Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te immunolocaliseren die worden geactiveerd in het zebravisembryo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelings- en celbiologie, zoals de lokalisatie en activering van gefosforyleerde eiwitten in een heel embryo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men calciumafhankelijke signalering in een heel embryo kan lokaliseren door middel van immunokleuring van eiwitten die door calcium worden geactiveerd.

Na het verkrijgen van wild type of transgene embryo's volgens het tekstprotocol, voegt u 0,003%PTU toe aan de embryo's in systeemwater om pigmentatie te blokkeren en incubeert u tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Wanneer de embryo's het juiste stadium hebben bereikt, voegt u MESAB toe aan de schaal om de vissen te anesthesieren. Zodra de vissen zijn verdoofd, verwijdert u zoveel mogelijk systeemwater en voegt u vers 4%PFA en PBS toe en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende drie tot vier uur.

Na de incubatie verwijdert u de PFA en gebruikt u 100% methanol om het te vervangen. Bewaar de embryo's vervolgens gedurende ten minste 48 uur op min 20 graden Celsius. Om immunokleuring uit te voeren, plaatst u minimaal 10 embryo's voor elke experimentele conditie in gelabelde 1,5 millimeter microcentrifugebuisjes.

Wanneer de embryo's zich op de bodem van de buis hebben gezet, verwijdert u en gooit u het methanol weg en gebruikt u progressieve wasbeurten met afnemende concentraties ethanol in PBTx om de embryo's te rehydreren. Verwijder de laatste PBTx-was en voeg 0,5 milliliter 10% normaal geitenserum of NGS in PBTx toe. Incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur met zacht schudden.

Vervolgens verwijdert u de oplossing en voegt u 0,2 tot 0,5 milliliter van een 1 op 5 verdunning van muis anti-acetyleerde tubuline monoklonaal antilichaam en 10%NGS en PBTx toe. Incubeer de embryo's met zacht schudden bij kamertemperatuur overnacht. In de ochtend verwijdert en gooit u het antilichaam weg en voert u drie wasbeurten uit met 0,5 milliliter 2%NGS en PBTx met zacht schudden gedurende vijf minuten elk.

Dim de bovengrondse lichten en voeg 500 microliter toe aan elk monster van een 1 op 500 verdunning van fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam in 10%NGS en PBTx. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende vier uur met zacht schudden. Na de incubatie wast u de embryo's drie keer.

Om co-immunokleuring uit te voeren, voegt u een 1 op 20 verdunning van anti-fosfo CaMKII antilichaam toe. Incubeer in het donker met zacht schudden overnacht. De volgende ochtend, na het wassen van de embryo's met 2%NGS en PBTx drie keer, voegt u een 1 op 5 verdunning van rood 568 fluorescerend geconjugeerd geiten anti-konijn IgG en 10%NGS en PBTx toe.

Na incubatie in het donker bij kamertemperatuur gedurende vier uur, wast u de embryo's drie keer en bewaart u ze in PBTx of 50% glycerol in PBS, afhankelijk van de beeldvormingsprocedure. Om de embryo's voor beeldvorming te monteren, plaatst u één tot vijf embryo's op een glasplaatje. Gebruik vier nummer één gestapelde dekglasfragmenten aan weerszijden van de vis om een kamer te creëren.

En plaats een dekglas erop. Breng met de 100X oliemeringingslens en doorgelaten licht een enkele embryo in focus. Zet het licht uit.

Schakel de confocale microscoop in met de juiste lasers en activeer de externe focus. Open het confocale programma en selecteer in de verwerven balk het juiste objectief. Klik vervolgens in de XY basisbalk op de 1024 knop om de afbeeldingsgrootte in te stellen.

In de laser en detector balk, klik op de rode 488 en groene 568 dozen om de laserdetector voor elk kanaal in te schakelen en stel de spleten op medium. Pas vervolgens in de versterkingsbalk de versterking voor elk kanaal aan om het te visualiseren. Klik vervolgens in de verwerven instellingen balk op live om afbeeldingen te beginnen verwerven.

In de weergave-instellingen balk, haalt u het selectievakje force integral zoom uit om in het live venster te centreren. In de verwerven instellingen balk onder het Z-tabblad, stap door de lagen van de afbeelding. Nadat u het aantal lagen heeft geselecteerd dat u in de afbeelding wilt opnemen, beweeg naar een punt in het midden van het Z-vlak.

Onder het Z-tabblad, klik op het kleine rode referentievakje. Dit zet de RFA op nul op het punt dat als centrum is gekozen. In het vakje met de titel stapgrootte, selecteert u de dikte van de lagen.

Let op het bestandsgroottevakje en probeer de bestanden te beperken tot één gigabyte. Om het bovenste uiteinde van de afbeelding te vinden, klikt u op de cirkel naast boven en beweegt u door de Z-lagen. Klik nu op de cirkel naast onder en de computer zal de afbeelding terugbrengen naar de laag als centrum.

Vervolgens klikt u in de verwerven instellingen balk opnieuw op live om de laserverwerving te stoppen. Klik in dit paneel op de rode vakken gelabeld gemiddelde en Z-stack. Deze vakken worden groen.

In de verwerven instellingen balk, klikt u op single om de hele reeks afbeeldingen te verwerven. Bewaak de voortgang terwijl het in beide kanalen scant en door de hele Z-stack. Om op te slaan, klikt u op het volumevenster en klikt u op opslaan als en noemt u het bestand.

Om het bestand volumematig weer te geven, terwijl de Z-stack nog open is, selecteert u het data pulldown menu en klikt u op volume render. Sla het weergegeven bestand op als een dot tif-bestand. Deze figuur toont immunokleuring voor P-CaMKII en acetyleerde tubuline, wat een standaardmarker is voor cilia in de zebravis Kuppfer's blaas of KV. Primaire cilia genereren een circulaire stroom van vloeistof, wat leidt tot een ver