Name: Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer FISH-analyse van LINE-1 retrotranspositie op enkelkernniveau in HepG2-cellen. Deze methode visualiseert retrotranspositiepatronen nauwkeurig en verbetert de beoordeling van genomische stabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 en ES017274) en AstraZeneca aan KSR.

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Raadpleeg reagentia gedeelte voor meer informatie over hoe u de individuele reagentia te bereiden. 1. Labeling L1 Probes OPMERKING: Probes kunnen worden gemerkt door chemische of PCR labeling. <ol><li> chemische labeling <ol><li> Voeg 0,7-1% agarosegel in Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer, warmte in een magnetron tot het gesmolten is, laat de gel afkoelen en voeg ethidiumbromide (0,5 ug / ml). Giet in bleekbeugel, kammen toe en laat de gel stolt bij kamertemperatuur. </li><li> Label de Sneo probe (1-2 ug) met CY3 of FITC bij 37 ° C gedurende 1 uur volgens het protocol van de fabrikant. LET OP: Sneo geeft de S pliced ​​Neo mycin gen tot expressie gebracht na een volledige cyclus van retrotransposition. De sonde ~ 1000 bp groot. Sneo kan PCR worden geamplificeerd van een vector of genomic DNA. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over Streptavidine-CY3 / FITC labeling reagentia. </li><li> Meng de gelabelde Sneo probe-oplossing met 1x DNA laadbuffer, lading in elk putje en draaien op 75-100 volt gedurende 15-20 min. </li><li> Visualiseer de sonde band met behulp van een Ultra-Violet (UV) Illuminator. Merk op dat de grootte van de Sneo probe kan worden aangepast en dat Lock nuclei acid (LNA) ook kunnen worden toegevoegd (Figuur 2). </li><li> Cut gelabelde Sneo probe uit de gel met een schone mes, oplosbaar te maken en te zuiveren van de Sneo sonde uit de gel met behulp van een PCR Clean-up kit volgens het protocol van de fabrikant. LET OP: Cover elk blootgestelde deel van het lichaam met beschermende schilden (dat wil zeggen, laboratorium jassen en UV duidelijke gezichtsmasker) bij het ​​bekijken van en het snijden van de gel. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie aan gel zuiveren van PCR-producten. </li><li> Re-run 5 ui Sneo gelabelde probe met een VN-gelabelde Sneo probe op een 0,7% agarosegel (zie punt 1.1.1) te congrootte van de onderneming verhogen en verlies van de intensiteit van het signaal (figuur 2). </li><li> Kwantificeren hoeveelheid gemerkt Sneo probe door meting van de absorptie bij 260 nm en los het Sneo sonde 10 ng / ul aliquots in nuclease vrij H2O WINKEL aliquots bij -20 ° C. </li></ol></li><li> PCR Labeling (alternatieve methode voor het probe etikettering) <ol><li> Combineer Sneo specifieke primers (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;en 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) met PCR reagentia in één buis: 13,6 ul nuclease vrij H2O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 pi dTTP (10 nM); 0,05 ui dUTP-biotine / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ui Ga Tag 5x buffer; 0,4 ul Ga Tag Polymerase; 1 pl Sneo template (10 ng). Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over de PCR-reagentia. </li><li> Pas de hoeveelheid van elk reagens door vermenigvuldigen met het totale aantal monsters. </li><li> Gebruik de volgende PCR fietsen parameters VERSTERKT label Sneo probes: 95 ° C gedurende 2 min; 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 62 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 60 seconden; 72 ° C gedurende 2 min; Houd bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. OPMERKING: De hybridisatietemperatuur kan worden aangepast of gradiënt PCR kan worden voltooid optimale annealing temperaturen andere sondes bepalen. </li><li> Maak 0,7-1% gel zoals in paragraaf 1.1.1, belasting en visualiseren van de sonde band als in paragraaf 1.1.4. </li><li> Knip en zuiveren de gemerkte Sneo probe zoals in paragraaf 1.1.5. </li><li> Re-run 5 ui Sneo gelabelde probe met VN-gelabelde Sneo sonde naar vergroot en het verlies van intensiteit van het signaal te bevestigen (zie figuur 2). </li><li> Kwantificeren hoeveelheid gemerkt Sneo probe door meting van absorptie bij 260 nm en verdun Sneo sonde naar 10 ng / ul aliquots in nuclease vrij H2O </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiden Chromosome Spreads <ol><li> Het genereren van stabiele klonen die vector backbone (control) of retrotransposition bevoegde L1 gebruikmaking van standaard methodologieën selectie. 12,16 Terwijl niet-episomale reporters gebruikt om bevindingen studies van transcriptie correleren, kan episomale vectoren ook worden gebruikt. Grow cellen die stabiel controle of L1 vector (1 x 10 6 cellen per 10 cm plaat, met aanpassingen in plaat maat gemaakt als dat nodig is) in volledige groei media uit te drukken. Voor HepG2-cellen, gebruik RPMI-1600, 10% FBS en 200 ug / ml hygromycine. Groeien kweken tot 70% confluentie bij 37 ° C en 5% CO2. LET OP: De keuze van het groeimedium is afhankelijk van het type cel. Aangezien de hier gebruikte plasmiden dragen selectie cassettes zowel hygromycine en néomycine, kan stabiele selectie van klonen ook gebeuren met neomycine na selectie in hygromycine, maar de hoeveelheid neomycine moet worden geoptimaliseerd voor tolerantieniveaus voor elk celtype. </li><li> colcemide (0,4 ug / ml) toe aan cultuurmedium en incubeer gedurende 90 min om cellen arresteren metaphase. Bij gebruik van verschillende celtypes Bepaal de optimale concentratie van colcemide en blootstellingsduur (60, 90 en 120 min) optimaal metafase arrestatie empirisch. </li><li> Was cellen 2x met 10 ml 1 x Dulbecco&#39;s PBS (DPBS), trypsinize door toevoeging van 3-5 ml van 0,25% trypsine oplossing voor de cellen en incubeer gedurende 5 minuten om de cellen los te maken. Trypsine inactiveren met een gelijke hoeveelheid media bevattende 10% FBS. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, zuig het medium uit de celpellet en was de cellen met DPBS. Aspireren alle DPBS, waardoor 200 gl DPBS om resuspendeer de cellen. Zorg ervoor dat cellen worden goed gemengd en dat alle klonten zijn verspreid. Gebruik flikkeren of zachte pipetteren om te mixen en te verspreiden bosjes en vortexen te vermijden. </li><li> Voeg 5 ml hypotone oplossing (dat wil zeggen, 75 mM KCl) dat is voorverwarmd tot 37 ° C druppelsgewijs tijdens het draaien van de 15 ml buis horizontaal en incuberen bij 37 ° C gedurende 20 min. Zie tabel van Materialen en Reagents voor informatie over het verkrijgen en maken hypotone oplossing. </li><li> Centrifugeer cellen bij 120 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en herhaal stappen 2,4-2,5 3x laat ongeveer 200 ul hypotone oplossing resuspendeer de cellen na elke wasbeurt. Waarborgen dat aan het einde van de 3 wasbeurten, de pellet zichtbaar wit en gezwollen. </li><li> Resuspendeer de pellet in 200 ui van Carnoy Fixatief oplossing en maak 1: 2, 1: 4, 1: 8, 01:16 verdunningen in Carnoy Fixative oplossing. Drop 10 ul van elke verdunning op een droge, schone dia uit ongeveer 1 cm boven en onmiddellijk bloot de verspreiding-vrije zijde aan hete stoom van kokend water gedurende 30 sec. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe u Carnoy Fixative oplossing te maken. </li><li> Droog de spreads bij kamertemperatuur vlek met 0,1 ug / ml Hoechst-33342 door onderdompeling gedurende 15-20 min in Coplin jar 3x wassen met DPBS. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe u de Hoechst-33342 oplossing te maken. </li> &lt;li&gt; Bekijk de spreads op fluorescentie / fase-contrast microscoop bij 40x vergroting. Na het optimaliseren van spread voorbereiding, hoeft spreads niet worden gekleurd met Hoechst-33342. Uitzicht spreads op fasecontrast microscoop bij 10x vergroting verspreiding kwaliteit en afscheiding zoals beschreven in de Resultaten bepalen (zie figuur 3). </li><li> Selecteer en cirkel goede spreads met een Diamond Point Marker aan de andere kant van de schuif (dat wil zeggen, verspreid-vrije zijde). </li><li> WINKEL verspreidt bij -20 ° C gedurende een maand. Vermijd blootstelling aan vocht. </li></ol> 3. Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) <ol><li> Stabilisering en dehydrateren spreads OPMERKING: Equilibreren metafase chromosoom spreads tot kamertemperatuur indien bewaard bij -20 ° C. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over het verkrijgen en maken reagentia. <ol><li> Incubeer metafase chromosoom spreads met 200 gl RNase A1 uur bij 37 ° C. </li><li> Wassen schuift 2x SSC-buffer tweemaal gedurende 5 minuten elk, gevolgd door spoelen met 10 mM HCl-oplossing. </li><li> Incubeer smeersels met 1% pepsine gedurende 10 minuten bij 37 ° C, spoelen met gedeïoniseerd H2O en tweemaal wassen met 2 x SSC-buffer gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer smeersels met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en wassen in 2xSSC buffer tweemaal gedurende 5 minuten elk. </li><li> Uitdrogen verspreid door incubatie gedurende 2 min in ethanol serie: 70%, 80% en 95% ethanol. </li><li> Lucht drogen dia&#39;s. </li></ol></li><li> Hybridisatie Spreads met L1 gemerkte retrotransposition probes (dat wil zeggen, Sneo) LET OP: Voor direct-gelabelde probes, weg te houden van licht te allen tijde. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over het verkrijgen en maken reagentia. <ol><li> Voeg 30 ng Sneo hybridisatie buffer, warmte bij 72 ° C gedurende 10 min en koel voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 30 ul van Sneo probe-oplossing van each spread, dek af met dekglaasje en sluit de randen met rubber cement. Zorg ervoor dat er geen vorming van zeepbel. </li><li> Verwarm de glijbaan bij 72 ° C gedurende 5 min op een verwarmingsblok geleidelijk de temperatuur dalen tot 37 ° C en incubeer overnacht in een donkere vochtige kamer bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Wassen en bekijken (of toevoeging van secundair antilichaam) LET OP: Voor direct-gelabelde probes, weg te houden van licht te allen tijde. OPMERKING: Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe te bereiden. Gebruik van voldoende volume om de gehele chromosoom spread dekken wordt aanbevolen. Vergeet niet dat overtollige volume gaan verloren als dekglaasje wordt toegevoegd. <ol><li> Dompel dia&#39;s in 2x SSC buffer om dekglaasjes te verwijderen. </li><li> Was dia door onderdompeling in 2 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Was dia door onderdompeling in wasbuffer bij 45 ° C gedurende 5 min, 2x. </li><li> Was dia door onderdompeling in 0,1 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 10 minuten. </li><li>Was dia door onderdompeling in 2 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 10 minuten. LET OP: Plaats een Coplin pot met aanbevolen buffer in een waterbad, aan te passen temperatuur tot 45 ° C. </li><li> Koel dia tot kamertemperatuur equilibreren en schuift detectiebuffer. </li><li> Voor de directe gelabelde probes, ga dan naar stap 3.4.10. </li><li> Voor indirect gelabelde probes, blok in blokkerende buffer gedurende 20-30 min en was 3x in DPBS. </li><li> Incuberen met 50 pl secundair antilichaam (bijvoorbeeld, 5 ug / ml streptavidine-FITC of αCY3 in blokkeerbuffer) gedurende 1 uur. </li><li> Was de dia&#39;s in 2x SSC gedurende 5 minuten twee keer. </li><li> Tegenkleuring met Hoechst 33342-oplossing (0,1 ug / ml) gedurende 10 min. LET OP: deze kleuring wordt gedaan om chromosomen voor co-lokalisatie met probe vlekken. </li><li> Was in DPBS 3x, voeg een druppel montage medium, plaats een dekglaasje en sluit de randen met nagellak. </li><li> Analyseer L1 retrotransposition met behulp van fluorescentie microscoop bij 40X magnification. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
<li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li>
<li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+LINE-1+reverse+transcriptase%3Aeffect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li>
<li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li>
<li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li>
<li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li>
<li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li>
<li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li>
<li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li>
<li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li>
<li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li>
<li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li>
<li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li>
<li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li>
<li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Gen+Develop%22%5BJournal%5D)">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li>
<li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li>
<li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li>
<li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li>
<li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li>
<li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen potentieel tegenstrijdige belangen.

Methodes zoals whole genome sequencing, inverse PCR en Southern blotting zijn gebruikt om L1 retrotransposition bestuderen. Hoewel deze methoden zijn zeer waardevol bij het ​​lokaliseren waar de L1 inserties plaatsvinden binnen genomen, een verstorende uitdaging voor alle van hen is de noodzaak van in-silico programmeren sequenties weer in elkaar zetten. De FISH werkwijze hierin beschreven is ontworpen om deze werkwijzen te vullen, met name bij studies die analyses van ectopische L1 r...

Human Lange afgewisseld Nuclear Element-1 (Lijn-1 of L1) is een autonome mobiele element dat zich voortplant in het genoom door middel van een &quot;kopieer en plak&quot; retrotransposition mechanisme. Een typische menselijke L1 ~ 6 kb lang en bestaat uit een 5 &#39;UTR (niet getranslateerd gebied) dat als een promotor, twee open leesramen (ORFs): L1 -ORF1 en L1 -ORF2 en een 3&#39;UTR met een polyA . staart L1 -ORF1 eiwit heeft drie verschillende domeinen: een spoel-coil domein, RNA erkenning Motif en C-terminale domein, terwijl L1 -ORF2 eiwit heeft endonuclease, reverse transcriptase en cysteïne-rijke domeinen 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 vertoont nucleïnezuur chaperon activiteiten, terwijl L1 -ORF2 biedt enzymatische activiteiten, met beide eiwitten vereist retrotransposition 1,2,6. Een cyclus van L1 retrotransposition begint transcriptie van het 5&#39;UTR van L1 </em&gt; bicistronische mRNA door RNA-polymerase II, translocatie in het cytoplasma, en vertaling. In het cytoplasma, L1 -ORF1 exposities ofwel cis bindingsplaats waar het pakketten zijn eigen RNA of trans bindingsplaats waar het pakketten andere RNA&#39;s (dat wil zeggen, SINE / SVAs / pseudogenes) om een ribonucleoprotein deeltje (RNP) te vormen met L1 -ORF2p 7, 8. RNP transloceren naar de kern, waar het endonuclease activiteit van L1 -ORF2p namen genomisch DNA (gDNA) aan een OH bloot - groep 9, dat op zijn beurt door reverse transcriptase te primen en reverse synthetiseren RNA DNA uit het 3 &#39;uiteinde. Tijdens achterwaartse synthese wordt de tweede streng van DNA gekerfd 7-20 bp van de oorspronkelijke nick plaats gespreide pauzes die zijn gevuld met de handtekening L1 insertie sequenties (bijvoorbeeld TTTTAA) genoemd target site duplicatie (TSD) 9,10 vorming maken. Dit proces staat bekend als doelwit prime reverse transcriptie (TPRT) en leidt tot insertiop volledige of verkorte kopieën van L1 / andere DNAs met TSD aan beide einden van de ingebrachte sequentie. L1 retrotransposition is ook aangetoond worden gemedieerd door TPRT-achtige niet-homologe eind mee in sommige celtypen 11. De L1 retrotransposition vector gebruikt in onze studies niet-episomale en bestaat uit L1 hebben -ORF1 &amp; 2p aangedreven door combinatie CMV-promoters L1-5&#39;UTR (figuur 1) 12. Eerdere versies van dit construct zijn beschreven in studies met gist en humane celculturen 13,14,15. Twee verschillende CMV promoters gelegen aan de 5 &#39;en 3&#39; uiteinden van de vector met het 3 &#39;uiteinde in omgekeerde oriëntatie geplaatst om expressie neomycine rijden na splicing en integratie. De retrotransposition indicator cassette aan het 3 &#39;uiteinde omvat een neomycine geïnsereerd antisense L1 -ORFs en inactief wordt door scheiding in twee helften door een klodderin intron met gesplitste donor (SD) en splicing acceptor (SA) plaatsen (Figuur 1). Na integratie in een chromosoom, is L1 getranscribeerd van een gemeenschappelijke promoter een mRNA dat uit een bicistronische mRNA en inactieve neomycine mRNA produceren. Tijdens RNA processing, is de globine intron splicing van het neomycine gen een volledig functionele neomycinegen herstellen. De hybride mRNA wordt verpakt in een RNP in cis en translocatie naar de kern waar het wordt geïntegreerd in het genoom als ofwel de volledige lengte of afgeknotte inserties gebruikt TPRT. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met probes die specifiek gericht zijn op de gesplitste neomycinegen (Sneo) naar L1 -retrotransposiition patronen en invoeging tarieven volgen op de enkele kern niveau. De efficiëntie en specificiteit van de detectie werd bevestigd met behulp retrotransposition competente en incompetente constructies en sondes naar detect Sneo of neomycine en globine intron knooppunt 16. Deze methode vertegenwoordigt een aantal tekortkomingen van celkweek gebaseerde retrotransposition assays, zoals meerdere inserties, kolonie weerstand en positieve kloon expansie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labeling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x colorless buffer</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Stel de concentratie van dATP, dGTP, dCTP in op 2&nbsp;mM en dTTP op 1,5&nbsp;mM in nucleasevrij water.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotin (0,5&nbsp;mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5&nbsp;mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp;mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Elk PCR-reinigingsreagens kan worden gebruikt in plaats van NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td></tr><tr><td>PCR-machine</td><td></td><td></td><td>Elke thermocycler kan worden gebruikt om het labelproduct te amplificeren.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparing chromosome Spreads</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Voeg Colcemid direct toe aan groeimedia tot een eindconcentratie van 0,4&nbsp;&micro;g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp;M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Verdun 1&nbsp;M KCl-oplossing tot 75&nbsp;mM-oplossing om hypotone oplossing te maken</td></tr><tr><td>Carnoy Fixative Solution</td><td></td><td></td><td>Meng 3 volumes methanol en 1 volume azijnzuur om Carnoy Fixative Solution te maken. Maak elke keer vers.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Los Hoechst-33342 op in PBS tot een eindconcentratie van 1&nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Diamond Point Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Om cellen te detecteren, incubeer de cel in Trypsin gedurende 5 minuten en deactiveer met een gelijk volume van compleet medium.</td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Elke hitteblok kan voor dit doel worden gebruikt, hoewel blokken die zijn uitgerust voor het verwarmen van slides worden aanbevolen.</td></tr><tr><td>Beker (600&nbsp;ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Vul de beker met water, verhit tot kookpunt, gebruik de hete stoom om chromosomen te laten barsten.</td></tr><tr><td>Nikon-microscoop</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Elke microscoop kan worden gebruikt om de kwaliteit van de verspreiding te bekijken.</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents and Materials for FISH</td></tr><tr><td>Trisodiumcitraat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detransulfaat</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalcohol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Los Hoechst-33342 op in PBS tot een eindconcentratie van 1&nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Rubber Cement/Cytobond Sealant&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Donkere bevochtigde kamer</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Dry Digital Heat Block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Saline-Natriumcitraat (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Combineer 175 g van NaCl en 88,2&nbsp;g van trinatriumcitraat met 800 ml van moleculair kwaliteits H2O. Roer onder het aanpassen aan pH 7. Zodra alle zouten zijn opgelost, pas het volume aan tot 1 L en filter door 0,22 &micro;m Filterpapier. Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>1&nbsp;mg/ml van Rnase A</td><td></td><td></td><td>Verdun 20x SSC-buffer tot 2x SSC-buffer. Los RNase A op in 2x SSC-buffer tot een eindconcentratie van 1&nbsp;mg/ml. Maak elke keer een verse oplossing.</td></tr><tr><td>1% Pepsine</td><td></td><td></td><td>Los pepsine (W/V) op in 10 mM HCl tot een eindconcentratie van 1% oplossing. Maak elke keer vers.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Weeg 4,0 g van PFA in fume hood, voeg 50 ml van 1xPBS toe, verhit tot 60&nbsp;&deg;C onder roeren en pas de pH aan met druppels NaOH totdat alle PFA is opgelost en de oplossing helder wordt. Pas het volume aan tot 100&nbsp;ml, filter door 0,22 &micro;m Filterpapier en bewaar 5 ml aliquots bij -20&nbsp;&deg;C. Ontdooi een aliquot van PFA bij 37 &deg;C gedurende

analyse van de line-1 retrotransposition bij de single nucleus niveau

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nucleair element-1 (Line-1 of L1) maakt ongeveer 17% uit van het DNA dat aanwezig is in het menselijk genoom. Hoewel de meeste L1's inactief zijn vanwege 5'-truncaties, blijven ~80-100 van deze elementen retrotranspositie-competent en verspreiden zich via RNA-intermediaten naar verschillende locaties in het genoom. Terwijl oudere L1s worden geacht AT-rijke regio's van het genoom als doel te hebben, blijven de chromosomale doelen van nieuwere, actievere L1s slecht gedefinieerd. Hier beschrijven we de fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) methodologie die kan worden gebruikt om patronen van L1-insertie en tarieven van ectopische L1-incorporatie op het niveau van een enkele kern te volgen. In deze experimenten werden fluoresceïne-isothiocyanaat/cyanine-3 (FITC/CY3) gelabelde neomycine-probes gebruikt om L1-retrotranspositie in vitro te volgen in HepG2-cellen die stabiel ectopische L1 tot expressie brengen. Deze methodologie voorkomt fouten in de schatting van tarieven van retrotranspositie die worden veroorzaakt door toxiciteit en houdt rekening met het voorkomen van meerdere inserties in een enkele kern.

Een schematisch diagram van de L1 retrotransposition vector wordt getoond in Figuur 1. De vector omvat een neomycine-gen in antisense oriëntatie L1 ORF dat wordt onderbroken door een globine intron in sense oriëntatie en kern met SD- en SA sites. Wanneer stabiel geïntegreerd in een chromosoom, is L1 mRNA getranscribeerd van de gecombineerde CMV en L1-5&#39;UTR promoter (Figuur 1). Tijdens de RNA processing, is de globine intron...

Hier maken we gebruik van FISH methodologie op te sporen LINE-1 retrotransposition bij de enkele kernen niveau chromosoom spreads van HepG2-cellijnen stabiel tot expressie synthetische LINE-1.

Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren en analyseren van L-1 retrotranspositie-snelheden en patronen op het niveau van individuele kernen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie, of FISH. Het belangrijkste voordeel van deze methodiek is dat het de onderzoeker in staat stelt over- of onderschatting van de snelheden en patronen van retrotranspositie te vermijden, en wanneer het wordt aangevuld met andere methodieken, maakt het de studie van L-1 retrotranspositie op het niveau van individuele kernen mogelijk. Deze procedure wordt vandaag uitgevoerd door Dr. Pasano Bojang, een senior fellow in het laboratorium.Begin met het bereiden van een 0,7% tot 1% agarosegel in TAE-buffer volgens het tekstprotocol; gebruik vervolgens CY3 of FITC om de SNeo-probe te labelen en incubeer deze gedurende één uur bij 37 °C volgens het protocol van de fabrikant. Meng de oplossing van de gelabelde SNeo-probe met 1X DNA-laadbuffer en breng dit aan in de putjes van de agarosegel. Laat de gel vervolgens 15 tot 20 minuten lopen bij 75 tot 100 volt.Visualiseer de probeband met een UV-illuminator. Snijd vervolgens de gelabelde SNeo-probe met een schoon mesje uit de gel. Gebruik daarn

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

Hier presenteren we een Bioinformatic aanpak en analyses om lijn-1 expressie te identificeren op de Locus specifieke niveau.

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Dit artikel schetst een eenvoudige PCR-gebaseerde assay om de activiteit van een actieve lijn-1 retrotransposon te monitoren en de Novo retrotransposities in een gegeven genoom in kaart te kunnen krijgen. Met behulp van de MCF7 cellijn tonen we hierin hoe deze methode kan worden toegepast om de activiteit van een lijn-1 te detecteren op 22q 12.1.

Detectie van de Retrotransponerings activiteit van Hot LINE-1S door de lange afstand inverse PCR

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Leer FISH-analyse van LINE-1 retrotranspositie op enkelkernniveau in HepG2-cellen. Deze methode visualiseert retrotranspositiepatronen nauwkeurig en verbetert de beoordeling van genomische stabiliteit.

Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau

Meer video's verkennen