RNAi Trigger delivery in

Het algemene doel van deze methode is de aflevering van triggers voor RNA-interferentie in Anopheles gambiae om gen-knockdowns te initiëren die beginnen tijdens het popstadium van de ontwikkeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de vectrobiologie en het ontdekken van genen die een rol spelen tijdens de pre-adulte of vroege adulte ontwikkelingsstadia. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers de mogelijkheid biedt om snelle functionele genomische studies uit te voeren, waarbij de gen-knockdown start tijdens het ontwikkelingsinterval van het popstadium, een fase waarin RNA-interferentie-injectieprotocollen in het verleden niet zijn geïmplementeerd.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de injectiestappen moeilijk te beheersen kunnen zijn vanwege de vereiste precisie en de kwetsbaarheid van de poppen tijdens dit ontwikkelingsstadium. Selecteer het gen van belang, identificeer een regio van 200 tot 800 basenparen waarvan wordt voorspeld dat deze geen off-target effecten heeft, en voer een standaard PCR-amplificatie uit om een template voor de synthese van dubbelstrengs RNA te verkrijgen, geflankeerd door een T7-promotersequentie. Synthetiseer vervolgens het dubbelstrengs RNA en zuiver de producten met een commerciële in vitro kit.

Stel de uiteindelijke RNA-concentratie in op drie microgram per microliter. Gebruik vervolgens een standaard 2% agarosegel om een halve microliter van het dubbelstrengs RNA te vergelijken met het template-DNA en standaardmarkers. Controleer na het runnen de kwaliteit en lengte van de dubbelstrengs RNA-band.

Er mogen geen zichtbare aspecifieke producten aanwezig zijn. Het dubbelstrengs RNA zal langzamer migreren dan het template-DNA. Bereid voor bewaring aliquoten van het dubbelstrengs RNA voor en bewaar deze bij -20 °C.

Begin met het klaarmaken van de Fast Green FCF-kleurstof. Verdun eerst de kleurstof tot 0,1% volume/volume in RNase-vrij water. Breng vervolgens volumes van één microliter van deze oplossing over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.

Verwarm de gevulde buisjes gedurende ongeveer drie uur bij 65 °C om het water te laten verdampen. Koel de buisjes vervolgens gedurende ten minste 30 minuten af voordat de vaste kleurstof wordt gebruikt. Bereid daarna injectienaalden van getrokken glas uit borosilicaatglazen buisjes.

Stel de naaldtrekker in op een tipdiameter van 10 tot 30 micron. Stel voor een NARISHIGE capillaire trekker de eerste verwarmer in op 100 en de tweede verwarmer op 70. Klem vervolgens de capillaire naald vast en begin met het trekken.

Bereid nu het injectiestation voor. Kies een platform dat gemakkelijk onder de microscoop gemanoeuvreerd kan worden. Plak eerst een dik filterpapier op het platform vast.

Plak vervolgens één dun filterpapier op het dikke filterpapier. Voeg daarna 10 µL van elk te injecteren dubbelstrengs RNA toe aan de buisjes met de vaste kleurstof en resuspendeer de kleurstof. Bewaar deze buisjes op ijs.

Verzamel nu de poppen die geïnjecteerd moeten worden. Vul een petrischaal van 60 millimeter met 10 milliliters gedeïoniseerd water en breng ongeveer 50 bleekgekleurde poppen over naar de schaal met een plastic transferpipet. Gebruik alleen licht gepigmenteerde poppen, aangezien poppen die al een gemiddeld tot donker looinitieerniveau hebben bereikt, cuticle-schade zullen oplopen en een lage overlevingstijd hebben.

De eerste stap van de micro-injectie is het openen van de naald. Breek onder de microscoop de uiterste distale punt van de naald af met een fijne pincet. Vul de naald vervolgens via de achterzijde met minerale olie met behulp van een naald van 30 gauge en een spuit.

Zodra deze is gevuld, wordt het overtollige olie met de micro-injector uitgestoten. Stel de micro-injector in om volumes van 69 nanoliter op te zuigen. Vul vervolgens de naald aan de voorzijde met het voorbereide injectie-RNA.

Test de dispensatie van dubbelstrengs RNA op eventuele problemen. Verstoppingen in de tip en onvoldoende vastgezette naalden zijn de belangrijkste bronnen van problemen. Zodra de injector is voorbereid, selecteer je één tot drie poppen en breng je deze over naar de filterpapierfase.

Positioneer de pop met een penseel zodanig dat de dorsale cuticula toegankelijk is. Door op het papier te drukken, wordt het overtollige water op de poppen geabsorbeerd. Terwijl de pop met een nat penseel wordt vastgehouden, wordt de naald met een beweging van anterieur naar posterieur in de dorsale cuticula tussen het abdomen en de thorax ingebracht, onder een hoek van ongeveer 30 graden.

Inject vervolgens één tot twee pulsen dubbelstrengs RNA in de hemolymfe. Indien de injectie is geslaagd, moet de verspreiding van de kleurstof door het gehele lichaam zichtbaar zijn. Tijdens het injecteren van de pop is het essentieel dat de naald alleen door de dorsale cuticula prikt.

Als de naaldpunctie door de ventrale cuticula heen gaat, zal er zichtbare ophoping van kleurstofgelabelde vloeistof aan de buitenkant van de pop ontstaan, of zal de kleurstof overgaan op het filterpapier. In dergelijke gevallen moet de pop worden weggegooid. Als de kleurstof zich niet verspreidt door de hemolymfe, is de punt zeer waarschijnlijk verstopt.

Beweeg de tip lichtjes en bepaal of er RNA en kleurstof is vrijgekomen. Als er geen aanwijzing is voor het vrijkomen van kleurstof, gooi de pop dan weg. Beoordeel vervolgens de punt van de naald en voer een nieuwe injectie uit bij een nieuwe pop.

Nadat een pop succesvol is geïnjecteerd, gebruikt u het natte penseel om deze voorzichtig van de naald te bevrijden en verplaatst u deze naar de schaal met water waarin de ontwikkeling zal worden voltooid. Plaats de schaal met geïnjecteerde poppen in een muggenkooi of container onder normale kweekcondities. Bied voor de volwassen stadia een voedingsbron aan in de vorm van glucose in een 10% gewicht-per-volume oplossing, geabsorbeerd in een wattenbol.

Nadat de volwassen insecten zijn uitgekomen, moeten deze worden vergeleken met de controles. Zo moeten insecten met dubbelstrengs SRPN2 dagelijks worden beoordeeld op de vorming van pseudotumoren. Doe dit door de volwassenen twee tot drie minuten te koelen bij min 20 graden Celsius en ze vervolgens over te brengen naar een koudeplaat van twee graden Celsius voor observatie.

Keer na het bekijken van de volwassen insecten terug naar het kweekgedeelte van het insectarium. Zodra de techniek onder de knie was, kwamen geïnjecteerde poppen met een frequentie van ongeveer 70% uit. Bij een subset van de geïnjecteerde poppen trad een gedeeltelijke uitkomst uit de poppenschil op, wat leidde tot niet-levensvatbare muggen. Er was geen vertraging in de uitkomstpercentages tussen geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde muggen, en de effecten van de injectie varieerden niet per geslacht.

Tien dagen na het uitkomen was er geen noemenswaardige verandering in de overleving van de geïnjecteerde muggen in vergelijking met de niet-geïnjecteerde controles. De serineprotease-remmer SRPN2 werd gebruikt als positieve controle, en dubbelstrengs LacZ werd gebruikt als negatieve controle voor de injecties van dubbelstrengs RNA. Drie dagen na het uitkomen waren pseudotumoren in de volwassenen die waren geïnjecteerd met dubbelstrengs SRPN2 zichtbaar via lichtmicroscopie.

Na acht dagen waren pseudotumoren zeer prominent aanwezig. Bij muggen in het volwassen stadium waren melanotische pseudotumoren waarneembaar door het cuticulum bij de meeste dieren waarin dubbelstrengs SRPN2 was geïnjecteerd, terwijl er geen pseudotumoren waarneembaar waren in de controles. Vijf dagen na injectie waren de SRPN2-proteineniveaus significant lager in muggen waarin dubbelstrengs SRPN2 was geïnjecteerd, vergeleken met controles waarin dubbelstrengs LacZ was geïnjecteerd en niet-geïnjecteerde controles.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u RNA-interferentie-triggers kunt toedienen in pupae van Anopheles gambiae met behulp van dit nieuw ontwikkelde injectieprotocol. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de onvoorspelbare beweging van de pop. Echter, het oefenen van de juiste positionering en stabilisatie van de pop verhoogt de mate van succesvolle injectie en de kwaliteit van de injectie aanzienlijk.

Zodra u de techniek beheerst, vereisen deze injecties ongeveer 30 seconden per pop. Met de ontwikkeling van deze techniek hebben we de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de vectrobiologie om genfuncties te onderzoeken en te beoordelen tijdens de pre-adulte en vroege adulte ontwikkelingsstadia in de malariavector Anopheles gambiae. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Western blot-analyse of kwantitatieve PCR, worden uitgevoerd om de mate van knockdown van het doelgen te bepalen op respectievelijk eiwit- of transcriptieniveau.

Uiteindelijk kan deze techniek helpen bij het identificeren van genen die cruciaal zijn voor de overdracht van parasieten door muggen, en deze aanpak zal ons helpen nieuwe doelwitten te identificeren en nieuwe inzichten verschaffen in hoe we effectievere strategieën voor vectorkeuze kunnen ontwikkelen.