Name: Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties in plantencellen monitort met het tabak transient expressiesysteem. Deze methode onthult de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie en helpt onderzoekers bij het begrijpen van celreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) voor het bewerken van het manuscript. Het werk aan BASL-polariteitsvorming wordt ondersteund door subsidies van het U.S. National Institute of General Medical Sciences aan J.D. (R01GM109080) en Rutgers University.

1. Plasmide Bouw <ol><li> Genereren van de constructen door klonering techniek zoals hiervoor beschreven 1,6. <ol><li> Gebruik eerst een high fidelity DNA polymerase met geschikte primers om de coderende sequenties van BASL amplificeren, YDA en MPK6 en subkloon ze in invoer vectoren. Vind de gedetailleerde protocol in 7. </li><li> De dominante negatieve versies van MPK6 en YDA (DNmpk6 8 en DNyda 4 respectievelijk) genereert, gebruikt de datum van plasmiden MPK6 en YDA als template en introduceren puntmutaties door plaatsgerichte mutagenese methode 9. </li></ol></li><li> Om de constructen voor tabak voorbijgaande assays te bouwen, uit te voeren standaard LR (attL x attR recombinatie) reacties (gedetailleerde procedure in 7) naar BASL integreren in pH35CG 10, DNyda en DNmpk6 in pXNGW en pXCGW vectoren 11, respectievelijk. <ol><li> Bevestig de resulterende plasmiden door enzymdigestie en sequencing. Zodra sUccessful, transformeren de binaire constructen in de Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 12 en groeien ze op selectie platen bij 28 ° C gedurende 2-3 dagen. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van Agrobacterium infiltratie Solution <ol><li> Inoculeren enkele vers getransformeerde Agrobacterium kolonies in 10 ml Luria-Bertani (LB) medium met geschikte antibiotica (Gentamycine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml voor pH35CG, pXNGW en pXCGW construeert, dezelfde concentraties gentamycine en kanamycine rifamycine met 50 ug / ml voor P19 (expressie eiwitten tegen transgene silencing) 13. </li><li> Agrobacterium culturen groeien in een 28 ° C schudder bij de snelheid van 200 rpm gedurende ongeveer 16 uur en meet de OD 600 (geschat bereikt 1,5-1,8) (Figuur 2A-B). Spin down het kweken bij 2500 xg gedurende 10 min. Re-schorten en wash de celpellets met 10 mM MgCl2 (infiltratie oplossing). </li><li> Spin down de kweken opnieuw en resuspendeer de pellets met de juiste hoeveelheid van de infiltratie oplossing voor de uiteindelijke OD 600 = 0,5 bereikt (figuur 2C-D). Voordat infiltreren planten, verlaat de cel mengsels bij kamertemperatuur gedurende 1-3 uur. Deze stap helpt naar cel homeostase. </li></ol> 3. Tabak Plant en Leaf Injection <ol><li> Gebruik tabaksplanten (Nicotiana benthamiana), geteeld 4-5 weken oud in een standaard plantengroei kamer (23 ° C met cycli van 16 uur licht / 8 uur donker) 14 voor het blad injectie. Opmerking: In dit stadium tabaksplanten hebben gewoonlijk 6 bladen (2 grote, 2 medium, en 2 kleine). De twee middelgrote bladeren zijn de meest optimale voor blad injectie (de twee grote bedrijven zijn te oud, terwijl de twee kleintjes zijn vaak te jong). </li><li> Voordat de infiltratie dag, water de Tobacco planten om de grond te verzadigen. </li><li> Op de dag infiltratie, pre-incubeer de planten in het donker gedurende 1-3 uur. Deze stap kan huidmondjes in de epidermis mogelijkheden voor toegang, die sterk vergemakkelijkt de Agrobacterium bij het ​​betreden in het blad epidermale cellen. </li><li> Het gebruik van kleur tapes gelabeld met data, de vlag van de bladeren te worden geïnfiltreerd. Markeer de gebieden die moeten worden geïnfiltreerd met een zwarte dikke sharpie (optioneel, het geïnfiltreerde gebieden zijn zichtbaar na besmetting.). </li><li> Neem gelijke volumes van de Agrobacterium re-ophanging en meng ze in een 100 x 15 mm petrischaal door voorzichtig zwenken (figuur 2E). Opmerking: In ons geval, gemengd we 1 ml p19 met 1 ml van de GVB-BASL, 1 ml DNyda-nYFP en 1 ml DNmpk-cYFP. </li><li> In het proces van infiltratie, vult een 3 ml naaldloze spuit met de infiltratie mengsel (1-2 ml) en duwen de onderzijde (abaxiale) van het tabaksblad (figuur 2F). Terwijl infiltreren, is het nuttigop één hand te duwen en de andere hand voorzichtig ondersteunen bovenzijde (adaxial tegen de duwkracht). Opmerking: Als de infiltratie mengsel succes wordt geïnjecteerd, zal de besmette gebieden herkenbaar in de epidermis worden. Echter, de infiltratie mislukken als gevolg van strenge injectie (weefselschade) of onvoldoende push (geen vloeistof penetratie). Voor elke proef stellen we tenminste twee injecties in twee onafhankelijke bladeren (van verschillende planten). </li><li> Plaats de besmette planten terug in de groei kamer. In het algemeen, eiwitexpressies detecteerbaar na 48 uur na infiltratie. </li></ol> 4. Confocale Imaging <ol><li> Op 48 uur na infiltratie, gebruik maken van een perforator om een blad schijf te snijden uit het geïnjecteerde gebied (normaal 3-4 disks / gebied kan worden geproduceerd) (figuur 2G). Gebruik een pincet om het blad schijven voorzichtig over te dragen aan een dia (de abaxiale naar boven) en monteer ze met water druppels. Druk niet te hard op de cover slip omdat geperst / beschadigde cellen zal niet goed zien onder de confocale microscoop (figuur 2H). </li><li> Voordat confocale imaging, scannen de gemonteerde samples op een epi-fluorescente samengestelde microscoop om de expressie te controleren. Opmerking: Op basis van onze ervaring, zijn de cellen die tussenliggende expressie tonen het best vertegenwoordigd onder de confocale microscoop. </li><li> Begin met de 40X (NA 1,3) lens op een confocale microscoop. Stel de slede in de gewenste positie, zodat de cellen die middelmatige concentraties van fluorescente eiwit in het midden blijven. De excitatie / emissie spectra voor GVB en YFP zijn 458 nm / 480-500 nm en 514 nm / 520-540 nm, respectievelijk. </li><li> Activeer de &quot;Live&quot; knop om een ​​voorbeeld van de afbeeldingen aan te passen dan laser intensiteit en slimme winst voor de meest evenwichtige fluorescentie-intensiteit / ruisverhouding. Om beeldkwaliteit te verbeteren, verhogen scannen pixels en / of frame / lijn gemiddelde. Ten slotte past u de focus knop om reach de mediaan focal plane en klik op &quot;Capture&quot; om het beeld te nemen. Opmerking: Het GVB en YFP afbeeldingen kunnen na elkaar of gelijktijdig worden gevangen door te controleren of uitschakelen van de optie van de &quot;sequentiële&quot; scanning mode, respectievelijk. </li><li> Wanneer Z-projectie gewenst is de gedetailleerde weergave van de cellen, selecteer &quot;xyz&quot; imaging mode, bepalen de diepte van het scanbereik (10-15 urn) en laat de beelden van de top naar de bodem van de doelcel . Compileren van de verkregen beelden met de Leica software door rechts te klikken op de opname te selecteren &quot;hernoemen&quot; en afbeeldingen exporteren als tiff-bestanden. </li><li> Afbeelding 30-40 cellen kwantificatieanalyse. </li></ol> 5. Beeldverwerking en kwantificering Analyse <ol><li> Gebruik Fiji software (http://fiji.sc/Fiji) om beelden te verwerken en uit te voeren kwantificering. <ol><li> Plot van de fluorescentie-intensiteit grafieken. <ol><li> Om beter te visualiseren of de CFP / YFP expressiegelijkmatig verdeeld, gebruiken Fiji om de signaalsterkte van het GVB en YFP tonen langs de cel periferie. Om dit te bereiken, eerste lancering Fiji selecteer &quot;File&quot; en &quot;Open&quot; om het beeld te starten. Klik op &quot;lijn&quot; op het gereedschap menu en selecteer &quot;gesegmenteerde lijn&quot; door rechts te klikken. Beslis het gebied van belang en trek een lijn langs de cel periferie naar het GVB of de YFP signaal (figuur 3A-C) op te sporen. Opmerking: Fiji meet de absolute fluorescentie-intensiteit waarde langs de gesegmenteerde lijnen. </li><li> Selecteer de drop-down menu &quot;Analyseren&quot; en &quot;Plot Profile&quot; om een ​​grafiek met de positie en de intensiteit waarden die de niveaus van CFP / YFP langs de gesegmenteerde lijn vertegenwoordigen genereren. Indien gewenst, dupliceren de intensiteit waarden (door het selecteren van het menu &quot;Copy&quot;) in Excel of andere grafische software om vergelijkbare intensiteit grafieken te genereren. </li></ol></li><li> Kwantificeren polariteit graad. <ol><li> Verzamel ongeveer 20 vertegenwoordiger cellen uit 3 repliceren experimenten om de polariteit mate van GVB en YFP in tabak cellen te evalueren. Bereken de polariteit mate gebaseerd op de verhouding van de hoge fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als H) via lage fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als L). Opmerking: De kwantificering methode is toegelicht in figuur 3. <ol><li> Om de H en L-waarden te meten, trek een gesegmenteerde lijn langs de betrokken regio aan de cel periferie (hierboven beschreven), klikt u op &quot;Analyseer&quot; uit het drop-down menu, en selecteer &quot;Meten&quot;. Als er een venster &quot;Results&quot; verschijnt, gebruik &quot;Mean&quot; waarden kwantificering uit te voeren. </li><li> Van de cellen die relatief uniforme expressie van CFP en YFP, bijvoorbeeld CFP-BASL (Figuur 3A) of YFP aangevuld door co-expressie van DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP (figuur 3B), verkrijgen de H en L waarden door meting twee willekeurig gekozen omtrekssegmenten met gelijke lengte. </li> &lt;li&gt; Van de cellen vertonen duidelijke polaire ophoping van fluorescerende eiwitten, in dit geval, de co-expressie van de GVB-BASL, DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP (figuur 3C), het verzamelen van de H-waarden uit de perifere regio&#39;s met verrijkte fluorescentiesignalen en de Ls uit de regio&#39;s met een lage / no fluorescentie accumulatie. </li><li> Verzamel de resulterende verhouding van H / L van 20 cellen elkaar en test voor normale verdeling. Bereken de p-waarden van t-test van de Student&#39;s (voor de normale verdeling) of de Kolmogorov-Smirnov (KS) -test (voor niet-normale verdeling). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li>
<li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li>
<li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway%28R%29+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4(2008).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther%2C+inflorescence%2C+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+Arabidopsis+plants%3A+growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).</li>
<li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li>
<li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li>
<li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCTOPUS%2C+a+polarly+localised+membrane-associated+protein%2C+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li>
<li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Algemeen gebruik en mogelijke wijzigingen van de tabak Transient Expression System Signaaltransductie: Overexpressie van fluorescerend eiwit (FP) gemerkte eiwitten in de tabak epidermis met succes gebruikt voor het snel onderzoeken van eiwit subcellulaire lokalisatie in plantencellen. Echter, het bestuderen van dynamische signalisatie verdeling van eiwit complex in planta is een uitdagend onderwerp te ingewikkeld subcellulaire contexten, voorbijgaande eiwit-eiwit interacties en signaaltransduct...

Eiwitten interageren in een complex hiërarchisch netwerk en complexen vormen die een centrale rol in bijna alle biologische processen in een onvoorspelbare cellulaire omgeving spelen. Echter, van plantontwikkeling tot groeiresponsen, is er een gebrek aan handige hulpmiddelen die niet alleen snel maar ook efficiënt deze dynamische signaleringsgebeurtenissen op subcellulair niveau identificeren en controleren zijn. De tijdelijke eiwitexpressie systeem tabaksblad epidermis heeft aantrekkelijke voordelen visualiseren fluorescerende eiwitten in levende cellen. Dit systeem biedt semi- in vivo omstandigheden die post-translationele eiwit modificatie en snelle behandeling van eiwit lokalisatie mogelijk te maken. Aangevuld door onderzoek van de YFP signaal, de bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) test stelt de mogelijkheid van eiwit-eiwit interacties in plantencellen. In vergelijking met andere methoden, bijvoorbeeld gist-twee-hybride (Y2H) en co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC ook een krachtig middel visualiseren compartimenten waarin eiwit-eiwit interacties kunnen plaatsvinden op subcellulair niveau. Omdat asymmetrische celdeling (ACD) handhaaft stamcelpopulatie terwijl het genereren van nieuwe celtypen te vormen weefsel / orgaan is onontbeerlijk voor het bevorderen eukaryote multicellulariteit. Arabidopsis stomatale ontwikkeling is gebruikt als een modelsysteem voor het bestuderen ACD in planten. De voorlopercel, meristemoid moedercel, verdeelt asymmetrisch twee dochtercellen te produceren, een meristemoid (ondergaat stamcel-achtige verdelingen vóór beëindiging in een paar sluitcellen) en een stomatale lijn gemalen cel (SLGC) (kan verdelen en differentiëren tot trottoir cel), respectievelijk (figuur 1). In stomatale ACD, wordt het nieuwe eiwit Breaking van asymmetrie in de huidmondjes Lineage (BASL) premitotically gepolariseerd om verdeeldheid asymmetrie te rijden, die include fysieke asymmetrie en het lot van de cel asymmetrie 1. Een MAPK cascade bestaat uit de MAPKKK YODA en de MAPKs, MPK3 en 6 is centraal voor stomataire divisie patronen en het lot goedkeuring 2,3, 4,5. Onlangs, Zhang et al. koppelde de polariteit eiwit BASL de YDA-MAPK signaalroute in Arabidopsis stomatale ACD 6. De canonieke YODA-MAPK pathway, door middel van MPK3 / 6, fosforyleert BASL en activeert de polarisatie. Gefosforyleerd BASL fungeert als een scaffold en rekruteert YODA (YDA) en MPK3 / 6 aan een eiwit te vormen en concentreren de signalering bij de cel cortex 6. Polarisatie van de MAPK componenten en de positieve feedback loop tussen BASL en de YDA-MAPK pathway vertegenwoordigt een nieuw mechanisme voor eiwit polarisatie in plantencellen. Lokaal verrijkt MAPK signalering wordt verondersteld nauw worden gekoppeld aan lot van de cel differentiatie in stomataire ACD 6 (figuur 1). Een van de key experimentele gegevens dat dit model ondersteund kwam van de tabak assays die de ruimtelijke verdeling van MAPK&#39;s geïnduceerd door de expressie van BASL 6 aangetoond. In het algemeen is het niet gemakkelijk te controleren wanneer MAPK signalering gebeurt omdat MAPK moleculen vaak opwekken werden gevonden in een cel. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de split-YFP systeem om de interactie te visualiseren tussen het stroomopwaartse kinase en downstream degenen te stellen wanneer de signalering relais optreedt. We verder uitgebreid het gebruik van het systeem BiFC door co-expressie een derde eiwit (CFP-tag) met de splitsing YFP paar (suggestief voor eiwit-eiwit interactie) te visualiseren of en hoe de aangevuld YFP ruimtelijk kan worden gemoduleerd door gelijktijdige uitgedrukt GVB eiwit. Door dit te doen, hebben we aangetoond dat co-expressie van de GVB-BASL geïnduceerde ruimtelijke reorganisatie van de interacties tussen YDA en MPK6, van gelijkmatige verdeling naar gepolariseerd patroonvorming in de cel cortex van de tabak EpiDermAl cellen. Dit systeem heeft daardoor de kansen worden ontwikkeld om toezicht dynamische signaleringsgebeurtenissen in plantencellen onder omstandigheden wanneer de cellen uitgedaagd door interne of externe stimuli (bijvoorbeeld co-expressie van andere eiwitten, chemische toepassing pathogeen aanval of omgevingsveranderingen, enz. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slide</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Cover glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica&nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite software</td></tr><tr><td>40X objective lens</td><td>Leica</td><td>HCX&nbsp;Plan APO&nbsp;</td><td>HCX&nbsp;Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Canemco &amp; Marivac</td><td>205EQA-Spec</td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming ruimtelijke reorganisatie van een mapk signaalroute met behulp van de tabak transient expression system

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualisatie dynamische signaleringsgebeurtenissen in levende cellen is een uitdaging. Breidden we een gevestigde transiënte expressie systeem, de biomoleculaire fluorescerende complementatie (BiFC) test in tabak epidermale cellen, uit het testen van eiwit-eiwit interacties aan het toezicht op de ruimtelijke verdeling van de signaaltransductie in plantencellen. In dit protocol, gebruikten we de BiFC test laten zien dat de interactie en de signalering tussen de Arabidopsis MAPKKK YODA en MAPK6 optreden op de plasmamembraan. Wanneer de scaffold eiwit BASL werd co-expressie, de YODA-MAPK interactie herverdeeld en ruimtelijk co-gepolariseerde van de GVB-BASL. Deze gemodificeerde tabak expressiesysteem maakt een snelle behandeling van signalering lokalisatie en dynamische veranderingen (minder dan 4 dagen) en is geschikt voor meerdere fluorescerende proteïne kleuren (ten minste drie). We hebben ook gepresenteerd gedetailleerde methodes om eiwit distributie (asymmetrische ruimtelijke lokalisatie, of &quot;polarisatie&quot; te kwantificeren;) In tabakscellen. Dit geavanceerde tabak uitdrukking systeem heeft het potentieel om op grote schaal worden gebruikt voor het snel testen van dynamische signalisatie gebeurtenissen in levende plantencellen.

Celdood geïnduceerd door de hyperactieve MAPK signalering te voorkomen, werden de kinase inactieve versies van YDA (DNyda) en MPK6 (DNmpk6) van de co-expressie assay tabakscellen. Noch de interactie tussen DNyda en DNmpk6 onthuld door BiFC noch GVB-BASL zelf gegenereerde ongelijke verdeling patroon (figuur 3A-B). Wanneer echter CFP-BASL werd in de DNyda-DNmpk6 interactie pair, zowel CFP en YFP signalen werden herverdeeld om een sterk gepolariseerde wijze (Figuur ...

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische ruimtelijke distributie van eiwit te visualiseren

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

De segmentatieklok stuurt oscillerende genexpressie aan in het presomische mesoderm (PSM). Dynamische Notch-activiteit is de sleutel tot dit proces. We gebruiken beeldvorming en computationele analyses om temporele dynamica uit ruimtelijke expressiegegevens te extraheren om aan te tonen dat Delta-ligand en Notch-receptorexpressie oscilleren in het PSM van gewervelde dieren.

Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties in plantencellen monitort met het tabak transient expressiesysteem. Deze methode onthult de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie en helpt onderzoekers bij het begrijpen van celreacties.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Meer video's verkennen