Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Het algemene doel van deze video is om een geoptimaliseerde technische procedure te bieden met behulp van een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met behulp van een lage hoeveelheid totaal RNA van boviene embryo's op dag zeven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot embryoverlies bij hoogproductieve melkgeiten en vragen over embryonale kwaliteit in verhouding tot genexpressie in het zich ontwikkelende embryo vóór implantatie. Het voordeel van deze techniek is dat we genexpressie kunnen bestuderen met behulp van picogramniveau van totaal RNA geëxtraheerd uit enkele embryo's.

Deze methode kan inzicht geven in de factor die de overleving van in vivo geproduceerde boviene pre-implantatie embryo's beïnvloedt. Dit kan ook helpen bij het verbeteren van reproductieve technologieën zoals in vitro embryo producties. Om de procedure te beginnen, bereid snap frozen boviene embryo's voor in een microcentrifugebuisje uit een kolom-gebaseerde pico schaal RNA extractie kit.

Voeg 10 microliters van lysisbuffer toe aan de buis, en incubeer de embryo's gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 800 keer G. Pipetteer 250 microliters van conditioneringsbuffer in de zuiveringskolom filtermembraan, en incubeer de kolom gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de verzamelbuis gedurende één minuut bij 16.000 keer G om de kolom voor te conditioneren.

Voeg 10 microliters van 70% ethanol toe aan de mix van lysisbuffer en embryo's en meng goed. Laad vervolgens de mix op de zuiveringskolom. Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten bij 100 keer G, en vervolgens gedurende 30 seconden bij 16.000 keer G.

Voeg 100 microliters van de eerste wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer bij 8.000 keer G gedurende één minuut. Gebruik een DNase kit, meng vijf microliters van stockoplossing met 35 microliters buffer, en meng door voorzichtig te keren van de gesloten buis. Laad vervolgens de DNase mix op de zuiveringskolom membraan, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 40 microliters van de eerste wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 8.000 keer G. Voeg vervolgens 100 microliters van de tweede wasbuffer toe, en centrifugeer gedurende een minuut. Voeg nog een portie van de tweede wasbuffer toe aan de kolom, en centrifugeer gedurende twee minuten bij 16.000 keer G. Breng de zuiveringskolom over naar een andere microcentrifugebuis en laad 11 microliters van elutiebuffer op de kolom membraan.

Incubeer de kolom gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 1.000 keer G, en vervolgens gedurende nog een minuut bij 16.000 keer G. Controleer de kwaliteit en hoeveelheid van het geëluteerde RNA, en bewaar vervolgens het monster in minuus 80 graden Celsius. Gebruik een amplificatie kit om 100 picogrammen van hoogwaardig RNA te versterken.

Evalueer het groottebereik van de versterkte aRNA met fluorescentie-gebaseerde kwantificering. Bepaal vervolgens de concentratie van aRNA door spectrofotometrie. Bereid twee microgram van de versterkte aRNA voor voor fluorescerend labelen met een standaardkit.

Stel een ozonbox in in een donkere kamer, en wacht tot het ozonniveau daalt tot 0,001 delen per miljoen. Plaats een donkere kamer filter over het licht. Breng vervolgens het monster in de ozonbox en voeg twee microliters van cyanine vijf kleurstof en labelbuffer toe.

Met het monster onder een veilig licht, voeg RNase vrije water toe om een totaal volume van 20 microliters te bereiken. Meng voorzichtig het monster, en incubeer vervolgens de buis in een thermocycler gedurende 15 minuten bij 85 graden Celsius. Koel het monster gedurende één minuut op ijs, en draai vervolgens het monster naar beneden.

Ruimen de gelabelde en versterkte aRNA op met een RNA extractie kit. Bepaal met behulp van het juiste type spectrometer de concentratie van gelabelde, versterkte aRNA. Bereid een tweede monster van versterkte aRNA voor, gelabeld met cyanine drie kleurstof.

Bewaar de aRNA monsters gedurende maximaal drie dagen bij minuus 80 graden Celsius. Combineer 825 nanogram van Cy3 en 5 gelabelde aRNA. Voeg hieraan het blokkeerbuffer en de fragmentatie buffer toe.

Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 60 graden Celsius, en koel vervolgens gedurende één minuut op ijs. Voeg 55 microliters hybridisatie buffer toe, en meng goed zonder luchtbellen te introduceren. Centrifugeer het mengsel gedurende één minuut bij 11.300 keer G.

Laad 100 microliters van het monster op de array slide, en verzegel de slide in de hybridisatiekamer. Hybridiseer het monster gedurende 17 uur bij 65 graden Celsius terwijl het draait met 10 rotaties per minuut. Bereid een ozon-scavengering stabiliserende en drogende oplossing voor.

Was de arrays, met voorzorgsmaatregelen om de blootstelling aan ozon te minimaliseren, en dompel ze vervolgens gedurende 30 seconden in de stabiliserende en drogende oplossing. Zorg ervoor dat het array oppervlak droog en stofvrij is. Bewaar de arrays op een donkere plaats.

Zet de microarray scanner aan, en wacht tot hij klaar is om te scannen. Laad vervolgens de array met de streepjescode aan de linkerkant. Voer een spotanalyse uit, en sla de gegevens op als een GPR-bestand.

Normaliseer en analyseer de gegevens in statistische analysesoftware. Bereken de positieve spot selectie drempel, en bekijk de plot van gehybridiseerde en achtergrond signalen. Voer een Loess normalisatie binnen array uit, en vervolgens een quantile tussen arrays normalisatie.

Exporteer de genormaliseerde gegevens naar een spreadsheet bestand. Gebruik alle positieve signalen in een microarray data repository om een ID lijst van geselecteerde unieke genen te maken. Upload de ID lijst naar een eiwit classificatie en analyse database, kies bos taurus als het organisme, en voer een standaard statistisch overrepresentatieve