Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer
16 maart 2016
Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.
Het algemene doel van deze procedure is om kwantificerbare observaties te maken van het temporele en ruimtelijke voorkomen van neuronale exocytische vesikelfusie en axonvertakking. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van de neurowetenschappen, zoals wanneer en waar vesikelfusie membraanmateriaal invoegt in de uitdijende plasmamembraan tijdens neuronale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het levende celbeeldvorming combineert om zowel hoge ruimtelijke als temporele resolutie in enkele cellen te verkrijgen en biochemische benaderingen om op populatie gebaseerde informatie te verkrijgen.
Na het kweken en simuleren van corticale neuronen met Netrin-1 of een controle volgens de protocoltekst. Aspergeer PBS van de eerste put van een voorwaarde en vervang door 250 microliter homogenisatiebuffer. Incubeer gedurende vijf minuten op ijs, en homogeniseer vervolgens de cellen op ijs met behulp van een cell lifter.
Aspergeer de PBS van de volgende put van dezelfde voorwaarde en voeg het recent gehomogeniseerde mengsel toe aan de put die de eiwitconcentraties zal verhogen. Breng vervolgens de gehomogeniseerde oplossing over naar een voorgekoelde 1,6 milliliter microfugebuis op ijs, en voeg 20% Triton X-100 toe om een eindconcentratie van 1% te bereiken. Tritureer vervolgens met een 1.000 microliter pipet de mengsel tien keer terwijl luchtbellen worden geminimaliseerd. Incubeer de buizen gedurende twee minuten op ijs om de eiwitten te solubiliseren.
Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 6.010 RCF bij 4 graden Celsius om het niet-solubilized materiaal te pelletten. Breng de lie state supernatant over in een nieuwe gekoelde 1,6 milliliter buis op ijs. Gebruik vervolgens de Bradford-assay om de eiwitconcentratie te bepalen.
Gebruik vervolgens homogenisatiebuffer met 1% Triton X-100 en 5X monsterbuffer gesupplementeerd met BME om de monsters te verdunnen tot een eindconcentratie van 3-5 milligram per milliliter. Verdeel elk experimenteel monster gelijkmatig in twee buizen. Incubeer vervolgens één monster gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en de andere gedurende 30 minuten bij 100 graden Celsius.
Keer de buizen periodiek om om de monsters in oplossing te houden. Voer vervolgens SDS-pagina en Western blotting uit volgens het tekstprotocol. Na het instellen van de TIRF-microscoop en het monster en het vinden van een neuronale focale vlak volgens het tekstprotocol.
Start de lasersoftware en maak verbinding met de laserbesturingssoftware. Stel de verlichting in op breed veld en selecteer het objectief. Stel vervolgens de brekingsindex van het monster in en pas de laserintensiteit aan door TTL voor de 491-laser uit te schakelen.
Optimalisatie van beeldvormingsparameters is belangrijk tijdens het beeldvormen van intacte exocytische vesikel om focusdrift en fototoxiciteit te voorkomen terwijl beelden met een hoog signaal-ruisverhouding worden geproduceerd die voldoende zijn voor analyse. Stel de schuifregelaar in op 100 en breng deze vervolgens terug naar een waarde tussen 20 en 40. Controleer vervolgens TTL opnieuw.
Focus vervolgens opnieuw op het monster in getransmitteerde lichtverlichting. Selecteer vervolgens in de beeldvormingssoftware de 491-laserverlichting en open de sluiter. Plaats de condensator ondersteboven op de optische bank om de lens niet te krassen.
Stel vervolgens het brandpunt van de laser op het plafond fijn af en centreer het punt in het midden van het gesloten velddiafragma met de condensator verwijderd. Vervang vervolgens de condensator en stuur in de TIRF-software de penetratiediepte naar 110 nanometer. Schakel vervolgens over van breed veldverlichting naar TIRF-verlichtingsmodus voor beeldvorming.
Gebruik nu brede veldepifluorescentie om VAMP2-fluorent uitdrukkende cellen te vinden via de oculairen. Pas vervolgens de beeldvormingsparameters aan om het signaal-ruisverhouding en dynamische bereik te maximaliseren met minimale belichtingstijd en laserintensiteit. Stel continue autofocus per cel in.
Verwerf vervolgens een tijdsverloopbeeldset met acquisitie die elke 0,5 seconden gedurende vijf minuten plaatsvindt. Voeg voor de Netrin-1 gestimuleerde voorwaarde in een laminar flow hood toe aan een eindconcentratie van 500 nanogram per milliliter Netrin-1 aan een schaal met cellen en breng de schaal terug naar de incubator voor één uur voorafgaand aan beeldvorming. Om de frequentie van exocytische gebeurtenissen genormaliseerd per celarea en tijd te kwantificeren.
Open in ImageJ beeldstacks door het bestand in het venster te slepen of door Bestand, Open, bestandsnaam te kiezen. Gebruik Bestand, Stack, Z Project, Projection type Average Intensity om stabiele fluorescente signalen die geen vesikelfusie-gebeurtenissen vertegenwoordigen te verwijderen. Maak een gemiddelde Z Projection van de volledige stack.
Trek het resulterende gemiddelde beeld af van elk beeld in de tijdsverloop met Process, Image Calculator, Image 1 uw stack, Operation Subtract image two. Dit resulteert in een nieuw gecreëerde Z Projection. Dit zal exocytische gebeurtenissen benadrukken.
Tel nu met het blote oog exocytische fusiegebeurtenissen, die kunnen worden geïdentificeerd als vlekken van diffractie-beperkte fluorescente signalen die snel diffunderen terwijl VAMP2-fluoreen diffundeert binnen de plasmamembraan. Markeer het eerste beeld met Image, Adjust, Threshold, en pas de schuifregelaar aan totdat de hele cel is drempelwaarde gemarkeerd. Kies vervolgens onder Analyseren, Set Measurements en controleer het gebied en de weergavelabel.
Gebruik het wandtraceringsgereedschap om het drempelgebied van de cel in te stellen en druk op M om te meten. Breng de verzamelde gegevens over naar een spreadsheet volgens het tekstprotocol. Plaats op twee dagen in-vitro de glazen bodem beeldvormingsschaal met niet-getransfecteerde neuronen in een voorverwarmde vochtige omgevingskamer.
Gebruik een microscoop uitgerust met een zes DX plan apochromat 1.4 NA DIC objectieflens en een condensor met hoge numerieke apertuur voor de beste beeldkwaliteit en resolutie. Pas vervolgens de focale vlak aan met getransmitteerd licht om neuronen via oculairen te vinden. Voor DIC
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie gebruikt lichtmicroscopietechnieken en biochemische analyses om SNARE-gemedieerde exocytose in netrin-afhankelijke axonale vertakking te onderzoeken. De integratie van deze methoden maakt het mogelijk om moleculaire mechanismen te identificeren die axonale vertakking en veranderingen in celvorm reguleren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van axonale vertakking is cruciaal voor neuronale ontwikkeling.
- SNARE-eiwitten spelen een belangrijke rol bij vesikelfusie tijdens exocytose.
- Netrin-1 is een sleutelfactor die axonale geleiding en vertakking beïnvloedt.
- Live celbeeldvorming geeft inzicht in dynamische cellulaire processen.
Doel van studie
- Om het timing en locatie van neuronale exocytische vesikelfusie waar te nemen.
- Om te bepalen hoe vesikelfusie bijdraagt aan axonale vertakking.
- Om live beeldvorming te combineren met biochemische analyses voor een uitgebreide analyse.
Gebruikte methoden
- Live celbeeldvorming voor hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
- Biochemische analyses om gegevens op populatieniveau te verzamelen.
- Kweek en stimulatie van corticale neuronen met Netrin-1.
- Homogenisatie van cellen voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van de rol van SNARE-gemedieerde exocytose in axonale vertakking.
- Demonstratie van de ruimtelijke en temporele dynamiek van vesikelfusie.
- Inzichten in hoe membraanmateriaal wordt geïntegreerd tijdens neuronale ontwikkeling.
- Een methode tot stand brengen voor kwantificerbare waarnemingen in de neurowetenschap.
Conclusies
- De studie verbetert het begrip van axonale vertakkingsmechanismen.
- Het combineren van beeldvorming en biochemische technieken is effectief voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar neuronale ontwikkeling en functie informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the spatiotemporal regulation of plasma membrane delivery during axon branching provides mechanistic insights into neuronal morphogenesis relevant to neurodevelopmental disorder modeling. This combined methodology enables de-risking of target validation by linking SNARE-mediated exocytosis to structural plasticity in neuronal networks. The approach supports predictive confidence in early discovery by quantifying vesicle fusion dynamics as a functional readout of guidance cue signaling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of SNARE complex formation in netrin-1-dependent axon branching to validate vesicle fusion as a mechanistic node in neuritogenesis.
- Operational Value: Enables correlation of single-vesicle exocytic events with population-level SNARE biochemistry for multi-scale target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes TIRF microscopy of VAMP2-pHluorin as a quantitative assay for netrin-1-stimulated exocytic frequency normalized to cell area and time.
- Operational Value: Provides a standardized imaging protocol to detect changes in vesicle fusion kinetics upon pharmacological or genetic perturbation of SNARE machinery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates that botulinum toxin-mediated SNARE cleavage blocks netrin-1-dependent axon branching, establishing exocytosis as a necessary step in morphological plasticity.
- Operational Value: Supports use of DIC time-lapse imaging to quantify stable axon branch formation over 24 hours as a phenotypic readout for pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery imaging assays with biochemical validation to support target hypothesis testing in neuronal development pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guidance cue signaling through direct observation of vesicle fusion events in response to netrin-1 stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs of exocytic event frequency and axon branch metrics for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates measurable readouts including SNARE complex levels via Western blot, exocytic event counts via TIRF, and branch length via DIC imaging for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects molecular mechanism (SNARE-dependent exocytosis) to cellular phenotype (axon branching) enabling preclinical continuity in neurite outgrowth models.
- Enterprise Reuse: Combines live imaging and biochemical assays into a reusable platform for studying membrane dynamics in neuronal differentiation and regeneration models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by establishing SNARE-mediated exocytosis as a required process for netrin-1-driven axonal branching.
- Operational Value: Standardizes correlative imaging and biochemical workflows to improve reproducibility across laboratories studying neuronal morphogenesis.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking molecular perturbations (e.g., SNARE cleavage) to structural outcomes in neuronal networks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in vesicle trafficking and axonal connectivity based on functional phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, live-cell TIRF microscopy, and SNARE biochemistry.
- Depends on access to microfluidic imaging chambers, laser-based TIRF systems, and Western blotting infrastructure.
- Necessitates standardization of netrin-1 stimulation timing and toxin treatment protocols across experimental groups.
- Involves adaptation considerations for applying the assay to different neuronal subtypes or disease-relevant models.
- Limited by the technical complexity of correlating single-vesicle events with population biochemical assays without automated image analysis pipelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
SNARE Complex Formation Assay
3:12
Imaging Exocytic Events via TIRF Microscopy
8:08
Differential Interference Contrast Timelapse Microscopy of Axon Branching
10:10
Toxin Manipulations and Fixed Cell Immunofluorescence
11:13
Results: SNARE-mediated Exocytosis in Netrin-dependent Axon Branching
12:58
Conclusion
