Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

Het algemene doel van deze procedure is om rat oligodendrocyt-progenitorcellen te isoleren en te kweken en de oligodendrogenese te kwantificeren als reactie op experimentele factoren. Efficiënte oligodendrogenese is het therapeutische doel op talrijke onderzoeksgebieden, waaronder ruggenmergletsel, neonatale hypoxie en demyeliniserende ziekten zoals transversale myelitis en multiple sclerose. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een protocol voor de isolatie van grote aantallen OPC's combineert met een snelle en betrouwbare methode om oligodendrogenese tegelijkertijd in meerdere experimentele omstandigheden te bepalen.

Om met deze procedure te beginnen, steriliseer al het dissectiemateriaal met behulp van een verwarmde kralensterilisator. Voeg vervolgens 15 tot 20 milliliter PBS toe aan een conische buis van 50 milliliter. Plaats de conische buis op ijs en gebruik deze om het gesneden cortexweefsel tijdens de dissectie vast te houden.

Voeg vervolgens koud PBS toe aan een 10 centimeter petrischaal die zal worden gebruikt voor dissectie onder de lichtmicroscoop. Nadat de rattenjongen zijn geofferd, snijdt u de huid achter de oren langs de middellijn met kleine schaar. En verwijder de huidflappen.

Snijd vervolgens het schedeldak langs de middellijn van de hersenstam tot de ogen. En wees voorzichtig om niet te diep te snijden om de structuur van de onderliggende cortex te behouden. Maak daarna twee laterale sneden onder het cerebellum door kleine chirurgische schaar in het foramen magnum in te brengen.

Maak een extra snede tussen de ogen voor de reukbolletjes. Schuil elke helft van het schedeldak voorzichtig terug. Verwijder de hele hersenen en plaats deze in een 10 centimeter petrischaal gevuld met koud PBS.

Onder een dissectielichtmicroscoop verwijdert u de reukbolletjes en het cerebellum met fijn chirurgisch tang. Draai de hersenen om zodat de ventrale oppervlakte zichtbaar is. Gebruik vervolgens fijne rechte tang om een stompe dissectie uit te voeren door gesloten forcepspunten tussen de cortex en hypothalamus te plaatsen tot een diepte van ongeveer tweederde van de hersenen.

Open de forceps als ze op hun plaats zijn, en herhaal de procedure voor de andere hemisfeer. Daarna scheidt u de cortex van de hypothalamus en middenhersenen. Verwijder de hypothalamus, thalamus en middenhersenen door de middenhersenen op het achterste oppervlak vast te houden en deze naar het voorste uiteinde van de hersenen te pellen.

Snijd vervolgens de voorste verbindingen door. Gebruik fijne gebogen dissectietang om de hippocampus te verwijderen en de verbinding met de cortex te verbreken. Verwijder vervolgens het resterende striatum door het in een uitwaartse diagonale beweging van de onderliggende cortex te schrapen.

Verwijder de bloedvaten en hersenvliezen van de ventrale oppervlakte van de cortex. Draai de hersenen om zodat de dorsale oppervlakte zichtbaar is. Schil de hersenvliezen van de onderliggende cortex waar de reukbol zich bevindt.

Herhaal de procedures voor een totaal van drie tot vier rattenjongen. En plaats alle gedissecteerde cortices in een petrischaal. Hak ze met een gesteriliseerde scheermes tot stukken van één millimeter bij één millimeter zijn bereikt.

Verzamel vervolgens de weefsels door de schaal met PBS te spoelen voordat u deze terug op ijs plaatst. Gebruik nu een glazen Pasteurpipet die is bevestigd aan een pipettencontroller om het weefsel mechanisch te dissociëren door tien tot vijftien keer te pipetteren of totdat de weefselstukken kleiner zijn geworden en de oplossing troebel is geworden. Keer vervolgens het monster terug naar de weefselkweekincubator van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met continue rotatie.

Voeg daarna 10 milliliter PBS toe aan elk monster en filter de homogenaat door een filter met poriën van 40 micrometer die boven een 50 milliliter buis is geplaatst. Spoel vervolgens het filter met een extra één tot twee milliliter PBS. Verzamel alle homogenaatmonsters in één conische buis van 50 milliliter en verzamel een algehele celtelling.

Na het uitvoeren van de celtelling, verdeel het homogenaat gelijkmatig in de conische buizen van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende 10 tot 12 minuten bij 300 g. Prime elke LS-kolom door vijf milliliter kolombuffer toe te voegen. En verzamel de doorstroming in een conische buis van 15 milliliter.

Zodra de kolombuffer volledig door de bovenste kamer is gegaan, brengt u 1000 microliter van de celsuspensie aan op elke kolom en laat de cellen door zwaartekracht door de kolom lopen. Verwijder vervolgens elke kolom en plaats deze in een conische buis van 15 milliliter. Voeg vijf milliliter kolombuffer toe en laat de buffer snel door de kolom stromen om de gebonden cellen los te maken en ze van de kolom te laten loskomen.

Om de cellen te kweken, verdunt u ze met OPC proliferatiemedium tot 60.000 cellen per milliliter. Pipetteer 500 microliter cellen langs de zijkant van elke zwarte, doorzichtige bodemput van een 24-putten plaat. Meng de cellen door de plaat horizontaal te schudden, met een figuur acht beweging.

Plaats in deze procedure een pipettetip van 200 microliter over een glazen Pasteurpipet om ervoor te zorgen dat de put niet wordt beschadigd tijdens het aspireren. Zuig vervolgens het medium uit de kweekputten één behandelingsgroep per keer af om uitdroging van de cellen te voorkomen. Voeg daarna langzaam 500 microliter van de behandelingsmastermix toe langs de zijkant van de put met behulp van een pipet van één milliliter.

Incubeer de culturen en voer een volledige mediumwisseling uit met vers behandelingsmedium om de twee tot drie dagen. Aan het einde van de gewenste behandelingsperiode, aspireer het medium. Voeg langzaam 400 microliter PFA toe aan de zijkant van de put om de cellen te fixeren.

En incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na 20 minuten aspireer PFA en voeg langzaam 500 microliter steriele D-PBS toe om de cellen te wassen. Herhaal de wassing nog twee keer en aspireer de laatste wassing niet.

Breng nu de plaat naar