Name: Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryos met behulp van twee-kleuren Microarray Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer transcriptoomprofilering van in-vivo geproduceerde bovine pre-implantatie embryo's met een twee-kleuren microarray. Deze methode analyseert genexpressie met minimale RNA-hoeveelheden en biedt inzicht in embryokwaliteit en overlevingsfactoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek ondersteund door Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk en Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

Het dier deel van deze studie werd uitgevoerd bij de Metabolic Research Unit van de Universiteit van Alberta, Edmonton, Canada, met alle dierlijke experimentele procedures goedgekeurd (Protocol # AUP00000131) van de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comite, en de dieren verzorgd volgens aan de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen (1993). 1. Embryo Productie, Isolatie van Totaal RNA en DNase behandeling <ol><li> Voor dierlijke experimentele protocollen en embryo verwijzen in onze vorige publicaties 17, 18. </li><li> Pool en snap bevriezen soortgelijke embryo&#39;s van elke koe in vloeibare stikstof en vervolgens laten -80 ° C tot RNA-extractie. </li><li> Extract totaal RNA via een kolom gebaseerde RNA extractie kit die toelaat om RNA te extraheren uit pico-schaal monsters (kit informatie beschikbaar in Laden List). LET OP: Aanbevolen kit bevat: Conditioning Buffer, Extraction Buffer, 70% ethanol, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, Elution Buffer, RNA zuivering zuilen met collectie buizen en microcentrifugebuizen. </li><li> Voeg 10 ul Extraction Buffer om buis met embryo en incubeer gedurende 30 minuten bij 42 ° C. Centrifugebuis bij 800 xg gedurende 2 min celextract verzamelen in de microcentrifugebuis. </li><li> Pipet 250 pi Conditioning Buffer op de zuivering kolom filter membraan. Incubeer de RNA zuiveringskolom met Conditioning buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de zuiveringskolom in de verzamelbuis bij 16.000 xg gedurende 1 min. </li><li> Pipetteer 10 ul van 70% ethanol in het mengsel van RNA Extraction Buffer en embryo&#39;s. Meng goed door en neer te pipetteren. Pipetteer mengsel in de gepreconditioneerde zuiveringskolom. </li><li> RNA gecentrifugeerd zuiveringskolom binden gedurende 2 min bij 100 xg en onmiddellijk volgen door een centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 30 s tot doorstroming verwijderen. </li><li> Pipette 10081, L wasbuffer 1 in de zuiveringskolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 8000 x g. LET OP: DNase behandeling wordt aanbevolen als het uitvoeren van reverse transcriptie of amplificatie na RNA-isolatie. </li><li> Digest genoom DNA direct na stap 1.8. LET OP: Aanbevolen DNase kit is verkrijgbaar in Material List. Aanbevolen kit bevat: DNase I voorraad-oplossing en Buffer. </li><li> Bereid DNase incubatie mengsel door het mengen van 5 ul DNase I voorraad oplossing met 35 ul Buffer. Meng door voorzichtig omkeren. </li><li> Pipetteer de 40 ul DNase incubatie mengsel direct in de zuiveringskolom membraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Pipetteer 40 ul Wash Buffer 1 in de zuiveringskolom membraan en centrifugeer vervolgens bij 8000 xg gedurende 15 s. </li><li> Pipetteer 100 ul Wash Buffer 2 in de zuiveringskolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 8000 x g. </li><li> Pipetteer 100 ul ander Wash Buffer 2 in de zuiveringskolom en centrifugeergedurende 2 minuten bij 16.000 x g. </li><li> Breng de zuiveringskolom een ​​nieuwe 0,5 ml microcentrifugebuis. Pipetteer 11 ul elutiebuffer direct op het membraan van de zuiveringskolom. Om maximale extinctie elutiebuffer in het membraan verzekeren voorzichtig raakt de punt van de pipet op het oppervlak van het membraan tijdens het afgeven van de elutiebuffer. </li><li> Incubeer de kolom gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 1000 xg om Elution Buffer verdelen in de kolom, en draaien gedurende 1 min bij 16.000 xg RNA te elueren. </li><li> Gebruik bioanalyzer instrument volgens de instructies van de fabrikant om de kwaliteit en kwantiteit van RNA 19 evalueren. </li><li> Bewaar het RNA monster bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. RNA amplificatie en Labeling voor microarray-analyse LET OP: Voor de eerste keer dat de gebruiker werken met procedures RNA-amplificatie en etikettering, gebruik van vijf ng spike-in RNA along met de feitelijke ARNA monsters om de kwaliteit controlemeting van het RNA amplificatie en hybridisatie monitoren. De piek in RNA mix bevat tien in vitro gesynthetiseerd gepolyadenyleerde transcripten in vooraf bepaalde verhoudingen. Wanneer de procedure correct wordt uitgevoerd, specifiek het gelabelde transcripten alleen hybridiseren met complementaire probes control arrays en de gegevens kunnen worden gescand bijhouden kwaliteitscontrole zekerheid met minimale zelf- of kruis-hybridisatie. Meer details met betrekking tot de beschrijving spiked-controle intensiteiten en normalisatie procedure na het scannen van de array en data-analyse is verwijzen naar eerdere publicaties 20, 21. De volgende procedure wordt aan de routine microarray gebruikers. <ol><li> Bereid 100 pg kwaliteit RNA monster (RNA Integrity nummer (RIN) waarde tenminste&gt; 7,0) in een totaal volume van 10-11 pl. </li><li> Versterken de RNA monsters met een amplificatie kit te kunnenwerken met pico-schaal monsters (zo weinig als 100 pg). LET OP: Aanbevolen versterking kit informatie is beschikbaar in Material List en volgt de instructies van de fabrikant, zonder enige wijziging. </li><li> Gebruik een fluorescentie gebaseerde kwantificatie het profiel van de orde van grootte van de geamplificeerde ARNA evalueren. </li><li> Met de spectrofotometer instrument (gebaseerd op de absorptie bij 260 en 280 nm) bij de concentratie van het geamplificeerde ARNA meten. </li><li> Bewaar de versterkte ARNA bij -80 ° C tot klaar voor de etikettering. </li><li> Gebruik 2 ug versterkt RNA voor tl-labeling volgens ULS ARNA labeling kit handleiding. LET OP: Aangezien Cyanine 547 en 647 Cyanine kleurstof zijn gevoelig voor foto-degradatie en Cyanine 647 kleurstof wordt gemakkelijk afgebroken door ozon, de etikettering procedure vindt plaats in een minimale hoeveelheid licht en onder een ozon-vrije omgeving. </li><li> Schakel de ozonlaag (Afbeelding 1A) totdat het niveau van ozon 0,001 ppm. </li><li&gt; Doe de reactie opstart in de ozon (Afbeelding 1B) door toevoeging van 2 pi van Cyanine 547 of Cyanine 647, 2 pl labeling buffer en pas tot een eindvolume van 20 pi met RNase-vrij water onder safelight. Voeg darkroom filter aan de lichtbron. </li><li> Meng voorzichtig en incubeer de buizen in een thermocycler bij 85 ° C gedurende 15 minuten. Leg monsters op ijs gedurende ten minste 1 min. Spin down naar de inhoud van de buizen te verzamelen voordat u verder gaat met RNA-extractie kit, met uitzondering van maatregelen in verband met DNase behandeling (1,9-1,11), de sanering van de Cy-dye-gelabelde versterkt RNA. </li><li> Met de spectrofotometer instrument voor het meten en bepalen van de concentratie van gemerkte geamplificeerde RNA en houd de gelabelde ARNA bij -80 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór gebruik. </li></ol> 3. Microarray hybridisatie en Wassen OPMERKING: De volgende belangrijke stappen worden aangepast aan twee kleuren-microarray-based analyse van genexpressie Protocol (version6.5, mei 2010). <ol><li> Voeg gelijke hoeveelheid van 825 ng van elk Cyanine 547- en Cyanine 647-gelabeld ARNA en meng met 25x fragmentatie en 10x blokkerende buffers. </li><li> Verwarm het mengsel bij 60 ° C gedurende 15 min en koel op ijs gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg gelijke hoeveelheid 2x hybridisatiebuffer en meng. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 rpm, waarna het mengsel gereed voor hybridisatie. </li><li> Plaats 100 pi van het mengsel op de array glijbaan en verzegelen de dia in de hybridisatie kamer. </li><li> Laad de gemonteerde kamer in de hybridisatie oven gedurende 17 uur bij 65 ° C roteren met 10 rpm in oven. </li><li> Was de arrays volgens het protocol met de bescherming van de ozonlaag behandeling door dompelen in de stabilisatie en het drogen van oplossing voor de 30 s. </li><li> Verwijder de arrays uit de oplossing en zorg ervoor dat de array oppervlak droog zonder stofdeeltjes </li></ol> 4. Scanning Microarray Slide <ol><li> Houd de arrays in donkere plaats en zet scanner totdat het klaar voor gebruik (15 min wachttijd). </li><li> Laad de matrix barcode op links, in de scanner en start het scannen. Doe de plek analyse op basis van de software handleiding en de gegevens zoals (GPR) bestandsformaat op te slaan. </li></ol> 5. Statistische analyse <ol><li> Download de software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klik op &quot;import ruwe data&quot; en laad de GPR-bestanden in FlexArray. </li><li> Voer de normalisering en statistische analyse, indien nodig door het volgen van de instructie. Let op: Bereken de drempel voor positieve spot selectie in dit onderzoek als het eerder 22 beschreven. </li><li> Selecteer de drop down handleiding van de plot kijker van de FlexArray om alle gehybridiseerde vlekken en achtergrond signalen te bekijken. Opmerking: Een soortgelijk beeld van spiked in controles na hybridisatie met de microarray blijkt uit eerder onderzoek 8. </li><li> Selecteer eenLöss normalisering binnen matrix gevolgd door een kwantiel tussen arrays normaliseringsproces van het FlexArray drop-down handleiding dienovereenkomstig. </li><li> Exporteer alle genormaliseerde gegevens van FlexArray in een Excel-bestand voor verder gebruik. </li></ol> 6. Bioinformatica Analyse Het origineel annotatie van de sonde sequenties van Bovine Embryo-specifieke Afschriften (BESTv1) microarray is eerder 8 beschreven. In de huidige studie werden 20.403 unieke Gene Symbolen (GS) verkregen ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Supplement File1</a> ) door de EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Een lijst van 6765 unieke genen ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Supplement File2</a> ) werd geselecteerd en kwam overeen met de al positieve signalen na microarray proces van normalisatie (Stap 50,5) van runderen Dag 7 embryo genexpressieprofiel. Positief signaal drempel is gebaseerd op doorlatende bekendmaking 16 van de signaalintensiteit van een A waarde. <ol><li> Om functionele analyse met PANTHER (eiwitanalyse door evolutionaire relaties) uit te voeren Classification System 23, 24, opent u de volgende link (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li> Upload een lijst met 6.765 embryo-specifieke GS om specifieke biologische processen te identificeren tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van statistische oververtegenwoordiging testen en gebruiken standaardinstelling van Bos taurus (alle genen in de database) als referentielijst 25. LET OP: Dit maakt de identificatie van ontwikkelings-processen van de GO termen die statistisch over- of onder-expressie gebracht met behulp van een binomiaal-test zijn. </li><li> Stel P-drempelwaarde op &lt;0,05 als software standaard. De gegevens kunnen worden gedownload en exported in Excel-bestand voor verdere selectie 16. </li></ol>

<ol><li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+in+dairy+cows%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li>
<li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li>
<li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li>
<li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
<li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li>
<li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+available+for+profiling+small+samples%3A+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li>
<li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isothermal%2C+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li>
<li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+RNA+Amplification%3A+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).</li>
<li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Linkage+System%3A+versatile+nucleic+acid+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Re.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li>
<li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+porcine+%28Sus+scofa%29+embryo-specific+microarray%3A+array+annotation+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370(2012).</li>
<li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/rd/rdv26n1ab208">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li>
<li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li>
<li>Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf</a> (2016).</li>
<li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17915030">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).</li>
<li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li>
<li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li>
<li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PANTHER+database+of+protein+families%2C+subfamilies%2C+functions+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li>
<li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li>
<li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li>
<li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li>
<li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li>
<li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaujean%2C+N+%22Studying+Bovine+Early+Embryo+Transcriptome+by+Microarray%22">Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray</a>. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het eerste probleem om microarray-analyse uit te voeren met behulp van de Dag 7 embryo&#39;s van runderen krijgt niet voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit RNA voor het bestuderen van genexpressie. Traditioneel fenol / chloroform RNA-extractie en ethanolprecipitatie methode wordt niet aanbevolen voor Dag 7 embryo&#39;s, wat resulteert in een lage opbrengst en mogelijke overgebleven fenol remmen RNA-amplificatie reactie. In plaats daarvan een standaardmethode kolommen gebaseerde beter om totaal RNA te isoleren en elu...

Vroeg embryonaal verlies in hoogproductieve melkkoeien is een van de belangrijkste uitdagingen in de zuivelindustrie 1, 2. Bovine is uitgegroeid tot een interessant model voor pre-implantatie embryo-ontwikkeling van het menselijk studeren omdat ze gelijkaardige ontwikkelingsproces 3, 4. Er is echter meer onderzoek nodig om beter inzicht te krijgen over de genen die betrokken zijn bij runderen vroege embryonale ontwikkeling. Na twintig jaar sinds de eerste microarray technologie ontwikkeld in 1995 5, de ontwikkeling van verfijndere probe fabricagetechnologie verminderd drukfouten en variabiliteit van de array chips binnen en tussen verschillende microarray platforms 6. Verbeterde microarray technologie geleid tot een wijd toepassing van deze technologie in klinisch onderzoek 7 en meer recent, in vroege embryo quality assessment 8. De grote hoeveelheid benodigde materiaal voor de microarray technologie is de belangrijkste reden waarom de microarray technologie in eerste instantie niet aan een aantal onderzoeksgebieden in te voeren, zoals de vroege embryonale ontwikkeling. Meer recent zijn RNA amplificatiewerkwijzen verbeterd lineair amplificeren van RNA tot microgram niveau van sub-nanogram vanaf RNA materiaal 9. Er zijn verschillende commerciële RNA amplificatie kits op de markt; Echter, hoe meer populair goed ontwikkeld kits soortgelijk aan Ribo-Single Primer isothermische amplificatie 10 en T7-promoter gedreven 11 methoden. De meest populaire antisense RNA-amplificatie gebruikt in vitro transcriptie met oligo dT primer koppelen aan een T7 promoter 5 &#39;einde 12. Deze technologie maakt het handhaven van de meest representatieve anti-sense transcripten na lineaire versterking fof hybridisatie arrays 13. Deze werkwijze is aangepast aan picogram niveau van totaal RNA geëxtraheerd uit runder embryo 8 amplificeren. Universele verbindingssysteem (ULS) de labelingsmethode die rechtstreeks opgenomen het DNA of RNA geamplificeerd met platina gebonden fluorescerende kleurstof ofwel Cyanine 547 of 647 Cyanine, door vorming van een coördinatieve binding op positie N7 van guanine 14. Deze werkwijze werd aangepast embryo onderzoek stabieler aRNA geamplificeerd ongewijzigd vergeleken met de gemodificeerde aminoallyl ARNA gegenereerd door enzymatische methode 15 te genereren. Zowel single kleurstof en twee kleurstoffen etikettering methoden zijn aangepast met behulp van Universal Linkage System in microarray. Een grote microarray vergelijkingen studie was dat er een goede correlatie datakwaliteit tussen één- en twee-color matrix platforms 6. Onlangs, zowel T7 promotor rijdenn antisense RNA amplificatie en labeling ULS werkwijzen ontwikkeld om een meer betrouwbare protocol bij een voldoende hoge kwaliteit gemerkt aRNA materialen voor microarray hybridisatie 8, 16 te genereren. Daarom is deze studie geeft een protocol om een ​​aantal van de belangrijke stappen van RNA-extractie tot data-analyse betrokken zijn in twee kleuren microarray met behulp van dag 7 embryo&#39;s van runderen als voorbeeld te tonen.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA Screen Tape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Fluorescent Labeling Kit</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Expression Microarrays</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridization buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocking Agent</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilization and drying solution</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Pack van 20 gasket slides, 4 microarrays/slide</td></tr><tr><td>Two-Color RNA Spike-In Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B array scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Free Box</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL file</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome profilering van in-vivo geproduceerd bovine pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren microarray platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Vroege embryonale verliezen zijn een grote bijdrager aan onvruchtbaarheid bij rundvee. Bovendien wordt rundvee een interessant model om de menselijke pre-implantatie embryo ontwikkeling te bestuderen vanwege hun vergelijkbare ontwikkelingsproces. Hoewel genetische factoren bekend zijn om de vroege embryonale ontwikkeling te beïnvloeden, is de ontdekking van dergelijke factoren een serieuze uitdaging geweest. Microarray technologie maakt kwantitatieve meting en genexpressie profilering van transcript niveaus op een genoom-breed basis mogelijk. Een van de belangrijkste beslissingen die genomen moeten worden bij het plannen van een microarray experiment is of een een- of tweekleurige benadering te gebruiken. Een tweekleurige opzet verhoogt de technische replicatie, minimaliseert variabiliteit, verbetert gevoeligheid en nauwkeurigheid en maakt ook loop ontwerpen mogelijk, waarbij de gemeenschappelijke referentie monsters worden gedefinieerd. Hoewel microarray een krachtig biologisch hulpmiddel is, zijn er potentiële valkuilen die zijn kracht kunnen verminderen. Daarom demonstreren we in dit technische artikel een geoptimaliseerd protocol voor RNA extractie, amplificatie, labeling, hybridisatie van het gelabelde geamplificeerde RNA naar de array, array scannen en data-analyse met behulp van de tweekleurige analysestrategie.

Een representatief resultaat van totaal RNA geamplificeerd en aRNA vanaf dag 7 runderembryo&#39;s wordt getoond in Figuur 3 en samengevat in tabel 1. RNA integriteit en profiel kan worden vastgesteld na RNA-extractie. Kwaliteitsbeoordeling RNA kan gebeuren door bioanalyzer instrument (figuur 3A) en slechts monsters met RIN waarde hoger dan 7,0 gekwalificeerd te worden gebruikt...

Microarray-technologie maakt kwantitatieve meting en profielbepaling van genexpressie van transcripten op genoombreed niveau mogelijk. Daarom biedt dit protocol een geoptimaliseerde technische procedure in een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met gebruik van boviene embryo's op dag 7 om de haalbaarheid van het gebruik van een kleine hoeveelheid totaal RNA aan te tonen.

Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Het algemene doel van deze video is om een geoptimaliseerde technische procedure te bieden met behulp van een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met behulp van een lage hoeveelheid totaal RNA van boviene embryo's op dag zeven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot embryoverlies bij hoogproductieve melkgeiten en vragen over embryonale kwaliteit in verhouding tot genexpressie in het zich ontwikkelende embryo vóór implantatie. Het voordeel van deze techniek is dat we genexpressie kunnen bestuderen met behulp van picogramniveau van totaal RNA geëxtraheerd uit enkele embryo's.Deze methode kan inzicht geven in de factor die de overleving van in vivo geproduceerde boviene pre-implantatie embryo's beïnvloedt. Dit kan ook helpen bij het verbeteren van reproductieve technologieën zoals in vitro embryo producties. Om de procedure te beginnen, bereid snap frozen boviene embryo's voor in een microcentrifugebuisje uit een kolom-gebaseerde pico schaal RNA extractie kit.Voeg 10 microliters van lysisbuffer toe aan de buis, en incubeer de embryo's gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 800 keer G. Pipetteer 250 microliters van conditioneringsbuffer in de zuiveringskolom filtermembraan, en incubeer de kolom gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de verzamelbuis gedurende één minuut bij 16.000 keer G om de kolom voor te conditioneren.Voeg 10 microliters van 70% ethanol toe aan de mix van lysisbuffer en embryo's en meng goed. Laad vervolgens de mix op de zuiveringskolom. Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten bij 100 keer G, en vervolgens gedurende 30 seconden bij 16.000 keer G.Voeg 100 microliters van de eerste wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer bij 8.000 keer G gedurende één minuut. Gebruik een DNase kit, meng vijf microliters van stockoplossing met 35 microliters buffer, en meng door voorzichtig te keren van de gesloten buis. Laad vervolgens de DNase mix op de zuiveringskolom membraan, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Voeg 40 microliters van de eerste wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 8.000 keer G. Voeg vervolgens 100 microliters van de tweede wasbuffer toe, en centrifugeer gedurende een minuut. Voeg nog een portie van de tweede wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer gedurende twee minuten bij 16.000 keer G. Breng de zuiveringskolom over naar een andere microcentrifugebuis en laad 11 microliters van elutiebuffer op de kolom membraan.Incubeer de kolom gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 1.000 keer G, en vervolgens gedurende nog een minuut bij 16.000 keer G. Controleer de kwaliteit en hoeveelheid van het geëluteerde RNA, en bewaar vervolgens het monster in minuus 80 graden Celsius. Gebruik een amplificatie kit om 100 picogrammen van hoogwaardig RNA te versterken.Evalueer het groottebereik van de versterkte aRNA met fluorescentie-gebaseerde kwantificering. Bepaal vervolgens de concentratie van aRNA door spectrofotometrie. Bereid twee microgram van de versterkte aRNA voor voor fluorescerend labelen met een standaardkit.Stel een ozonbox in in een donkere kamer, en wacht tot het ozonniveau daalt tot 0,001 delen per miljoen. Plaats een donkere kamer filter over het licht. Breng vervolgens het monster in de ozonbox en voeg twee microliters van cyanine vijf kleurstof en labelbuffer toe.Met het monster onder een veilig licht, voeg RNase vrije water toe om een totaal volume van 20 microliters te bereiken. Meng voorzichtig het monster, en incubeer vervolgens de buis in een thermocycler gedurende 15 minuten bij 85 graden Celsius. Koel het monster gedurende één minuut op ijs, en draai vervolgens het monster naar beneden.Ruimen de gelabelde en versterkte aRNA op met een RNA extractie kit. Bepaal met behulp van het juiste type spectrometer de concentratie van gelabelde, versterkte aRNA. Bereid een tweede monster van versterkte aRNA voor, gelabeld met cyanine drie kleurstof.Bewaar de aRNA monsters gedurende maximaal drie dagen bij minuus 80 graden Celsius. Combineer 825 nanogram van Cy3 en 5 gelabelde aRNA. Voeg hieraan het blokkeerbuffer en de fragmentatie buffer toe.Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 60 graden Celsius, en koel vervolgens gedurende één minuut op ijs. Voeg 55 microliters hybridisatie buffer toe, en meng goed zonder luchtbellen te introduceren. Centrifugeer het mengsel gedurende één minuut bij 11.300 keer G.Laad 100 microliters van het monster op de array slide, en verzegel de slide in de hybridisatiekamer. Hybridiseer het monster gedurende 17 uur bij 65 graden Celsius terwijl het draait met 10 rotaties per minuut. Bereid een ozon-scavengering stabiliserende en drogende oplossing voor.Was de arrays, met voorzorgsmaatregelen om de blootstelling aan ozon te minimaliseren, en dompel ze vervolgens gedurende 30 seconden in de stabiliserende en drogende oplossing. Zorg ervoor dat het array oppervlak droog en stofvrij is. Bewaar de arrays op een donkere plaats.Zet de microarray scanner aan, en wacht tot hij klaar is om te scannen. Laad vervolgens de array met de streepjescode aan de linkerkant. Voer een spotanalyse uit, en sla de gegevens op als een GPR-bestand.Normaliseer en analyseer de gegevens in statistische analysesoftware. Bereken de positieve spot selectie drempel, en bekijk de plot van gehybridiseerde en achtergrond signalen. Voer een Loess normalisatie binnen array uit, en vervolgens een quantile tussen arrays normalisatie.Exporteer de genormaliseerde gegevens naar een spreadsheet bestand. Gebruik alle positieve signalen in een microarray data repository om een ID lijst van geselecteerde unieke genen te maken. Upload de ID lijst naar een eiwit classificatie en analyse database, kies bos taurus als het organisme, en voer een standaard statistisch overrepresentatieve

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.

Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Leer transcriptoomprofilering van in-vivo geproduceerde bovine pre-implantatie embryo's met een twee-kleuren microarray. Deze methode analyseert genexpressie met minimale RNA-hoeveelheden en biedt inzicht in embryokwaliteit en overlevingsfactoren.

Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryos met behulp van twee-kleuren Microarray Platform (Video) | JoVE Journal

Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Meer video's verkennen