Name: Isolatie van CD146 + Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer de isolatie van CD146+ long-mesenchymale stromale cellen uit rattengeweef via enzymatische digestie, dichtheidsgradiëntscheiding en magnetische beadselectie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar longbiologie en ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JJPC wordt ondersteund door een postdoctorale beurs van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR). MAM ontvangt een verdienstebeurs van de German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes en wordt ondersteund door een subsidie van de EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT wordt ondersteund door CIHR, de Canadian Lung Association, het Stem Cell Network en het Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa (dierethiek protocol OHRI-1696). Dierenzorg werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen. 1. Isolatie van Lung mesenchymale stromacellen <ol><li> Bereid het enzym mix in een 50 ml tube: wegen 30 U neutraal protease, 2500 AL Collagenase I en 500 U DNAse I. Deze bedragen volstaan ​​voor de longen van een volwassen muis of rat pup. Bereid op dag van isolatie en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Offer ratten op dag 13 door een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (0,2 ml, 65 mg / ml). Gebruik de teen knijpen reflex tot bewusteloosheid vast te stellen. Dood van het dier wordt verzekerd door het openen van de borstkas, zoals hieronder beschreven. </li><li> Ontsmetten van de huid van het dier sproeien met 70% ethanol en open voorzichtig de ribbenkast gebruik chirurgische schaar, vanaf het membraan en snijden naar de rostrale zijde, zeer voorzichtigde longen beschadigen. Spreid de ribbenkast geopend met behulp van hemostatische klemmen, of als alternatief weggesneden de borstkas om de toegang tot de thorax te bieden. </li><li> Exsanguinate het dier door het verwijderen van het hart. Om het hart te verwijderen, pakt u de thymus en hart met kleine tang en snijd deze weg met chirurgische schaar. Onmiddellijk daarna, absorberen het bloed met een gaasje tot er geen bloed meer komt uit de afgehakte aorta en longslagader. </li><li> Verwijder de longen uit de thorax als volgt: houd de luchtpijp met kleine tang, dan scheiden de luchtpijp met chirurgische schaar op de rostrale kant. Terwijl voorzichtig uit de thorax trekken van de longen pakket wegsnijden elke bindweefsel aan de rugzijde langs de ribbenkast naar de longen te bevrijden. </li><li> Scheiden de longen van de aorta en de slokdarm door snijden langs het membraan met chirurgische schaar. Nu de longen zijn volledig vrij van de thorax te verwijderen alle resterende bloed voorzichtig met een gaasje. </li><li> Verwijder de luchtpijp en de bronchiën met surgische schaar en zorgvuldig de longkwabben overgebracht in een 50 ml buis met koude 35 ml 30% citraat-fosfaat-dextrose Adenine (CPDA-1) anticoagulant (26,30 g trinatriumcitraat dihydraat, 3,27 g ascorbinezuur monohydraat, 2,22 g mononatriumdiwaterstoffosfaat, 31,80 g D-glucose, 0,275 g adenine in 1 L gezuiverd H 2 O, steriele filter de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed en vuil te verwijderen. </li><li> Na 5 min spoelen bij 30% CPDA-1 / PBS, breng de long een nieuwe 50 ml buis met 35 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (RT), keren zachtjes citraat verwijderen. Transfer naar een buis met 35 ml Dulbecco&#39;s PBS + Natrium-pyruvaat + Glucose (DPBS ++) (RT). Elke spoelen stap moet ongeveer 5 minuten duren. Opmerking: DPBS ++ kan commercieel worden besteld of als volgt opgebouwd 21: calciumchloridedihydraat 132,4 mg, magnesiumchloridehexahydraat 100 mg, kaliumchloride (watervrij) 200 mg monobasisch kaliumfosfaat (watervrij) 200 mg, natriumchloride (watervrij) 8000 mg, dibasisch natriumfosfaat (watervrij) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, 36 mg natriumpyruvaat in 1 L gezuiverd H2O, pH 7,3. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik. </li><li> Los het enzymmengsel door toevoeging van 10 ml DPBS ++ (voorverwarmd tot 37 ° C) en inverterende voorzichtig tot opgelost. </li><li> Breng de longen in nieuw 50 ml buis en hak de long aan de wand van de buis met behulp van een scalpel tot fijn gehakt. Voeg het enzym mix aan het weefsel (10 ml enzym mix / per volwassene muis / rat pup long), sluit de buis stevig en incubeer bij 38 ° C onder zacht schudden (hetzij in een thermische mixer, een schuddend waterbad, of een water bad met regelmatig handmatig agitatie). De tijdsduur hangt af van het type weefsel: foetaal weefsel 60 min, juveniele / volwassen weefsel 90-120 min, fibrotische volwassen weefsel 120-150 min. </li><li> Stop de spijsvertering door het chelerende het bivalente kationen wi 200 pl ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik). </li><li> Voeg 20 ml 5% foetaal runderserum (FBS) / PBS en laat de gehele suspensie door 100 urn cel zeef in een nieuwe 50 ml buis. Spoel de buis cel zeef met 10 ml 5% FBS / PBS, waardoor het totale volume op 40 ml. </li><li> Centrifugeer 5 min bij 500 xg, RT. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof (pellet moet duidelijk zichtbaar zijn), resuspendeer in 40 ml 5% FBS / PBS en herhaal centrifugeren stap 1.13. </li><li> Resuspendeer in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) en laag voorzichtig over 3 ml dichtheidsgradiënt media (1,073 g / cm 3) in een 15 ml buis 14. Om een ​​goede interfase verkrijgen, is het cruciaal dat de laagvolgorde van de enkele celsuspensie optreedt bij a&gt; 45 ° hoek zeer lage snelheid. </li><li> Centrifugeer 20 minuten bij 900 xg, medium (5/10) versnelling, zonder vertraging, 19 ° C. </li><li> Verzamel de cellen in de interphase en resuspendeer ze in 10 ml steriel PBS. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg, 21 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml voorverwarmde aangevuld L-MSC kweekmedium (minimaal essentieel medium Eagle, alfa modificatie (aMEM), aangevuld met 2 mmol L-glutamine per 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS en 1% vol / vol penicilline / streptomycine / Amfotericine B. </li><li> Herhaal het centrifugeren stap 1.18. Vervolgens, verwijder supernatant en resuspendeer in 10 ml voorverwarmde vers kweekmedium. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller en plaat met een hoge dichtheid, aangezien de meeste cellen in dit stadium niet hechtende kunststof. De exacte uitplaatdichtheid afhankelijk van de diersoort en de leeftijd, bijvoorbeeld, zijn de cellen van een volwassen muislong gezaaid met 10 5 cellen / cm2, terwijl cellen van een rattenpup long voldoende dicht bij een zaaidichtheid van 1-2 x 10 4 cellen / cm 2 </sup&gt;. Gebruik 0,2 ml L-MSC kweekmedium / cm2. </li><li> Cultuur L-MSC&#39;s in een bevochtigde 5% O2, 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C. </li><li> Veranderen medium 24 uur na de eerste enting, en vervolgens om de 3 dagen na eenmaal spoelen met PBS. De cellen moeten gekweekt tot 80-90% confluentie, die 3-5 dagen duurt gemiddeld afhankelijk van het dier van herkomst. Hogere samenloop zal differentiatie te bevorderen in fibroblasten. </li></ol> 2. Selectie van CD146 + Lung mesenchymale stromale cellen <ol><li> Coating van Magnetic Beads met secundair antilichaam <ol><li> Laag de magnetische kralen met gebiotinyleerd secundair antilichaam, in een verhouding van 10 ug secundair antilichaam / 100 gl magnetische beads in een ronde bodem steriel 2 ml cryovial onder steriele omstandigheden. Gebruik 10 ul secundair antilichaam per verwachte 0,5 x 10 6 cellen en gebruik minste 100 gl magnetische korrels en 10 ug antilichaam. Opmerking: De verhouding van eentibodies gebruikt per volume van kralen kunnen verschillen tussen de fabrikanten, volg dan de instructies van de fabrikant voor de kralen van uw keuze. Voor dit protocol, zie tabel 1 voor de kralen en antilichamen die werden gebruikt in de optimalisatie van dit protocol. </li><li> Incubeer in een roterende steekproef mixer gedurende 30 minuten bij 30 omwentelingen / min (rpm), bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de kralen in 1,5 ml steriele 0,1% runderserumalbumine (BSA) / PBS en transfer naar een 3 ml ronde bodem buis (flow cytometrie buis). Spoel de cryovial met een extra 1,5 ml 0,1% BSA / PBS en plaats het 3 ml buisje. </li><li> De buis wordt op geschikte magneet en wacht 2 min totdat alle korrels zijn bevestigd aan de achterwand van de buis en de oplossing blijft helder. Verwijder afvoer en herhaal wassen met 3 ml 0,1% BSA / PBS twee keer. </li><li> Resuspendeer de kralen in 3 ml 0,1% BSA / PBS en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Gebruik binnen 5 dagen. </li></ol></li><li> Etikettering CD146 + L-MSC&#39;s<ol><li> Oogst de mesenchymale cellen na spoelen met PBS met behulp van een zachte niet-trypsine oplossing. Opmerking: Volumes afhankelijk van de grootte van kweekfles (0,2 ml / cm 2 medium of PBS). <ol><li> Verwijder kweekmedium en spoel de cellen drie keer met steriele PBS. </li><li> Voeg de juiste hoeveelheid zachte niet-trypsine oplossing (zie tabel 1). Incubeer bij 37 ° C in de incubator totdat de cellen losgemaakt, ongeveer 10 minuten bij gebruik van de oplossing in tabel 1. </li><li> Inactiveren enzym door toevoeging van L-MSC kweekmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g. </li></ol></li><li> Verwijder supernatant, resuspendeer cellen in 0,1% BSA / PBS en tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan. Opmerking: Het volume van 0,1% BSA / PBS afhankelijk van de grootte van kweekfles: streven naar 5 of 10 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Herhaal stap 2.2.2 en resuspendeer de specifieke hoeveelheid cellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (blokken unspecifieke binding sites en houdt de cellen in leven). Houd cellen op ijs. </li><li> Bereid een 3 ml ronde bodem buis met de primaire anti-CD146 antilichaam, en blijf op ijs. Opmerking: De concentratie van primair antilichaam dat wordt toegevoegd aan de specifieke hoeveelheid cellen afhankelijk van het antilichaam dat wordt gebruikt. Voor een adviesprijs anti-rat CD146 antilichaam zie tabel 1. </li><li> Voeg het totale volume van de cellen uit stap 2.2.3 aan de buis met het primaire antilichaam. Sluit en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C. </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 xg, 4 ° C, verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. Herhaal stap centrifuge. </li><li> Resuspendeer de cellen in 3 ml oplossing die secundair antilichaam beklede kralen die werd bereid volgens de instructies in paragraaf 2.1 en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Het selecteren van CD146 + L-MSC&#39;s<ol><li> Plaats de buis met het label CD146 + L-MSCs op de magneet. De positieve cellen wordt gevestigd op de achterkant van de buis. Zonder het verplaatsen van de buis of het aanraken van de kralen, de oogst van de bovenstaande vloeistof met de negatieve cellen langzaam met een steriele Pasteur pipet (deze kunnen ofwel worden afgehaald of weggegooid op basis van de experimenteel design). </li><li> Haal de buis uit de magneet en resuspendeer de cellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Herhaal de selectieprocedure in stap 2.3.1 beschreven. vier keer (Σ 5 selectie stappen). </li><li> Resuspendeer de CD146 + L-MSC in voorverwarmde L-MSC kweekmedium en terug naar de magneet. </li><li> Verwijder supernatant, resuspendeer in L-kweekmedium en MSC plaat in een geschikt formaat kolf (0,2 ml / cm 2). Als vuistregel plaat cellen in dezelfde grootte kolf waaruit de cellen werden vóór bead-selectie opgeheven. Het aantal CD146 + L-MSC&#39;s, en derhalve de plaatdichtheid, zalafhankelijk van de leeftijd, soort en stam van de dierlijke bron. Streven altijd naar een plating dichtheid van ~ 5000 cellen / cm2. Opmerking: De kralen zal niet verstoren de celgroei en zal geleidelijk verdwijnen als de cellen vermenigvuldigen. </li></ol></li></ol> 3. vriescellen <ol><li> Gebruik de volgende vriesmedium: 60% pentazetmeel-oplossing (10% pentazetmeel in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimethylsulfoxide (DMSO) 22. Opmerking: Indien niet alle ingrediënten zijn, een oplossing die 5% DMSO, 30% FBS en 65% aMEM is een goed alternatief. </li><li> Resuspendeer cellen bij 0,5 x 10 6 cellen / ml, in cryovials hoeveelheid van 1 ml elk en vries O / N bij -80 ° C met een bevriezing container. </li><li> Verwijzing naar een vloeibare stikstof opslagtank de volgende dag. </li></ol> 4. Ontdooien Cellen <ol><li> Dooi een flacon van cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer cellen in 10 mlvoorverwarmd kweekmedium en centrifugeer 5 min bij 500 xg, 21 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml kweekmedium. Zaadcellen in een ontluchtingsdop celkweek behandeld kolven bij 5000 cellen / cm2 in 0,2 ml / cm2 media (bijvoorbeeld 15 ml voor een 75 cm2 kolf). </li><li> Kweekcellen in 5% O2, 5% CO2 totdat 80-90% confluent voor het oogsten en / of experimenteel gebruik. Over-confluentie zal differentiatie induceren. Wanneer zaaien bij 5.000 cellen / cm 2, zal L-MSC&#39;s 80-90% confluentie bereiken binnen 3-4 dagen van de cultuur. </li></ol>

<ol><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Wei, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXF1+mediates+mesenchymal+stem+cell+fusion-induced+reprogramming+of+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells.</a> Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).</li>
<li>Marriott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2pos+lung+mesenchymal+stem+cells+are+a+novel+pericyte+subpopulation+that+contributes+to+fibrotic+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).</li>
<li>Collins, J. J., Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+mesenchymal+stromal+cells+in+development+and+disease%3A+to+serve+and+protect%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).</li>
<li>McQualter, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27, 623-633 (2009).</li>
<li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+stem+cell+antigen-1%3A+expression%2C+function%2C+and+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).</li>
<li>Gottschling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+non-small+cell+lung+cancer--different+from+others%3F+Insights+from+comparative+molecular+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses.</a> Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).</li>
<li>Bertoncello, I., McQualter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+clonal+assay+of+adult+lung+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).</li>
<li>Jun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+bleomycin-induced+fibrosis+is+associated+with+loss+of+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+that+regulate+effector+T-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation.</a> Stem Cells. 29, 725-735 (2011).</li>
<li>Majka, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+resident+pulmonary+stem+cells%3A+form+and+function+of+the+lung+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population.</a> Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).</li>
<li>Hennrick, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cells+from+neonates+show+a+mesenchymal+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype.</a> Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).</li>
<li>Salama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+governs+proliferation+and+migration+of+bronchoalveolar+lavage-derived+lung+mesenchymal+stem+cells+in+bronchiolitis+obliterans+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome.</a> Transplantation. 92, 155-162 (2011).</li>
<li>Hoffman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-derived+mesenchymal+stromal+cell+post-transplantation+survival%2C+persistence%2C+paracrine+expression%2C+and+repair+of+elastase-injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung.</a> Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Grisendi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-manufactured+density+gradient+media+for+optimized+mesenchymal+stromal%2Fstem+cell+isolation+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion.</a> Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).</li>
<li>Bardin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Endo+1%2C+a+pan-endothelial+monoclonal+antibody+recognizing+a+novel+human+endothelial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+antigens%22%5BJournal%5D)">S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen.</a> Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).</li>
<li>Covas, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+obtained+from+diverse+human+tissues+share+functional+properties+and+gene-expression+profile+with+CD146%2B+perivascular+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts.</a> Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+high-capacity+assay+to+quantify+the+clonal+heterogeneity+in+trilineage+potential+of+mesenchymal+stem+cells+reveals+a+complex+hierarchy+of+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment.</a> Stem Cells. 28, 788-798 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+CD146%2B+multipotent+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells.</a> Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).</li>
<li>Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+distinguishing+mesenchymal+stem+cells+from+fibroblasts+are+downregulated+with+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging.</a> Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).</li>
<li>McGowan, S. E., Torday, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+lipofibroblast+%28lipid+interstitial+cell%29+and+its+contributions+to+alveolar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development.</a> Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).</li>
<li>Hayakawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%25+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+and+pentastarch+improves+cryopreservation+of+cord+blood+cells+over+10%25+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO.</a> Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+self-renew+and+differentiate+according+to+a+deterministic+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy.</a> PLoS One. 4, 6498(2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+tissues+by+adult+stem%2Fprogenitor+cells+%28MSCs%29%3A+controversies%2C+myths%2C+and+changing+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).</li>
<li>Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).</li>
<li>Boron, W. F., Boulpaep, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoron%2C+WF+%22Medical+Physiology.+2nd+edn%22">Medical Physiology. 2nd edn</a>. , Saunders Elsevier. (2009).</li>
<li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter%3F+Small+molecules+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).</li>
<li>Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+alveolar-capillary+O2+partial+pressure+gradient+by+using+15NO%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide+%3A+biology+and+chemistry+%2F+official+journal+of+the+Nitric+Oxide+Society%22%5BJournal%5D)">Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO.</a> Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).</li>
<li>Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+stem+cell+biology%3A+a+critical+component+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche.</a> Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).</li>
<li>Krampera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+characterization+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells-The+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29+working+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal.</a> Cytotherapy. , (2013).</li>
<li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+perivascular+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Expression+of+Neuron-Glial+Antigen+2+%28NG2%29and+Melanoma+Cell+Adhesion+Molecule+%28CD146%29+in+Heterogeneous+Cultures+of+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue engineering. Part A. , (2013).</li>
<li>Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).</li>
<li>Dagur, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+interleukin-17+by+CD8%2B+T+cells+expressing+CD146+%28MCAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM).</a> Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).</li>
<li>da Silva Meirelles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+adipose+tissue+pericytes+and+mesenchymal+stromal+cells+display+a+very+similar+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+MSCs+are+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">All MSCs are pericytes.</a> Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).</li>
<li>McGowan, S. E., McCoy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibroblast+lipid+storage+and+myofibroblast+phenotypes+during+alveolar+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).</li>
<li>Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+expression+in+alveolar+fibroblasts+during+realveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Bonyadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+self-renewal+deficiency+leads+to+age-dependent+osteoporosis+in+Sca-1%2FLy-6A+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).</li>
<li>Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+and+progenitor+defects+in+Sca-1%2FLy-6A-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice.</a> Blood. 101, 517-523 (2003).</li>
<li>Chow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+contribute+to+pulmonary+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+circulation%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling.</a> Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De isolatie en de cultuur van primaire L-MSC&#39;s biedt een kans om hun functie en hun interactie met andere celpopulaties op cellulair niveau, en hun rol in de ontwikkeling van de longen, gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Dit is vooral belangrijk omdat het ontbreken van één specifieke marker van deze cellen maakt het bijna onmogelijk om deze cellen te bestuderen in situ. Zoals bij alle primaire cel populaties, moet men in gedachten houden dat deze cellen meer kans om hun karakter te veranderen hoe lang...

Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC&#39;s voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC&#39;s. Tijdens de ontwikkeling, waaronder de longen, het mesenchym is een belangrijke bron van ontwikkelings signalen en resident MSCs een waarschijnlijke kandidaat te zijn in het midden van dit. Bovendien is het bewijs in opkomst die inwoner MSC&#39;s worden verstoord bij volwassen ziekten, waaronder kanker 1,2 en fibrose 3. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen 4. Stamcel antigeen-1 (Sca-1) werd geïdentificeerd bij muizen als een marker voor een verscheidenheid van weefsels stamcellen, en kan worden gebruikt voor de isolatie van L-MSC 5, maar heeft helaasgeen bekende orthologen uit andere soorten 6. Onderzoekers hebben een verschillende isolatiemethoden voor de isolatie van L-MSC&#39;s van ofwel longweefsel of vloeibare gerapporteerd. Deze variëren van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde methodes selecteren op CD31 - / CD45 - / CD90 + cellen 7, CD31 - / CD45 - / epitheliale cel adhesiemolecuul (EpCAM) - / Sca-1 + -cellen 8, multidrug resistentie transporter ATP bindende cassette G (ABCG2) positieve cellen 9 of Hoechst 33342 kleurstof efflux 10, kunststof hechting 11,12 en migratie uit gehakt weefsel 13. De voordelen van de hierin voorgestelde werkwijze zijn meervoudig. Door middel van een zachte enzymatische digestie en dichtheidsgradiënt 14, verkrijgt men alle cellen van het dichtheidbereik dat MSC&#39;s omvatten maar exclusief epitheel- en endotheelcellen. De daaropvolgende plastic hechting maatregel wordt bereikt dat alleen de mesenchymal cellen hechten en verblijf in de cultuur, waardoor leukocyten. Belangrijker echter, de CD146 + selectiestap maakt de eliminatie van fibroblasten, aangezien deze cellen niet CD146 tot expressie. Expressie van de celadhesie molecuul CD146 is positief gecorreleerd met multipotentie, en is daarom een goede marker om onkruid uit fibroblasten van een mesenchymale celpopulatie 15-19. Dit is een voordeel boven het gebruik van CD90 als een selectiemerker, omdat het niet alleen uitgedrukt in MSC&#39;s maar ook in lipofibroblasts 5,20. In dit protocol hebben we nadrukkelijk gekozen voor een magnetisch bolletje selectie, omdat het zachter op de cellen, en de gehele procedure kan worden uitgevoerd in steriele omstandigheden. Een ander belangrijk voordeel van deze isolatiemethode in plaats van de uitgroei methode is dat het relatief snel, 6-10 dagen in tegenstelling tot een maand of meer voor de uitgroei methode. Drie tot vijf dagen na de oorspronkelijke isolatie de mesenchymale populatie is gereed voor CD146 + sele<html> ction; Na nog drie tot vijf dagen de CD146 + cellen direct worden gebruikt voor experimenten of kan worden ingevroren voor later gebruik. De verminderde tijd cultuur verbetert de kwaliteit van de cellen als MSCs transdifferentiëren richting fibroblasten verlengde ex vivo kweken 19. Tenslotte vanwege de aard van het protocol, is het mogelijk om deze methode toe te passen op andere soorten door simpelweg geschikte antilichamen te kiezen of zelfs andere orgaansystemen door aanpassing van de keuze van verteringsenzymen en incubatietijd. Een gedetailleerd protocol van deze isolatiewerkwijze wordt hieronder gegeven, en een schematisch overzicht van de isolatie en daaropvolgende selectie van de CD146 + subpopulatie wordt respectievelijk gegeven in Figuur 1A en 1B. Bovendien worden gegevens welke voor passage, invriezen en ontdooien van deze cellen. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Schematisch overzicht van de isolatie van pulmonale mesenchymale cellen (A) en daaropvolgende CD146 + celselectie (B) min = minuten.; EDTA = Ethyleendeniaminetetraacetaat; 2 e Ab = secundair antilichaam; a-CD146 Ab = primaire anti-CD146 antilichaam; ve cellen = CD146 negatieve cellen; + ve cellen = CD146 positieve cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutral Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td><td>-</td><td>Gebruik 0,2 ml voor rattenpups tussen 20-30 g; grotere dieren kunnen meer nodig hebben.</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Zeer cruciaal om dit type D-PBS te gebruiken, omdat het calcium en magnesium dat aanwezig is in deze D-PBS de enzymatische vertering vergemakkelijken</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1,073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Dichtheidsgradiënt media. Om een goede interfase te verkrijgen, is het cruciaal dat de laagvorming van de enkellaags cellensuspensie plaatsvindt onder een hoek van >45&deg; op zeer lage snelheid, en dat de daaropvolgende centrifugatie wordt gedaan bij 19 &deg;C.</td></tr><tr><td>&alpha;MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Verwarm in een 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicilline/Streptomycine/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Magneetkralen</td></tr><tr><td>biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Biotinyleerde secundair antilichaam dat overeenkomt met het anti-rat CD146 antilichaam beschreven hieronder</td></tr><tr><td>DynaMag5-magneet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magneet die wordt aanbevolen voor gebruik met Dynabeads. OPMERKING: magneet moet worden gekozen op basis van de instructies van de fabrikant van de magneetkralen van keuze.</td></tr><tr><td>TrypLE express&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Zachte niet-trypsine alternatief, gebruik 1 ml TrypLE express/25 cm2 oppervlakte. Na loskoppeling is 10 ml L-MSC kweekmedium voldoende om 3 ml TrypLE te inactiveren</td></tr><tr><td>anti-rat CD146 antilichaam</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12,5 &mu;l per 0,5 x 106 cellen</td></tr><tr><td>Pentaspan (pentastarch oplossing)</td><td>Bristol-Myers Squibb Canada</td><td>-</td><td>Kan worden verkregen via lokale bloedgeversorganisaties of hematologieafdelingen. Als alternatief zou men de PSI 20% Pentastarch oplossing (Preservation Solutions, PST001) kunnen gebruiken, verdund 1:1 met 0,9% NaCl.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty invriescontainer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Verbetert de levensvatbaarheid bij het invriezen van L-MSC's 's nachts bij -80 &deg;C</td></tr></tbody></table>

isolatie van cd146<sup&gt; +</sup&gt; resident lung mesenchymale stromale cellen van rat longen

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC&#39;s voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC&#39;s. Bovendien hebben ze waarschijnlijk een rol bij normale orgaanontwikkeling en zijn toegewezen rol in ziekte, met name die met een fibrotische aard. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen. De isolatie techniek die hier beschreven geldt meerdere kenmerken van de long resident MSC&#39;s (L-MSC). Bij het offer van de ratten, zijn longen verwijderd en gespoeld meerdere keren om bloed te verwijderen. Naar aanleiding van mechanische dissociatie door scalpel, worden de longen verteerd gedurende 2-3 uur met behulp van een mix van het type collagenase I, neutraal protease en het type DNase I. De obtained enkele celsuspensie wordt vervolgens gewassen en gelaagd over dichtheidsgradiënt medium (dichtheid 1,073 g / ml). Na centrifugatie worden cellen uit de interfase gewassen en uitgeplaat in kweek behandelde flessen. Cellen worden gekweekt gedurende 4-7 dagen in fysiologische 5% O2, 5% CO 2 condities. Om fibroblasten (CD146 -) afbreken en een bevolking van slechts L-MSC&#39;s (CD146 +), positieve selectie voor CD146 + cellen te waarborgen wordt uitgevoerd door middel van magnetische bead selectie. Samengevat, deze procedure levert betrouwbare een populatie van primaire L-MSC&#39;s voor verdere in vitro onderzoek en manipulatie. Vanwege de aard van het protocol, kan het gemakkelijk worden vertaald naar andere experimentele diermodellen.

Twee van de meest betrouwbare fysische eigenschappen van MSCs, dichtheid en kunststof hechting, worden in het eerste deel van dit protocol om de mesenchymale celfractie van de long die L-MSC&#39;s bevat te verkrijgen. Hoewel de dichtheidsgradiënt interfase omvat monocyten en macrofagen naast long mesenchymale cellen, de plastic hechting gevolgd door 3-5 dagen kweken zorgt ervoor dat alleen de long mesenchymale cellen blijven. Inderdaad deze celpopulatie drukt de klassieke MSC oppervlak m...

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro CD146-positieve residente mesenchymale stromale cellen of MSC's te karakteriseren die uit de ratlong zijn geïsoleerd met behulp van een combinatie van enzymatische digestie, dichtheidsgradiëntseparatie, plasticadherentie en bead-sorting. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van longziekten over hoe long-MSC's bij ziekte worden geïnfecteerd en hoe zij bijdragen aan immuunmodulatie en weefselherstel. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze snel en reproduceerbaar is en eenvoudig kan worden toegepast op verschillende soorten proefdieren of weefsels.Arul Vadivel, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium, zal de eerste stappen van de procedure demonstreren. Om de long uit de thorax te verwijderen, houdt u de trachea vast met een kleine pincet en gebruikt u een chirurgische schaar om de trachea aan de rostrale zijde door te snijden. Terwijl u het longpakket voorzichtig uit de thorax trekt, snijdt u vervolgens elk bindweefsel aan de dorsale zijde langs de ribbenkast weg.Snijd langs het diafragma om de longen te scheiden van de aorta en de slokdarm, en gebruik gaas om voorzichtig resterend bloed uit het longweefsel te verwijderen. Verwijder met een schaar de trachea en de bronchiën en plaats de longkwabben voorzichtig in een 50 milliliter buis met 35 milliliter koud CPDA-anticoagulans en PBS om het bloed en het debris te verwijderen. Na vijf minuten worden de longen overgebracht naar een nieuwe 50 milliliter buis met 35 milliliter steriele PBS op kamertemperatuur.Keer de buis voorzichtig om om het citraat te verwijderen. Spoel de longen na vijf minuten in een nieuwe buis van 50 milliliter met 35 milliliter steriele Dulbecco's PBS op kamertemperatuur, aangevuld met natriumpyruvaat en glucose, en keer de buis voorzichtig om. Breng de longen vervolgens over naar een andere buis van 50 milliliter en gebruik een scalpel om het weefsel fijn te hakken tegen de wand van de buis.Het is zeer belangrijk om het weefsel in zeer kleine stukjes te snijden om een maximale celopbrengst te garanderen. Werk daarnaast snel om een robuuste celviabiliteit te waarborgen. Wanneer al het weefsel is fijngehakt, voegt u vers bereid enzym toe aan de buis en sluit u het dopje stevig.Incubeer vervolgens de weefselstukjes bij 38 °C met zachte agitatie gedurende de juiste digestieperiode. Stop aan het einde van de incubatie de digestie met 200 µL steriel gefiltreerde EDTA. Voeg 20 mL PBS aangevuld met FBS toe aan de weefselsuspensie en breng de volledige suspensie door een 100 µm celzeef in een nieuwe buis van 50 mL.Spoel vervolgens de digestiebuis en de celzeef met 10 milliliters FBS/PBS en trek het spoelmiddel door met een gefiltreerd monster. Na het twee keer centrifugeren van de cellen, wordt het tweede pellet resuspendeerd in vier millimeters FBS/PBS op kamertemperatuur. Breng de cellen vervolgens langzaam aan in laagjes over drie milliliters dichtheidsgradiëntmedium onder een hoek van meer dan 45 graden.Door te kloppen in een hoek van meer dan 45 graden tussen de celsuspensie en het dichtheidsgradiëntmedium worden schuifkrachten voorkomen die de cellen met het gradiëntmedium zouden mengen, waardoor de lagen kunnen worden gevormd; als er menging optreedt, zal er geen dichtheidsgradiënt ontstaan. Scheid de cellen door middel van centrifugatie en verzamel de interfase. Was vervolgens de long-MSC's in 10 milliliters steriel PBS en resuspendeer het pellet in voorverwarmd compleet long-MSC-kweekmedium voor het uitplaten.Om de CD146-positieve celpopulatie te isoleren, worden magnetische beads eerst gecoat met 10 µg gebiotinileerd secundair antilichaam per 100 µL magnetische beads, in een steriele cryovial met ronde bodem van 2 mL onder steriele omstandigheden. Incubeer de beads en het antilichaam 30 minuten bij kamertemperatuur en 30 RPM op een roterende monstermixer. Resuspendeer de antilichaam-geconjugeerde beads vervolgens in 1,5 mL PBS aangevuld met BSA en breng de beads over naar een flowcytometrie-buis met ronde bodem van 3 mL.Spoel het cryovial opnieuw met 1,5 milliliters BSA/PBS en trek de wasvloeistof samen met de beads naar binnen. Plaats de buis gedurende twee minuten op een geschikte magneet totdat alle beads aan de achterwand van de buis zijn gehecht en de oplossing helder wordt. Verwijder vervolgens het supernatant en was de beads nog twee keer met drie milliliters BSA/PBS.Spoel de MSC's drie keer met niet-gesupplementeerde PBS. Behandel de cellen na de laatste wasbeurt gedurende 10 minuten bij 37 °C met een milde, niet-trypsine-bevattende oplossing. Wanneer alle cellen zijn losgekomen, voegt u vers kweekmedium voor long-MSC's toe en centrifugeert u de cellen.Resuspendeer het pellet in PBS plus BSA en tel de cellen. Breng de cellen vervolgens over naar een buis van drie milliliter die CD146 primaire antilichaam bevat, sluit de buis en incubeer de cellen op een roterende mengmachine bij 15 RPM en vier graden Celsius. Was de cellen aan het einde van de incubatie twee keer in drie milliliter PBS plus BSA en resuspendeer het tweede pellet in drie milliliter van de met secundair antilichaam geconjugeerde beads.Na 30 minuten op de roterende monstermenger bij vier graden Celsius, wordt de buis op de magneet geplaatst en wordt een steriele pasteurpipet gebruikt om de negatieve cellen langzaam en voorzichtig te verwijderen. Vervolgens worden de cellen, nadat de buis van de magneet is gehaald, geresuspendeerd in drie milliliters PBS aangevuld met BSA, waarna het selectieproces nog vier keer wordt herhaald. Na de laatste verwijdering van negatieve cellen worden de CD146-positieve long-MSC's gewassen in voorverwarmd kweekmedium.Resuspendeer tot slot de met beads geconjugeerde cellen in vers kweekmedium voor long-mesenchymale stromale cellen en breng 5.000 cellen per vierkante centimeter aan in een kweekfles van passende grootte. Plastic-adherentie, gevolgd door drie tot vijf dagen kweek, verrijkt de populatie van de interfaselaag uit de dichtheidsgradiëntseparatie voor CD90-, CD73- en CD146-positieve long-MSC's.Bovendien zijn deze cellen in staat tot een colony forming unit-efficiëntie van ongeveer 30%, wat veel hoger is dan wat doorgaans wordt gerapporteerd voor beenmerg of andere MSC-subsets die differentiëren langs de drie klassieke MSC-lijnen. Positieve selectie op de CD146-positieve subpopulatie resulteert schijnbaar in een celpopulatie die sterk verrijkt is met long-MSC's, zoals aangetoond door een hoger percentage cellen dat MSC-geassocieerde oppervlaktemerkers tot expressie brengt. Deze cellen vertonen ook een aanzienlijk hoger colony forming-potentieel en een sterkere differentiatierespons, in het bijzonder in de chondrogene cellijn, vergeleken met de totale mesenchymale celpopulatie die vóór de CD146-selectie is verkregen.Het is opmerkelijk dat deze long-MSC's zeer weinig echte adipocyten vormen en veel meer spoelvormige cellen vertonen die gevuld zijn met kleine lipidevesikels, wat mogelijk de lipofibroblast-afstamming weerspiegelt die cruciaal is voor zowel de longontwikkeling als de ondersteuning van alveolaire type 2-cellen. Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen CD146-positieve long-MSC's binnen zes tot 10 dagen worden verkregen, hoewel de opbrengst afhankelijk zal zijn van de leeftijd en de soort van het dier. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te werken om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de gemengde lymfocytenreactie of wondgenezings-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de efficiëntie van MSC's bij het remmen van T-celproliferatie en het ondersteunen van wondgenezing. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het isoleren van CD146-positieve long-MSC's middels enzymatische digestie, dichtheidsgradiëntscheiding, plasticadherentie en bead-sortering.

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

In dit artikel tonen we de isolatie van murine inwoner long mesenchymale stamcellen (MSC long), hun expansie, karakterisering en analyse van immunomodulerende eigenschappen.

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van de kaak hebben belangrijke functies bij diverse differentiatie, zelfvernieuwing en immuunmodulatie. Ze zijn naar voren gekomen als een cruciaal reservoir van voorlopercellen in gentherapie, weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een unieke methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen van kaakbeenmerg bij ratten.

Techniek voor isolatie en kweek van mesenchymale stamcellen van rattenkaakbeenmerg

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en effectieve manier om retinoïde-bevattende cellen te isoleren uit zeer heterogene longcelpopulaties door gebruik te maken van specifieke retinoïde autofluorescentie en door gebruik te maken van fluorescerend-geactiveerde celsortering.

Isolatie van longretinoïde-bevattende cellen door celsortering

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Leer de isolatie van CD146+ long-mesenchymale stromale cellen uit rattengeweef via enzymatische digestie, dichtheidsgradiëntscheiding en magnetische beadselectie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar longbiologie en ziekteprocessen.

Isolatie van CD146

Meer video's verkennen