> Voor monsters die homogenisatie (bijvoorbeeld weefsel of cellen) nodig, zodat zij geen detergens bevat. Gebruik Tris buffers voor de monstervoorbereiding. U kunt ook gebruik maken van fosfaat buffers, maar ze kan een negatieve invloed hebben op de metalloproteome na verloop van tijd of met vries dooi cycli 12. </li><li> Homogeniseren weefsel of celkweek monsters handmatig dounce of sonicatie gedurende 5 min met behulp van Tris gebufferde zoutoplossing (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumchloride(NaCl) + ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gratis proteaseremmers). </li><li> Verduidelijken homogenaten door centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Verzamel de resulterende supernatant. Houd monsters bij 4 ° C. Opmerking: Alle monsters worden gecentrifugeerd voorafgaand aan het laden in de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) flacons dat deeltjes zal gaan blokkeren de kolom grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). </li></ol></li><li> Normaliseren van de totale hoeveelheid eiwit geladen op de kolom over de monsters. Eiwitconcentraties bepaald bij 280 nm met een UV spectrofotometer microvolume 13. Belasting tussen 20 en 150 ug eiwit. Met typische injectievolumes variërend 2-80 gl afhankelijk van de monsterconcentratie. <ol><li> Maak de steekproef arm van de micro volume UV spectrofotometer met gedestilleerd water voordat monster laden. Het monster arm is wanneer het eiwit monsters worden geladen. </li><li> Blanco het instrument tegen 2 pl the sample buffer. Laad dan 2 gl van elk monster op de arm en meet de absorptie bij 280 nm. </li><li> Wordt de concentratie. Voor ruw eiwit monsters, maken gebruik van een extinctiecoëfficiënt van 1 Abs = 1 mg / ml. Om de concentratie van eiwit in de monsters te bepalen, gebruikt de Beer-Lambert wet, A = ε xlxc, waarin A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, l de weglengte in centimeters en c de concentratie. </li></ol></li></ol> 2. Bulk Analyse van metalloproteïne Standards gebruik van inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie <ol><li> Warm-up en tunen van het instrument met behulp van de protocollen van de fabrikant. </li><li> Zodra instrument wordt opgewarmd en afgestemd, voert bulk ICP-MS. Opmerking: De oplossingen van gezuiverd metalloproteïnen het algemeen moet worden verdund voor de meting. De metalen concentratie van de standaard kan worden geschat op basis van de bekende eiwit: metaal stochiometries en de geschatte eiwit Concentratie. Deze informatie kan worden gebruikt om de verdunning die passend binnen het bereik van de standaardkromme gegenereerd vallen zal bepalen. <ol><li> Verdun metalloproteïne normen, thyroglobuline, ferritine, ceruloplasmine, Cu / Zn SOD en vitamine B 12, zodat ze binnen het bereik van 0 vallen - 500 ug / L, middels 1% salpeterzuur. Normen bereiken binnen dit bereik, niet meer dan 1 verdunningen gebruiken 20. Voer seriële verdunningen in water om de voorraad te verdunnen voordat deze indien nodig. </li><li> Stel de volgorde van de injecties. Eerst, analyseren de kalibratie zeven niveaus concentraties variërend 0-500 ug / l, gevolgd door de metalloproteïne normen. De zeven kalibratie niveaus 0, 1, 5, 10, 50, 100 en 500 ug / L. </li><li> Selecteer elementen van belang. Hier, Gebruik Fe, Cu, Zn, Co en ik, omdat ze de elementen die de eiwitstandaarden zijn gebonden. Selecteer de elementen in de overnamemethode door het openen van de tab element selector en vervolgens die eleme<html> gen en hun isotoop massa&#39;s die moeten worden geanalyseerd. </li><li> Voeren monsteranalyse het instrument en het instrument software automatisch de kalibratiekrommen voor elke van de elementen worden geanalyseerd. De kalibratiekrommen worden gecreëerd door de software van het uitzetten van de tellingen / sec van de gedetecteerde tegen de hoeveelheid metaal die de norm is bedoeld om te bevatten, in mg / l metal. Met de kalibratiekromme om de concentratie van metaal bepalen de onbekende monsters. Opmerking: De ijkkromme, de software bepaalt de concentratie van metaal in elke metalloproteïne normen. </li><li> Uit de totale analyseresultaten genereren metalloproteïne normen die de drie meest voorkomende spoorelementen in zoogdierlijke weefsels met een mengsel van Cu omvatten, Zn superoxide dismutase (SOD) verdund tot 200 ug / l koper en zink en ferritine (FTN) in een uiteindelijke concentratie van 2000 ug / l ijzer. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. HPLC System Setup en Size Exclusion Chromatography kolomequilibratiebuffer Opmerking: Dit deel moet worden uitgevoerd parallel aan de vorige, aangezien ze allebei vereist ongeveer 1-1,5 uur in beslag. <ol><li> Purge HPLC pompen met buffer in stap 1,1 en ontlucht de pompen gedurende 5 min bij een stroomsnelheid van 5 ml / min. </li><li> Zodra het systeem is verwijderd, ligt het debiet 0,1 ml / min en sluit de gelfiltratiekolom (4,6 x 300 mm, 3 urn, 150 A). Opmerking: Een natte verbinding tussen de buis en de kolom voorkomt eventuele luchtbellen gevangen tijdens het aansluiten van de kolom. </li><li> Sluit het andere uiteinde van de kolom om de UV-detector ingesteld op 280 nm absorptie bij gebruik PEEK buis te meten. </li><li> Geleidelijk verhogen van de stroomsnelheid van de kolom in stappen van 0,05-0,1 ml / min tot een uiteindelijke stroomsnelheid van 0,4 ml / min bereikt. Terwijl dit zich voordoet, controleert u de slangaansluitingen aan de kolom op eventuele lekkages. Bewaken van de drukvan het systeem waardoor het apparaat niet overschrijdt kolom eisen en houdt de druk spoor op het chromatogram in de software. </li><li> Laat de kolom in evenwicht komen met de vereiste debiet meer dan 5-10 kolomvolumes. Nadat het is in evenwicht gebracht, sluit u de instrumenten om het monster analyse plaatsvinden. </li><li> Stel de HPLC-methode tot buffer A overpompen de kolom bij 0,4 ml / min gedurende 15 min. </li></ol> 4. opzetten en runnen van Size Exclusion - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie Opmerking: Operationele procedures kan variëren tussen de instrumenten en modellen. Neem contact op met het instrument technisch specialist voor meer informatie over het configureren van de ICP-MS wordt gebruikt te leren. <ol><li> Plaats de ICP - MS in de standby-modus voor de hardware-instelling te wijzigen. <ol><li> Eenmaal in de standby-modus schakelt u de communicatie voor de auto-sampler en verander de sample kennismaking met &quot;andere&quot;. Opmerking: Afhankelijk van de software en hardware configuratie selecteren &quot;HPLC&quot; als monsterintroductiemethode bron kan worden gebruikt. Neem contact op met het instrument technisch specialist om te weten of deze optie beschikbaar is. </li></ol></li><li> Gebruik PEEK buis (ID 0,13 mm) om de stroom van de UV-detector rechtstreeks aansluiten op de vernevelaar op de ICP-MS. </li><li> Power back-up van de ICP - MS en laat het apparaat opwarmen 10-20 min. </li><li> Nadat het plasma ontstoken is, sluit de externe kabel van de ICP - MS naar de achterkant van de HPLC-autosampler. Doe dit zodra het plasma ontstoken; anders wordt het HPLC-systeem automatisch uitgeschakeld omdat de ICP - MS is niet op. </li><li> Verander de ICP-MS methode om gegevens voor LC-ICP-MS verzamelen. <ol><li> Alter de overname methode van spectrum tot tijd resolve acquisitie (TRA). </li><li> Selecteer de te analyseren elementen, Fe, Cu, Zn, Co, I, alsmede andere elementen van belang, en stel integratietijden (typisch tussen 0,05-0,3 sec). Na de elementen van belang eenre gekozen, past de overname tijd om de looptijd match voor de chromatografie (bijvoorbeeld 900 seconden voor een 15 min chromatografie run). </li><li> Hand af te stemmen ICP - MS gevoeligheid en botsingscel helium (He) gasstroomsnelheid met chromatografie buffer stroomt via Cs en Sb in de buffer. De He stroomsnelheden zijn gewoonlijk ~ 1 ml / min lager dan die voor bulkanalyse. Zodra het metaalion tellingen gestabiliseerd en relatieve standaardafwijking (RSD) waarden lager dan 5%, is het systeem klaar voor gebruik. </li></ol></li><li> Maak monster lopen lijsten in zowel de HPLC en ICP-MS software programma&#39;s. Het monster run lijst bevat de volgorde waarin elk van de monsters is zo goed worden geïnjecteerd als de naam waarmee de gegevens worden opgeslagen. Controleer of het totale aantal monsters in de lijst wedstrijd tussen de twee programma&#39;s. </li><li> Start de monsterbatch voor de ICP-MS voor de HPLC als de injectie van het monster door HPLC wordt de ICP leiden - MS wil bijhoudengegevens. Als dit niet in de juiste volgorde wordt gedaan zal leiden tot ontbrekende gegevens. </li><li> Genereren kalibratiekromme punten door het injecteren van uiteenlopende hoeveelheden van de SOD en FTN gemengde standaard van 200 ug / l tot 6000 ug / L geïnjecteerd op de kolom voor Cu en Zn en 2000 ug / L tot 60.000 ug / L Fe. Injectie volumes variëren van 1 tot 30 pi. Opmerking: deze concentratiebereiken omvatten de concentratie van Fe, Cu en Zn typisch waargenomen in complex homogenaten. Voor monsters die alleen gezuiverde eiwitten bevatten het maximale bereik van de curve dienovereenkomstig moet worden aangepast. Wanneer de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kan een kleiner of groter bereik worden omdat er minder vervuiling van het monster van andere factoren. </li><li> Analyseer elke onbekende weefselmonsters, plasma of celkweek. </li></ol> 5. Data-analyse, manipulatie en visualisatie <ol><li> Sla de gegevens in de door komma&#39;s gescheiden waarden (csv) bestandsformaat en laad inom verwerkingsprogramma&#39;s zoals vereist. </li><li> Om te controleren voor instrument drift, verdeel de tellingen per seconde voor elk element van de tellingen per seconde voor zowel Cs of Sb. </li><li> Genereer kalibratiecurven voor elk van de elementen. <ol><li> Bepaal het oppervlak onder de metalen piek die overeenkomt met de metalloproteïne die aan elk van de injecties wordt gebonden door het uitvoeren piekintegratie de voorkeur gegevensanalyse software. </li><li> Plot het gebied onder de metalen piek ten opzichte van de totale hoeveelheid van het metaal dat op de kolom werd geïnjecteerd in elke run, 200 - 6000 ug / l voor Cu en Zn en 2000 - 60.000 ug / L Fe. Voer lineaire regressieanalyse met de softwareprotocol. </li><li> Met de resultaten helling van de lineaire regressieanalyse als factor tellingen per seconde omzetten pg / sec. Verdeel elk van de tellingen per seconde data locaties in het chromatogram door het stijgingspercentage van de lijn waarde. </li></ol></li><li> Grafiek van de gegevens inpg / sec tegen de chromatogram tijd. Bepaal het oppervlak onder de pieken van belang. Het oppervlak van de piek geeft de totale hoeveelheid metaal dat het eiwit is gebonden aan, in pg. </li><li> Genereer een ijking op basis van het molecuulgewicht van de bekende metalloproteïnen en het tijdstip waarop ze elueren. Gebruik de omvang van de eiwitpieken schatten complexe monsters. </li></ol>

<ol><li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li>
<li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Treatment+with+CuII+%28atsm%29+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer%27s+disease+is+due+to+transferrin+desaturation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+CHEM+NEUROSCI%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li>
<li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li>
<li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics%3A+challenges+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li>
<li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection%28SEC-ICP+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+At.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li>
<li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Cu-%2C+Fe-%2C+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li>
<li>Richarz, A. N., Brätter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer%27s+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+iron%2C+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li>
<li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610(2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Zorgen de natuurlijke toestand van het eiwit betekent bijzondere aandacht aan de gebruikte buffers en opslag van het monster nodig. Niet alle chromatografietechnieken of staalvoorbereidingstechnieken kunnen worden toegepast. Het is belangrijk dat de gebruikte gedurende monsterbereiding en chromatografie buffers ontberen metaalchelatoren en gebruiken buffers die fysiologische pH en zoutconcentraties nabootsen. Andere voorwaarden om te voorkomen dat zijn voorzien van verwarming van het monster of de toevoeging van eiwit denaturerende (bijvoorbeeld ureum). Het is cruciaal om het aantal vries dooicycli minimaliseren. Het vermogen van de gekozen buffer divalente metalen te binden ook belangrijk en is een reden dat Tris of ammoniumnitraat buffers worden verkozen boven fosfaathoudende buffers. De lage resolutie en piekvermogen van de gelpermeatiechromatografie ten opzichte van andere vormen van chromatografie is een belangrijke beperking van deze techniek. Echter, de zachte aard van size exclusion Chromatography is belangrijk om de natuurlijke toestand van het eiwit behouden, en aldus het behoud van de relatief zwakke metaal-eiwit bindingen. De eis om de natuurlijke toestand van de proteïnen te behouden vereist speciale aandacht voor de behandeling van de monsters zoals het beperken van het aantal invries dooicycli vermijden metaal chelatoren (bijvoorbeeld EDTA) of chaotrope zouten en detergenten. Deze lage resolutie van deze techniek invloed op de mogelijkheid om de hoeveelheid metaal geassocieerd met een specifiek eiwit te kwantificeren als het in een complex monster de pieken die meer dan één eiwit bevatten. Daarom zou de hoeveelheid metalen bepaald volgens de piekintegratie een indicatie van de totale hoeveelheid metaal betrokken bij al de eiwitten geëlueerd op dit tijdstip en niet slechts een specifiek eiwit. Om deze beperking te omzeilen het gewenste eiwit zou verder worden gezuiverd onder natieve omstandigheden. Dit zou voor de kwantificering vanhet metaal geassocieerd met het eiwit Vermeld een hogere certainity. Een andere potentiële beperking van deze techniek zou het verlies van eiwit door niet reversibele binding aan de kolom. Om te bepalen of dit gebeurt herstel proef moet worden uitgevoerd, waarbij de hoeveelheid eiwit geëlueerd uit de kolom wordt geanalyseerd om te bepalen of dit overeenkomt met de geïnjecteerde hoeveelheid. Hetzelfde kan gebeuren door het metaalgehalte van de elutie materiaal en het uitgangsmateriaal door bulk ICP-MS. Winningskolom kan afhankelijk van de gebruikte omstandigheden, maar het is aangetoond dat volledige terugwinning van eiwitten uit een gelfiltratiekolom mogelijk 9. Dus is het belangrijk om te controleren of er enige schade onder de bedrijfsomstandigheden wordt gebruikt. Wijzigingen aan het protocol kan worden gerelateerd aan de metalloproteïne normen en worden gebruikt als elementen geanalyseerd. Het type metalloproteïne standaard onsed zal verschillen afhankelijk van de elementen die van belang zijn. Voor elementen zoals Cu, Fe en Zn eiwitten, SOD en ferritine worden toegepast. Andere metalloproteïne waarvan bekend stoichometries hebben kunnen ook worden gebruikt en enkele voorbeelden zijn zijn. Een belangrijke complicatie die kan voortvloeien uit het gebruik van deze techniek is de opbouw van zoutkristallen in de fakkel van de ICP-MS. De opbouw van zoutkristallen te voorkomen, wordt de toorts gewassen met gedestilleerd water na elke 500 - 1000 ml buffer die door het systeem is gepasseerd of wanneer wordt bepaald door visuele inspectie dat indien de brander worden gewassen. Een ander probleem dat kan optreden is een snellere daling van de hygiëne van het monster en extractie kegels. Deze moeten regelmatig worden schoongemaakt volgende protocollen van de fabrikant. De eerste steekproef voorbereiding is de meest kritische fase in het protocol. Als er sprake is van veranderingen in het eiwit - metaalcomplex de informatie gegenereerd niet geldig. Dit is een van de belangrijkste beperkingen van de techniek; Naast het gebruik van de lage resolutie, gelfiltratiekolom levert een beperkt exacte afbeelding van de werkelijke complexiteit van metalloproteïnen in de biologie. De hier beschreven techniek maakt het mogelijk de uitbreiding van de kennis van de metalloproteome van een organisme. Bulkanalyse geeft slechts een ruwe indicatie van veranderingen in de hoeveelheid metaal in een monster. Naast de algemene overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden met deze techniek een instrument dat kan worden gebruikt om de hoeveelheid metaal geassocieerd met eiwitten en identificatie metalloproteïnen die verschillen door vergelijking van de sporen verkregen kwantificeren. Het gebruik van deze techniek kan worden gebruikt om verschillen tussen ziektetoestanden identificeren. De geïdentificeerde metalloproteïnen kan dan verder worden onderzocht om te bepalen de rol die zij spelen bij de ziekte van processen. De toepassing van koppelteken ICP-MS heeft een groeiendetoekomst de rol van geneesmiddelen die een heteroatoom zoals platina, jodium en koper als de ICP-MS bepaald kan worden gebruikt om de eiwitten die het geneesmiddel bindt te identificeren.

Essentiële metalen spelen een cruciale rol in de normale biologische functies, inclusief de secundaire messenger pathways, metabolisme paden en organel functies. 30% van alle proteïnen worden verondersteld om metalloproteïnen 1 en 50% van alle enzymen 2 zijn. Metallo gebruik maken van deze trace metalen als co-factoren om chemische reacties te katalyseren, stabiliseren eiwitstructuur en voor wettelijke taken zoals secundaire boodschappers. Enkele van de meest bestudeerde spoorelementen met betrekking tot neurodegeneratie zijn koper, ijzer en zink 3. Ze zijn gedacht te worden betrokken bij veel ziekte trajecten waar de door dyshomeostasis kan nadelige invloed. Bijvoorbeeld metalen status van superoxide dismutase (SOD) rechtstreeks invloed op de levensduur en fenotype van de transgene muizenmodellen van familiale vorm van amyotrofische laterale sclerose (ALS) 4. Bij de ziekte van Alzheimer, zijn metalloproteomics technieken gebruikt om een ​​afname van het metaal status van transferrine in p ontdekkenLasma 5. Deze studies wijzen op de belangrijke rol metalloproteïnen kunnen spelen bij de ziekte. De studie van metalloproteïnen rechtstreeks van biologische weefsels is een ontwikkelende gebied. Hoewel sommige metallo zijn gekarakteriseerd, de meerderheid nog steeds gekarakteriseerde of onbekende 6. Een van de belangrijkste problemen bij het ​​meten metalloproteïnen de verplichting om de natuurlijke toestand van het eiwit 7 handhaven. Klassieke bottom-up proteomische technieken vertrouwen op de vertering van de eiwitten in peptiden. Dit proces verstoort de niet-covalente interactie van metalen en eiwitten. Derhalve wordt geen informatie over de status van een metaal eiwit gewonnen. Een manier om dit probleem te overwinnen is door gelpermeatiechromatografie gekoppeld met inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie 8,9 (SEC-ICP-MS). Dit levert informatie over geschatte grootte van het eiwit alsmede eventuele metalen die associated ermee 10. Verder grootte uitsluiting een zachte chromatografische techniek die de natieve toestand van een enzym of eiwit-eiwitcomplex kan bewaren. Een voordeel van inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is de kwantitatieve aard van de technologie. Met behulp van een set van metalloproteïnen normen is het mogelijk om absolute kwantificering van metalloproteïnen bieden tegen biologische monsters 9,11. Dit wordt bereikt door het genereren van een standaardcurve van bekende injecteren metalloproteïnen over een bereik van metaalconcentraties. Dit protocol toont een voorbeeld van hoe dit kan worden bereikt voor verschillende metalloproteïne normen. In dit artikel willen we standaard curves voor metalen die grotendeels onderzocht biologisch gebied waaronder ijzer (Fe), koper (Cu), zink (Zn), jood (I) en kobalt (Co) maken.

<table><tbody><tr><td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ammonium hydroxide trace metal basis&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ammonium nitrate&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Maak een verse 200mM oplossing op de dag van het experiment</td></tr><tr><td>&nbsp;Antinomy&nbsp;</td><td>Choice analytical&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ceruloplasmin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Cesium&nbsp;</td><td>Choice analytical&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Complete, EDTA free protease inhibitors&nbsp;&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Conalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Cu, Zn Superoxide dismutase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ferritin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ICP-MS multielemental calibration standards&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Opgemaakt tot de vereiste concentraties in 1% salpeterzuur</td></tr><tr><td>&nbsp;Microvolume UV spectrophotometer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;65% Salpeterzuur&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>Verdund tot 1% voor gebruik</td></tr><tr><td>&nbsp;Peek tubing&nbsp;&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 &mu;m, 150 &Aring;&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Natriumchloride&nbsp;</td><td>Chem Supply</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Tris Hydrochloride&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals inc.&nbsp;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Thyroglobuline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Vitamine B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

normen voor quantitative metalloproteomic analyse met behulp van size exclusion icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metalen zijn essentieel voor eiwitfunctie als cofactoren om chemische reacties te katalyseren. Verstoring van de metaalhaomeostase wordt in verband gebracht met een aantal ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en Parkinson, maar de exacte rol die deze metalen spelen, moet nog volledig worden opgehelderd. Identificatie van metalloproteïnen stuit op veel uitdagingen en moeilijkheden. Hier beschrijven we een benadering die het mogelijk maakt om metalloproteïnen in complexe monsters te kwantificeren. Dit wordt bereikt met behulp van grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (SEC-ICP-MS). Met behulp van zes bekende metalloproteïnen kan de grootte-exclusiekolom worden gekalibreerd en kunnen de respectieve sporenelementen (ijzer, koper, zink, kobalt, jodium) worden gebruikt voor kwantificering. SEC-ICP-MS-sporen van menselijk hersenweefsel en plasma worden gepresenteerd. Het gebruik van deze metalloproteïnestandaarden biedt de mogelijkheid om de abundantie van metalloproteïnen kwantitatief te vergelijken tussen biologische monsters. Deze techniek staat klaar om licht te werpen op de rol van metalloproteïnen bij neurodegeneratieve ziekten, evenals andere ziekten waarbij onevenwichtigheden in sporenelementen worden geïmpliceerd.

Het gebruik van metalloproteïne standaarden maakt het kalibreren van de gelfiltratiekolom. Figuur 1A toont het elutieprofiel van de normen thyroglobuline, ferritine, ceruloplasmine, Cu / Zn SOD en vitamine B 12 basis van de metalen die verbonden om (Fe, Co, Cu, Zn en I). Figuur 1B toont de ijkkromme voor de gelfiltratiekolom basis van het molecuulgewicht van eiwitstandaarden en hun elutietijd, gepresenteerd in de vorm van elutievolume (Ve) gedeeld door het lege volume van de kolom (Vo). De eiwitten gebruikt om deze standaard curve te genereren zijn concanavaline A, conalbumine, ceruloplasmine, ferritine, SOD en thyroglobuline. Figuur 2A toont de elutie van ferritine een bereik van 2000 - 60.000 ug Fe geïnjecteerd op de kolom en figuur 2D is de regressieanalyse uitgevoerd met peak gebied. Figuren 2B en 2C zijn de elutie profielen voor Cu / Zn SOD voor Cu en Zn en 2E en 2F zijn de regressieanalyses gegenereerd met behulp van de piekoppervlakken. De resultaten van de regressieanalyse wordt gebruikt om de ruwe data in tellingen / sec omzetten pg / sec, zodat de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kwantitatief worden bepaald. De omzetting wordt uitgevoerd door het delen van de tellingen / sec door de helling van de lineaire regressie (bijvoorbeeld 334,6 (tellingen / sec) x (sec / pg) of koper). Zoals vermeld, kan deze techniek worden gebruikt om metalloproteïnen in complexe biologische monsters te identificeren. Menselijke hersenen en plasma zijn onderworpen aan deze techniek en Figuren 3 en 4 tonen respectievelijk de resultaten verkregen. Menselijke hersenen gescheiden door SEC-ICP-MS wordt getoond in figuren 3A-3C, elk overeenkomende met een ander metaal<html> belang (Cu, Zn of Fe). Figuren 4A-4C tonen de sporen verkregen wanneer humaan plasma is onderworpen aan deze techniek. De complexiteit en de grootte van het monster het aantal pieken die worden gezien beïnvloeden. Zoals verwacht plasma wordt gedomineerd door een paar metalloproteïnen waaronder ceruloplasmine en transferrine. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figuur 1. De kalibratie van Size Exclusion Chromatography - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie met behulp van bekende metalloproteïnen (A) Elutie profiel voor de metalloproteïne normen op basis van hun respectieve metalen.. (B) Molecuulgewicht kalibratiekromme voor eiwitstandaarden thyroglobuline (i), ferritine (ii), ceruloplasmine (iii), conalbumine (iv), Cu / Zn SOD (v) en concanavaline A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figuur 2. Het gebruik van Ferritin en Cu / Zn SOD als metalloproteïne Standards om de hoeveelheid Cu, Fe en Zn in verband gebracht met metalloproteïnen bepalen in een complex biologisch monster (A) Elutie profiel voor ferritine over de injectie range 2000 -. 60.000 ug / L van ijzer. (B) en (C) elutieprofiel van Cu / Zn SOD via injectie bereik van 200 - 6000 mg / l koper en zink, respectievelijk. (D), (E) en (F) tonen de regressie-analyse resultaten van de metalen ijzer, koper en zink, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 3. Cu, Fe en Zn Metalloproteome van het menselijk brein. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) zink trace. Elutie van het eiwit normen voor elk metaal wordt getoond door de zwarte trace met hun moleculair gewicht onder de grafiek aangegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figuur 4. Cu, Fe en Zn Metalloproteome for Human Plasma. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) zink trace. Elutie van de eiwitstandaarden voor elk metaal wordt aangegeven door de zwarte trace met hun molecuulgewichtdicated onder de grafiek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.

Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Het algemene doel van deze techniek is om verschillende metalloproteïnen in complexe standaarden te kunnen kwantificeren op basis van het gebruik van bekende metalloproteïne-standaarden. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over de rol van metalen in de biologie. Bijvoorbeeld: hoe verandert de metaalstatus van een proteïne bij ziekte?Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de metaalstatus van een eiwit in zijn natuurlijke toestand te meten. Amber Lothian, een promovendus uit mijn laboratorium, zal de techniek demonstreren. Begin met het homogeniseren van weefsel of celkweekmonsters door middel van handmatige homogenisatie of sonicatie gedurende vijf minuten met gebruik van Tris-gebufferde zoutoplossing.Clarificeer de homogenaten door centrifugatie bij 16.000 ×g gedurende vijf minuten. Nadat het resulterende supernatant is verzameld, wordt de totale hoeveelheid eiwit genormaliseerd door de eiwitconcentraties te bepalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Warm de inductief gekoppelde plasmamassaspectrometer op en stem deze af volgens de protocollen van de fabrikant.Verdun de metalloproteïnestandaarden met één procent salpeterzuur om een bereik van nul tot 500 microgram per liter te verkrijgen. Om standaarden binnen dit bereik te verkrijgen, mogen verdunningen groter dan 1:20 niet worden gebruikt. Bepaal de volgorde van de injecties door eerst de zeven kalibratieniveaus te analyseren.Concentraties variërend van nul tot 500 µg/L, gevolgd door de metalloproteïnestandaarden. De zeven kalibratieniveaus zijn nul, één, vijf, tien, 50, 100 en 500 µg/L. Selecteer vervolgens de elementen van belang.Gebruik hier ijzer, koper, zink, kobalt en jodium, aangezien dit de elementen zijn waaraan de eiwitstandaarden zijn gebonden. Selecteer de elementen in de acquisitiemethode door het tabblad voor elementenselectie te openen en de elementen en hun respectieve isotoopmassa's toe te voegen die geanalyseerd moeten worden.Voer vervolgens de monsteranalyse uit met het instrument. De software van het instrument maakt automatisch de kalibratiecurven voor elk van de geanalyseerde elementen. Gebruik de kalibratiecurven om de metaalconcentratie in de onbekende monsters te bepalen.Genereer op basis van de resultaten van de bulkanalyse de metalloproteïnestandaarden die de drie meest voorkomende sporenelementen in zoogdierweefsels bevatten, met behulp van een mengsel van koper, zinksuperoxidedismutase en ferritine. Spoel de hyperperformance vloeistofchromatografie- (HPLC)pompen vijf minuten lang door met 200 millimol ammoniumnitraatbuffer bij een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut. Zodra het systeem is doorgespoeld, wordt de stroomsnelheid ingesteld op nul komma één milliliter per minuut.Sluit vervolgens de exclusiekolom aan. Verbind het opposite uiteinde van de kolom met de UV-detector en stel de absorptiemeting in op 280 nanometer met behulp van piekbuisjes. Verhoog de stroomsnelheid van de kolom geleidelijk in stappen van 0,1 ml/min, totdat een uiteindelijke stroomsnelheid van 0,4 ml/min is bereikt.Terwijl dit gebeurt, controleert u de slangverbindingen met de kolom op lekken. Houd de systeemdruk in de gaten om er zeker van te zijn dat deze de kolomvereisten niet overschrijdt door de drukcurve op het chromatogram in de software te observeren. Laat de kolom equilibreren bij de vereiste stroomsnelheid over vijf tot 10 kolomvolumes.Zodra het systeem geëquilibreerd is, sluit u de instrumenten aan om de monsteranalyse mogelijk te maken. Stel de HPLC-methode zo in dat buffer A gedurende 15 minuten met een snelheid van 0,4 mL per minuut over de kolom wordt gepompt. Zet de ICPMS in de stand-bymodus voordat u de hardware-instellingen wijzigt.Zodra de stand-bymodus is ingeschakeld, schakelt u de communicatie voor de autosampler uit en wijzigt u de monsterintroductie naar 'other'. Gebruik PEEK-tubing om de uitstroom van de UV-detector rechtstreeks met de nebulizer op de ICPMS te verbinden. Zet de ICPMS aan en laat het instrument 10 tot 20 minuten opwarmen.Zodra het plasma is ontstoken, sluit u de afstandsbedieningskabel van de ICPMS aan op de achterzijde van de HPLC-autosampler. Doe dit pas nadat het plasma is ontstoken. Anders zal het HPLC-systeem automatisch uitschakelen, aangezien de ICPMS niet aan staat.Pas de ICPMS-methode aan om gegevens voor LC ICPMS te verzamelen door eerst de acquisitiemethode te wijzigen van spectrum naar tijd-opgeloste acquisitie. Selecteer vervolgens de te analyseren elementen, zoals ijzer, koper, zink, kobalt, jodium en eventuele andere relevante elementen, en stel de integratietijden in.Nadat de elementen van belang zijn gekozen, wordt de acquisitietijd aangepast om overeen te komen met de looptijd van de chromatografie. Stem de ICPMS handmatig af op de gevoeligheid en de heliumgasstroom van de collisiecel, terwijl er een chromatografiebuffer stroomt waarin cesium en antimoon zijn opgenomen. Zodra de tellingen van de metaalionen zijn gestabiliseerd en de waarden voor de relatieve standaarddeviatie onder de vijf procent liggen, is het systeem klaar voor gebruik.Maak monsterlijsten aan in zowel de HPLC- als de ICPMS-softwareprogramma's. De monsterlijst bevat de volgorde waarin elk van de monsters moet worden geïnjecteerd, evenals de naam waaronder de gegevens worden opgeslagen.Controleer of het totale aantal monsters in de lijst in beide programma's overeenkomt. Start de monsterbatch voor de ICPMS vóór die van de HPLC, aangezien de injectie van het monster door de HPLC de ICPMS activeert om gegevens te gaan verzamelen. Als dit niet in de juiste volgorde gebeurt, zal dit leiden tot ontbrekende gegevens.Genereer kalibratiecurve-punten door variërende volumes van de gemengde standaard van superoxide dismutase en ferritine te injecteren. De injectievolumes variëren van 1 µL tot 30 µL. Analyseer vervolgens elk van de onbekende monsters, zoals weefsel, plasma of celcultuur, voordat de gegevens worden geanalyseerd zoals beschreven in het tekstprotocol.De elutie van ferritine over een bereik van 2000 tot 60.000 picogram geïnjecteerd ijzer op de kolom wordt getoond. De regressieanalyse is uitgevoerd op basis van de piekarea. De elutieprofielen voor koper, zink en superoxide dismutase worden getoond voor zowel koper als zink.De regressieanalyses die zijn gegenereerd op basis van piekgebieden worden ook weergegeven. De resultaten van de regressieanalyse worden gebruikt om de ruwe gegevens in counts per seconde om te rekenen naar picogrammen per seconde, zodat de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kwantitatief kan worden bepaald.Deze techniek kan worden gebruikt om metalloproteïnen in complexe biologische monsters te identificeren. Hier wordt een menselijk brein getoond dat is gescheiden via SEC ICPMS. Elk hiervan vertegenwoordigt een ander metaal van belang.Namelijk koper, zink of ijzer. Hier worden de sporen getoond die worden verkregen wanneer menselijk plasma aan deze techniek wordt onderworpen. De complexiteit en overvloed van het monster zullen van invloed zijn op het aantal zichtbare pieken.Zoals verwacht wordt plasma gedomineerd door een klein aantal metalloproteïnen, waaronder ceruloplasmine en transferrine. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het instellen van een instrument om de natuurlijke toestand van metalloproteïnen in complexe monsters te meten. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze succesvol binnen drie tot vier uur worden toegepast.Hiermee kunnen 20 tot 36 monsters in één dag worden geanalyseerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de juiste metalloproteïnestandaarden te gebruiken, zoals koper-zink SOD als u geïnteresseerd bent in koper en zink, evenals de interne standaarden in de buffer, zoals cesium, waarmee u eventuele drift van het instrument in de loop van de tijd kunt corrigeren.Na deze procedure kunt u ook andere vormen van massaspectrometrie toepassen om belangrijke vragen te beantwoorden. Zoals: welke metalloproteïnen zijn aanwezig in mijn monster? Dit kan worden gedaan via standaard trypsinevertering en eiwitpeptide-sequenering met massaspectrometrie.Of door de eiwitten intact te analyseren, in hun natuurlijke staat. Na de ontwikkeling van deze techniek kan dit de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van proteomics om de rol van metalloproteïnen bij ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, te begrijpen. Vergeet niet dat er wordt gewerkt met geconcentreerd salpeterzuur en klinische monsters.Passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen.

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Een protocol voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie wordt gepresenteerd.

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Dit protocol beschrijft het gebruik van hoge-specificiteit-ionenwisselingschromatografie met multi hoek lichtverstrooiing voor een nauwkeurige molmassabepalingen van eiwitcomplexen, eiwitten en peptiden in een heterogene monster. Deze methode is waardevol voor kwaliteitsbeoordeling, alsook wat betreft de karakterisatie van inheemse oligomeren, gratis varianten en gemengd-EiwitSteekproeven.

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Deze ijzerrorox speciatie methode is gebaseerd op capillaire elektroforese-inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie met monster stapelen in combinatie met korte analyse in een run. De methode analyseert en biedt snel lage limieten van kwantificering voor ijzerredoxsoorten in een breed scala van weefsels en biofluïde monsters.

Opstelling van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS) voor kwantificering van ijzerrederoxsoorten (Fe(II), Fe(III))

Hier presenteren we een protocol om de volledige biomoleculaire corona, eiwitten en metabolieten te karakteriseren, verkregen door nanomaterialen uit biofluïden met behulp van een capillaire elektroforese - massaspectrometriebenadering.

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Leer hoe u metalloproteïnen kwantitatief analyseert met size exclusion chromatografie gekoppeld aan ICP-MS. Deze methode meet metalen in hun native toestand in biologische monsters voor inzicht in ziekteprocessen.

Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

Meer video's verkennen