Het halen van Metrics voor Driedimensionale Root Systems: Volume en Surface Analysis van In-bodem X-ray Computed Tomography Gegevens

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van kwantitatieve informatie over plantenwortels uit X-ray computed tomography-gegevens van de bodem. Deze methode om de wortelstructuur van levende planten te onderzoeken kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen de biologische wetenschappen, zoals de manier waarop planten reageren op veranderende omgevingsfactoren zoals droogte, microbiële activiteiten en dergelijke. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze niet-invasief is, waardoor we planten in hun natuurlijke omgeving, de bodem, kunnen bestuderen.

Een visuele demonstratie van deze methode is waardevol, aangezien de procedure talloze stappen bevat, waaronder tomografische beeldvorming, datareconstructie en analyse, die zonder visuele ondersteuning onduidelijk kunnen zijn. Plaats voor het begin een potplant op de monstermanipulator van de röntgentomografie-scanner op de gewenste afstand voor de doelvergroting. Stel voor een plant in een houder met een diameter van twee inch de afstand tussen het monster en de bron in op ongeveer drie inch.

Stel in de software voor instrumentbeheer de X-ray-vermogensinstellingen in op 85 kilovolts en 190 microamps. Stel vervolgens de belichtingstijd in op één seconde voor een betere signaal-ruisverhouding. Stel het aantal projecties in op 3.142 en het aantal frames per projectie op vier voor goede datastatistieken.

Selecteer met de zojuist ingestelde scanparameters het tabblad "Shading Correction". Klik vervolgens op "New" en geefHet bestand voor de schaduwcorrectie een naam. Klik daarna op "Present" om de nieuwe condities te bevestigen.

Klik vervolgens op "Create" en klik op "OK" om twee referentiebeelden te gebruiken. Klik daarna op "Generate". Wanneer het waarschuwingsvenster verschijnt, dient u het monster fysiek uit de straalpad te verwijderen voordat u op "OK" klikt. De schaduwcorrectie zal nu worden uitgevoerd.

Klik nu op het tabblad "Acquisition". Geef het data bestand een naam en selecteer vervolgens "None" voor het röntgenfilter. Zorg ervoor dat het selectievakje "Minimise ring artefacts" is aangevinkt, zodat het monster in hoekstappen wordt geroteerd terwijl de projectiebeelden worden vastgelegd.

Start tot slot de scan door op de knop "Acquire" te klikken. Laad de ruwe gegevens na acquisitie in het reconstructieprogramma. Vergelijk de eerste en laatste afbeeldingen door op "Blink" te klikken om er zeker van te zijn dat het preparaat niet is verschoven of dat de scaninstellingen niet zijn gewijzigd tijdens de gegevensacquisitie.

Bereken het rotatiecentrum, of COR, door het tabblad "Center of rotation" te selecteren en de opties "Automatic COR finding" met "High Quality" nauwkeurigheid en "Dual slice selection for COR calculation" te gebruiken. Klik vervolgens op "Start" om de berekening uit te voeren. Nadat de COR is gevonden, klikt u op het tabblad "Volume" om het monster te selecteren dat moet worden gereconstrueerd.

Gebruik de miniaturen om de selectievensters voor het volume te bewerken. Klik vervolgens op "Start" om de reconstructie uit te voeren en het volumebestand met 3D-gegevens te genereren. Om een beeldstack voor te bereiden die verwerkbaar is in RooTrak, laadt u het volumebestand in ImageJ door op Bestand, Importeren, Raw te klikken en vervolgens het volumebestand te selecteren.

Om het beeldcontrast tussen de wortel en de bodem te optimaliseren, klikt u op het tabblad "Image", kiest u vervolgens "Adjust Brightness/Contrast" en selecteert u Auto. Wanneer het onderzoeksgebied duidelijk zichtbaar is, worden de instellingen als geoptimaliseerd beschouwd. Sla de beelden op als een beeldstack in JPEG-, BMP- of PNG-formaat door op "Save As" te klikken en "Image Sequence" te kiezen.

Om de wortel in RooTrak te segmenteren, selecteert u het tabblad "Tools" en kiest u Tracker. Dubbelklik vervolgens op het witte invoerveld van het dialoogvenster om een stapel afbeeldingen te laden. Nadat de afbeeldingen zijn geladen, kiest u het tabblad "Tracker" en plaatst u startpunten in de wortel door op verschillende punten te klikken binnen elk van de relevante wortelsecties die zichtbaar zijn in de bovenzicht-doorsnede van de volumedata.

Stel de tracker-parameter smoothness in op 0.3 en similarity op 0.8. Klik op het veld onder "Output Directory" om een map te kiezen. Klik vervolgens op "Select Folder" en klik op Start.

De trackingfunctie zal vervolgens worden uitgevoerd. Hiermee wordt de wortel gevolgd vanaf de bovenste beeldsectie tot aan de onderste sectie. Selecteer na het openen en bekijken van de volumedata het aantal secties op basis van het bruikbare datavolume.

In het hier getoonde voorbeeld werd het volgen gestopt bij 200 coupes, wat overeenkomt met een diepte van 6,2 millimeter, aangezien de wortelgrenzen daar onduidelijk werden. Om volume- en oppervlakteanalyse uit te voeren in ImageJ, wordt de beeldstapel uit RooTrak omgezet naar een binair beeldformaat door Process, Binary en vervolgens Make Binary te selecteren. Gebruik de opensource ImageJ-plugin BoneJ om het driehoekige netwerk te maken door Plugins, BoneJ en vervolgens Isosurface te selecteren.

Stel in het optiesvenster dat opent 'Resampling' en 'Threshold' respectievelijk in op zes en 120. Vink vervolgens 'Show surface' aan en klik op de knop 'OK'. Klik in de 3D-viewer die nu opent op het tabblad 'File'.

Klik vervolgens op "Export surfaces" en sla het bestand op als STL-binair. Open ten slotte IMESHJ. Laad het STL-bestand door op "Select STL File" te klikken en voer de voxelgrootte in microns in.

Klik op "Enter Voxel Size", voer 31 microns in en klik vervolgens twee keer op "OK". Klik op "Calculate Surface Area" om het totale worteloppervlak van het monster in vierkante millimeters te bepalen. Klik daarna op "Calculate Volume" om het totale wortelvolume van het monster in kubieke millimeters te verkrijgen.

Het specimen, bestaande uit twee stengels van het inheemse prairiegras Sporobolus heterolepis en de oorspronkelijke bodem eromheen, wordt hier getoond. De voxelgrootte van de gegenereerde gereconstrueerde gegevens was ongeveer 31 kubieke microns. Na het maken van een stack afbeeldingen en het verhogen van het contrast tussen de wortels en de bodem, bleek uit de gereconstrueerde gegevens dat de wortel en enkele componenten van de bodem zeer vergelijkbare röntgenabsorptiefactoren hebben, wat resulteerde in weinig tot geen grijswaardecontrast in de beelden.

Deze figuur toont een representatief startpunt dat is geselecteerd binnen een relevant wortelsegment dat zichtbaar is in de bovenste plak van de volumedata. Met behulp van de in deze video beschreven RooTrak-parameters heeft RooTrak succesvol de geselecteerde ongeveer 200 plakken volumedata gesegmenteerd, wat overeenkomt met een diepte van 6,2 millimeters. De segmentatie van de wortel wordt ook gedemonstreerd in deze animatie.

Hier werd ImageJ gebruikt om een driehoekig mesh-isovlak van het 3D-volume te genereren op basis van de door RooTrak geproduceerde gegevens. De gebruikte standaardinstellingen resulteerden in een gedetailleerd isovlak binnen een relatief korte tijd. Ten slotte werd met behulp van IMESHJ het oppervlak berekend op 351,87 vierkante millimeter en het berekende volume op 47,27 kubieke millimeter.

Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in vijf uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het toepassen van deze techniek is het belangrijk om alle veiligheidsprocedures te volgen. Daarnaast moet men er rekening mee houden dat wortelsegmentatie alleen mogelijk is als er voldoende röntgencontrast is tussen de wortel en de bodem.

Door deze procedure te volgen, kunnen andere specimens met vertakkingsstructuren, zoals boombladeren, longen van dieren en mensen, enzovoort, worden afgebeeld en geanalyseerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe levende weefsels groeien of hoe ze bepaalde omstandigheden tolereren. Na de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de plantwetenschappen om zaken als droogteresistentie in modelplanten zoals Brachypodium te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een plantspecimen kunt afbeelden met tomografie, hoe u de wortelstructuur kunt visualiseren en hoe u kwantitatieve informatie over de wortel uit X-ray computed tomography-data in de bodem kunt extraheren.

Vergeet niet dat het werken met röntgeninstrumentatie gevaarlijk kan zijn en dat de relevante veiligheidsprocedures gevolgd moeten worden bij het uitvoeren van deze techniek.