Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Het algemene doel van deze procedure is om kwantificeerbare waarnemingen te doen van het temporele en spatiale voorkomen van neurale exocytische blaasjesfusie en axonale vertakking. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals wanneer en waar blaasjesfusie membraanmateriaal invoegt in het uitdijende plasmamembraan tijdens de neuronale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het live-cell imaging combineert om zowel een hoge spatiale als temporele resolutie in individuele cellen te verkrijgen, met biochemische benaderingen om populatiegebaseerde informatie te verkrijgen.

Nadat de corticale neuronen zijn gekweekt en gestimuleerd met Netrin-1 of een controle volgens de protocoltekst, wordt de PBS uit de eerste put van een conditie afgezogen en vervangen door 250 µL homogenisatiebuffer. Incubeer vijf minuten op ijs en homogeniseer vervolgens de cellen op ijs met behulp van een cellifter.

Zuig de PBS uit de volgende put met dezelfde conditie op en voeg het onlangs gehomogeniseerde mengsel toe aan de put, wat de proteïneconcentraties zal verhogen. Draag vervolgens de gehomogeniseerde oplossing over naar een vooraf gekoelde 1,6 milliliter microcentrifugebuis op ijs en voeg 20% Triton X-100 toe om een eindconcentratie van 1% te bereiken. Tritureer het mengsel vervolgens tien keer met een 1.000 microliter pipet, waarbij belvorming tot een minimum wordt beperkt. Incubeer de buizen twee minuten op ijs om de proteïnen te solubiliseren.

Centrifugeer vervolgens bij 6.010 RCF bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten om het niet-gesolubiliseerde materiaal te pelletteren. Breng de supernatant in vloeibare toestand over naar een nieuwe gekoelde buis van 1,6 milliliter op ijs. Gebruik vervolgens de Bradford-assay om de proteïneconcentratie te bepalen.

Gebruik vervolgens homogenisatiebuffer met 1% Triton X-100 en 5X monsterbuffer aangevuld met BME om de monsters te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 3-5 mg/mL. Verdeel elk experimenteel monster gelijkmatig over twee buisjes. Incubeer vervolgens één monster gedurende 30 minuten bij 37 °C en het andere monster gedurende 30 minuten bij 100 °C.

Keer de buisjes af en toe om om de monsters in oplossing te houden. Voer vervolgens SDS-PAGE en Western blotting uit volgens het tekstprotocol. Stel daarna de TIRF-microscoop en het monster in en bepaal een neuraal brandvlak volgens het tekstprotocol.

Start de lasersoftware en maak verbinding met de laserbesturingssoftware. Stel de belichting in op wide field en selecteer het objectief. Stel vervolgens de brekingsindex van het monster in en pas de laserintensiteit aan door TTL voor de 491-laser uit te vinken.

Het optimaliseren van de beeldparameters is essentieel bij het beelden van intacte exocytische blaasjes op de bodem om focusdrift en fototoxiciteit te voorkomen, terwijl beelden met een voldoende hoge signaal-ruisverhouding voor analyse worden geproduceerd. Verschuif de schuifregelaar naar 100 en breng deze vervolgens terug naar een waarde tussen 20 en 40. Controleer daarna de TTL opnieuw.

Focus vervolgens opnieuw op het monster bij verlichting met doorgelaten licht. Selecteer daarna in de beeldverwerkingssoftware de 491 laserverlichting en open de sluiter. Plaats de condensor ondersteboven op de optische bank om te voorkomen dat de lens wordt bekrast.

Stel het brandpunt van de laser op het plafond nauwkeurig af en centreer, terwijl de condensor is verwijderd, het punt in het midden van het gesloten veldiafragma. Plaats vervolgens de condensor terug en stel in de TIRF-software de penetratiediepte in op 110 nanometers. Schakel daarna over van breedveldverlichting naar de TIRF-verlichtingsmodus voor beeldvorming.

Zoek nu met behulp van breedveld-epifluorescentie via de oculairs naar cellen die VAMP2 fluorescentie tot expressie brengen. Pas vervolgens de beeldparameters aan om de signaal-ruisverhouding en het dynamisch bereik te maximaliseren met een minimale belichtingstijd en laserintensiteit, om zo fotobleken en fototoxiciteit te verminderen. Stel voor elke cel een continue autofocus in.

Verkrijg vervolgens een time-lapse beeldenset waarbij de acquisitie elke 0,5 seconden plaatsvindt gedurende vijf minuten. Voeg voor de met Netrin-1 gestimuleerde conditie in een laminaire flowkast Netrin-1 toe aan een schaal met cellen tot een eindconcentratie van 500 nanogram per milliliter en plaats de schaal één uur voor de beeldvorming terug in de incubator. Om de frequentie van exocytotische gebeurtenissen te kwantificeren, genormaliseerd per celoppervlak en tijd.

Open in ImageJ afbeeldestacks door het bestand naar het venster te slepen of door Bestand, Openen, bestandsnaam te kiezen. Om stabiele fluorescentiesignalen die geen vesikel-fusiegebeurtenissen vertegenwoordigen te verwijderen, gebruikt u Afbeelding, Stack, Z Project, Projectietype Gemiddelde Intensiteit. Om een gemiddelde Z-projectie van de gehele stack te maken.

Trek het resulterende gemiddelde beeld af van elk beeld in de timelapse via Process, Image Calculator, Image 1 uw stack, Operation Subtract image two. Dit resulteert in een nieuw aangemaakte Z Projection. Hiermee worden exocytische gebeurtenissen benadrukt.

Tel nu visueel de exocytotische fusiegebeurtenissen, die kunnen worden geïdentificeerd als spots van diffractiegelimiteerde fluorescentiesignalen die snel diffunderen naarmate VAMP2-fluoresceïne diffundeert binnen het plasmamembraan. Markeer de eerste afbeelding via Image, Adjust, Threshold, en pas de schuifregelaar aan totdat de gehele cel door de drempelwaarde is gemarkeerd. Kies vervolgens onder Analyze voor Set Measurements en vink area en display label aan.

Stel met de wand-traceertool het gedrempelde cellulaire gebied in en druk op M om te meten. Draag de verzamelde gegevens over naar een spreadsheet volgens het tekstprotocol. Plaats na twee dagen in vitro de glazen imaging-schaal met niet-getransfecteerde neuronen in een voorverwarmde, bevochtigde milieu-kamer.

Maak gebruik van een microscoop die is uitgerust met een 60X plan-apochromatische 1,4 NA DIC-objectieflens en een condensor met een hoge numerieke apertuur voor de beste beeldkwaliteit en resolutie. Stel vervolgens, bij gebruik van doorgelichte verlichting, het brandvlak in om neuronen via de oculairs te lokaliseren. Voor DIC-beeldvorming van axonale vertakkingen is een juiste instelling van de koelere verlichting essentieel voor beeldoptimalisatie en cruciaal voor het verkrijgen van analyseerbare resultaten.

Zet vervolgens, terwijl de neuronen van belang zich binnen het gezichtsveld bevinden, de functie voor acquisitie van meerdere gebieden in de beeldvormingssoftware in om de XYZ-locaties van ten minste zes cellen te vinden en op te slaan. Voeg nu Netrin-1 of een andere factor van belang toe tot een eindconcentratie van 250 nanogram per milliliter om de cellen te stimuleren en druk op start multi-area acquisition. Neem gedurende 24 uur om de 20 seconden opeenvolgend beelden op elke positie op.

Pauzeer de acquisitie en stel indien nodig de focus opnieuw in. Bekijk de beelden in de imaging-software door Apps, Review Multi Dimensional Data te selecteren en open het gewenste bestand. Identificeer stabiele axonvertakkingen die tijdens de imaging-sessie zijn gevormd.

Gebruik de tool voor het traceren van regio's om een stabiele axonale zijtak te meten vanaf de basis van het axon tot aan de tip. Nadat de neuronen zijn behandeld met Netrin en botulinumtoxine en zijn gefixeerd en immunogekleurd voor bèta-3 tubuline en actine volgens het tekstprotocol. Gebruik een omgekeerde microscoop om wide-field epifluorescentiebeelden te verzamelen.

Open een beeldstapel in ImageJ en analyseer de vertakkingen handmatig met behulp van de lijn-, gesegmenteerde lijn- en traceerfunctie om het axon te volgen, dat wordt gedefinieerd als het langste neuriet dat vanuit het soma uitsteekt. Sla de axon-tracing op als een region of interest via Analyze, Tools, ROI Manager. Traceer en sla vervolgens elke axon-vertakking op, gedefinieerd als een neuriet met een lengte van 20 µm of meer.

Neem alleen de primaire takken op in de analyse. Hier wordt een Western blot getoond na voltooiing van de SDS-resistente SNARE-complexanalyse. Er is gesondeerd op SNAP25, Syntaxin 1A en VAMP2.

SNARE-eiwitten in complex; identificeerbare monomeren worden hier getoond. Een voorbeeld van een VAMP2-fluorescentie-gemedieerde exocytotische gebeurtenis die in de tijd plaatsvindt in een corticaal neuron wordt hier getoond. De uitvergrote inzetten geven het soma, een axonale tak en een axonale groeikegel weer, wat het ruimtelijke nut van deze assay aantoont.

Cirkels markeren individuele exocytotische fusiegebeurtenissen, die zichtbaar zijn via TIRF-microscopie. Deze time-lapse DIC-beeldvorming toont in realtime de door Netrine gestimuleerde vorming van een axonale vertakking. Deze locaties duiden de initiële uitstulping vanuit een vertakkingsplaats aan.

Deze stellen volledig gevormde stabiele vertakkingen voor van ten minste 20 micrometers, gemeten van het hoofdaxon tot de tip van de vertakking. In dit experiment werden corticale neuronen bij 3 DIV behandeld met Netrin-1, wat vertakking stimuleert, of met botulinumtoxine A, dat SNAP25 splitst, een component van het SNARE-complex, en exocytose blokkeert. De resultaten tonen aan dat SNARE-gemedieerde exocytose vereist is voor Netrin-afhankelijke vertakking.

Zodra men de techniek beheerst, kan de DIC-beeldvorming in één enkele nachtelijke sessie worden voltooid. TIRF-beeldvorming van individuele exocytische gebeurtenissen kan in 4-5 uur worden uitgevoerd. Het biochemische protocol voor de vorming van het SNARE-complex kan binnen twee uur worden voltooid.

Tijdens het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om op een rustig tempo te werken en geen enkele stap over te spoedigen. Elke procedure vereist aandacht en geduld voor de beste resultaten. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de cotransfectie van gelabelde blaasjescomponenten met gelabelde kandidaat-vrachten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.

Zoals bijvoorbeeld wat de lading is van de exocytische blaasjes? Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om neuritogenese, axonale vertakking en andere stadia van morfogenese te onderzoeken in elke gedissocieerde neuronale cultuur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de ruimtelijke en temporele aard van neuronale exocytische blaasjesfusies kunt observeren en kwantificeren in relatie tot veranderingen in de neuronale morfogenese.

Vergeet niet dat het werken met botulinetoxine of krachtige lasers extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van geschikte veiligheidskleding en het gebruik van het veiligheidsslotmechanisme van de microscoop.