Name: analyseren In Vivo Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer celmigratie-analyse in vivo met celtransplantatie en time-lapse imaging in zebravis-embryo's. Deze methode onderzoekt genfunctie in ontwikkelingsbiologie en creëert mozaïekembryo's voor optimale beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken F. Bouallague en de IBENS-dierenfaciliteit voor uitstekende zorg voor zebravissen. Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door de Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, subsidies N° SFI20111203770 en N° PJA 20131200143.

Opmerking: Figuur 1 toont de omtrek van het protocol. 1. Voorbereiding van de naalden voor injectie en transplantatie Opmerking: Naalden kunnen worden bereid op elk gewenst moment en opgeslagen. Houd ze in een petrischaal, op een band van boetseerklei. Sluit de schotel met parafilm om te beschermen tegen stof. <ol><li> Voor injectienaalden, trek een glazen capillaire (buitendiameter 1,0 mm, inwendige diameter 0,58 mm, zonder draad (zie lijst van Materials)) met een micropipet trekker (zie de lijst van materialen). Liever korte en dunne naalden (taps deel van ongeveer 5 mm) en zij efficiënter voor het doorboren van het chorion. Opmerking: De injectienaalden voor eenmalig gebruik. </li><li> Naald voor Cell Transplantation <ol><li> Trek een glazen capillaire (buitendiameter 1,0 mm, inwendige diameter 0,78 mm, zonder draad (zie lijst van Materials)) met een micropipet trekker. </li><li> Uzing een microforge (zie lijst van materialen), snijd de punt van de naald op het punt waar de binnendiameter is 35 urn (iets meer dan de diameter van de cellen te transplanteren). </li><li> Bevel de cut uiteinde van de capillair met een microgrinder (zie de lijst van materialen) met een hoek van 45 °. </li><li> Optioneel, trek een weerhaak aan het uiteinde van de naald met behulp van een microforge. Voor dit, raakt u de hete filament met de punt van de schuine en snel weg te trekken, het creëren van een weerhaak die kan helpen bij het penetreren van de embryo. </li><li> Monteer de naald op een naaldhouder bevestigd aan een spuit. Gebruik van de spuit, spoel de binnenkant van de naald driemaal met 2% fluorwaterstofzuur aan glas residuen weg en spoel drie keer met aceton. Let op: fluorwaterstofzuur is giftig, manipuleren onder de motorkap, met handschoenen. Opmerking: De celtransplantatie naalden kan meerdere malen worden gebruikt. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van deGerechten voor injectie en Cell Transplantation <ol><li> Verhit 50 ml embryo medium 11 bevattende 0,5 g agarose in een magnetron gedurende 1 min bij vol vermogen tot 1% agarose krijgen in embryo medium. Koel de agarosegel tot ongeveer 60 ° C en giet 50 ml in een 90 mm petrischaal. Plaats op het oppervlak van de gel een speciaal ontworpen matrijs (zie lijst materiaal), ofwel met lijnen voor de injectie schaal of putjes voor celtransplantatie schotel. <ol><li> Houd rekening met de schimmel drijven op de agarose, als de agarose niet te warm is. Nadat de agarosegel wordt ingesteld, verwijder de mal met een pincet (Figuur 2A - B). Opmerking: schotels kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C, tot een paar weken. Houd ze in een gesloten natte doos, om te voorkomen dat ze uitdrogen. </li></ol></li><li> Plaats de schotel in een 28 ° C incubator 30 min vóór gebruik. </li></ol> 3. Het verzamelen van embryo&#39;s en Injection <ol><li> Injection Solution Voorbereiding Opmerking: actine-bindend domeinvan de gist actine bindend eiwit 140 (ABP-140), zoals Lifeact gebonden aan mCherry (hierna ABP140-mCherry) wordt gebruikt om gepolymeriseerd actine te visualiseren in de cel, zodat de stuwende werking te analyseren. Voeg een verbinding om de functie van een kandidaat-gen (bijvoorbeeld mRNA van dominant negatieve of constitutief actieve construct of morfolino oligonucleotiden) testen. De functies van sin1 beoordeelt beschreven in de resultaten (figuur 3), gebruikten we morfolino oligonucleotiden. Als controle gebruikten we een morfolino identiek aan de sin1 morfolino maar 5 nucleotiden verdeeld over de sequentie zodat dit besturingselement morfolino niet overeenkomt met het doel-RNA. <ol><li> Dooi sin1 en 5-mismatch controle morpholinos (2 mM stock oplossingen), en ABP140-mCherry mRNA op ijs. Voeg 375 ng mRNA (75 ng / ul eind) en 0,75 gl ofwel sin1 of 5-mismatch control morfolino (0,3 mM eind) in Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6) tot een totaal volume van 5 pl te bereiken. </li></ol></li><li> embryo Collection Let op: voor deze experimentele opstelling zowel donor en gastheer embryo&#39;s transgeen, de uiting van de GFP onder de controle van de Goosecoid (SGR) promotor om de aspirant-prechordale plaat 11 te visualiseren. <ol><li> Verzamel Tg (GSC: GFP) eieren. Plaats ongeveer 80 eieren in een 90 mm petrischaal gevuld met embryo medium en incubeer bij 28 ° C. </li></ol></li><li> Injecteren Donor Embryo&#39;s <ol><li> Onder een stereomicroscoop, knijp verzamelde embryo met een pincet in de lijnen van een injectie schotel gevuld met embryo medium. Behulp van een tang, oriënteren de embryo met de cellen naar boven. Plaats de injectie schaal in de incubator bij 28 ° C totdat het embryo de 4-cellig stadium (1 uur na de bevruchting) bereikt. </li><li> Plaats een injectienaald met 2 plinjectieoplossing. Steek de naald in een naaldhouder (zie de lijst van materialen), dat is geplaatst in een micro-manipulator (zie lijst van materialen) en verbonden met polytetrafluorethyleen (PTFE) buis (zie lijst van Materialen) naar een lucht Transjector (zie lijst van materialen ). </li><li> Open het capillair door voorzichtig de tip met fijne tang aan te raken. Indien nodig, knip de capillaire geopend door knijpen zijn uiteinde. </li><li> Voer een van de vier cellen met de naald en spuit de oplossing in de cel om 70% van het celvolume (2 nl) vullen. Injecteer 30 embryo. Opmerking: Aan de naald in de cel kan moeilijk zijn, omdat de plasmamembraan zacht. Gericht op de kruising tussen de cel en de dooier vergemakkelijkt naald penetratie. </li><li> Plaats de embryo&#39;s in de 28 ° C incubator totdat ze de sfeer fase (4 uur na de bevruchting) hebben bereikt. </li></ol></li></ol> 4. Voorbereiding van de embryo&#39;s voor de Cell Transplantation <ol><li> Bereid 20 ml van embryo medium met 200 ul penicilline / streptomycine (zie de lijst van materialen) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation van de embryo&#39;s in de sfeer fase (4 uur na de bevruchting) Opmerking: Dechorionated embryo&#39;s zijn erg kwetsbaar en zal exploderen in geval van contact met lucht of plastic. Ze moeten dus in-agarose gecoate gerechten te worden geplaatst, en overgebracht met vuur gepolijst glas Pasteur pipetten. <ol><li> Met behulp van een plastic Pasteur pipet gastheer embryo&#39;s bij stap 3.2 en donor embryo geïnjecteerd bij stap 3.3 in twee 35 mm Petrischalen bekleed met 1% agarose in embryo medium en gevuld met Pen / Strep EM. Houd gastheer embryo&#39;s en donor embryo&#39;s in twee afzonderlijke schotels. </li><li> Handmatig uit te pakken de embryo&#39;s uit hun chorions met fijne pincet (zie de lijst van materialen). </li><li> Plaats de embryo&#39;s in de 28 ° C incubator totdat ze het schild podium (6 uur na de bevruchting) hebben bereikt. </li></ol></li></ol>5. Cell Transplantation <ol><li> Schik de embryo&#39;s voor de celtransplantatie. <ol><li> Onder een tl-stereomicroscoop, selecteert donor embryo&#39;s uitdrukken ABP140-mCherry (rood) binnen het schild (groen). </li><li> Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet, overdracht van de embryo&#39;s in de putjes van de celtransplantatie schotel gevuld met Pen / Strep EM. Plaats de ontvangende embryo&#39;s in een rij en de donor embryo in de naburige rij. </li><li> Met een wimpers voorzichtig oriënteren de embryo&#39;s met de afscherming omhoog. Opmerking: de positie van de afscherming kan worden bepaald door GFP expressie of anatomisch. </li></ol></li><li> Transplantatie System Set-up. Opmerking: De transplantatie systeem bestaat uit een naaldhouder (zie de lijst van materialen) die verband houden met PTFE-buis (zie de lijst van materialen) en een tube connector (zie de lijst van Materialen) om een Hamilton spuit uitgerust met een micro-drive (zie lijst of Materials). De naaldhouderis gemonteerd op een 3-way micromanipulator (zie lijst van Materials). <ol><li> Met behulp van een naaldhouder bevestigd aan een spuit, spoel de naald voor celtransplantatie met 70% ethanol. Drogen door zuigen lucht in de naald. Droog geen door te blazen, omdat dit kan resulteren in stof vast komen te zitten in het taps toelopende deel van de naald. </li><li> Steek de naald in de naaldhouder verbonden met de Hamilton spuit met de schuine naar boven. </li></ol></li><li> Shield-to-shield Cell Transplantation <ol><li> Voer het schild van een donor embryo met de transplantatie naald en stelt ongeveer 10-20 cellen gelabeld met ABP140-mCherry. vermijd zorgvuldig tekenen dooier. </li><li> Transplant de cellen in het schild van de ontvangende embryo. Herhaal dit totdat alle gastheer embryo&#39;s zijn getransplanteerd. </li><li> Verwijder eventuele beschadigde embryo&#39;s met een brand-gepolijste Pasteur pipet. Plaats de getransplanteerde embryo&#39;s in de incubator bij 28 ° C en laat ze herstellen gedurende ongeveer 30 minuten. </li><li> Met behulp van een naaldhouder bevestigd aan een spuit, spoel de celtransplantatie naald met water en plaats het terug in een petrischaal op een band van boetseerklei. Sluit de schotel met parafilm. </li></ol></li></ol> 6. (Optioneel) Single Cell Transplantation Opmerking: In het embryo cellen hechten aan elkaar, zodat het moeilijk is om slechts één cel transplantatie naald trekken. We ontwikkelden een aangepaste protocol om gemakkelijk te transplanteren enkele prechordale plaat voorlopercellen. Het idee is om cellen te scheiden voorafgaand aan de transplantatie. Omdat geïsoleerde prechordale plaat stamcellen hebben de neiging om hun identiteit te verliezen, we genetisch opleggen daarvan een prospectieve prechordale plaat identiteit, door het activeren van de Nodal signaleringsroute, in afwezigheid van de Sox32 transcriptiefactor. We hebben vastgesteld dat deze geïnduceerde cellen zich gedragen als endogeen prechordale plaat voorlopercellen 8. Hieronder vindt u de specifieke stappen om enkele cel transplantaties uit te voeren. cel dissociatietie wordt bereikt door embryo in calcium-free Ringer 11, ontleden een explantaat en mechanisch roeren. <ol><li> Bij stap 2.1, de voorbereiding van de transplantatie schotel met 1% agarose in Calcium-vrij Ringer plaats van Embryo Medium. </li><li> In stap 3,1, naast ABP140-mCherry RNA en sin1 morfolino, voeg 3 ng RNA dat codeert voor de actieve vorm van de Nodal receptor Taram-A (0,6 ng / pl def) en 1,25 gl morfolino tegen sox32 (voorraadoplossing bij 2 mM, vandaar 0,5 mM definitief). </li><li> Na stap 4, de overdracht drie geselecteerde donor embryo&#39;s in de schotel voor celtransplantatie gevuld met Pen / Strep Calcium-vrije Ringer met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet. Met fijne pincet, ontleden een explantaat met de geïnjecteerde cellen (ABP140-mCherry gelabelde cellen). Snel gooi de rest van de embryo&#39;s. </li><li> Met een wimper, roer voorzichtig de explantatie tot cellen distantiëren. </li><li> Het opstellen van een enkele geïsoleerde cel in de transplantatie naalden transplantatie het in het schild van een gastheer embryo. </li><li> Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet de embryo&#39;s in een met agarose gecoate schaal gevuld met Pen / Strep EM. Plaats de embryo&#39;s in de incubator bij 28 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol> 7. Embryo Montage <ol><li> Imaging Chamber <ol><li> Methode 1: gebruik een imaging kamer bestaat uit een plastic dia (75 * 25 * 0,5 mm) doorboord met 4 gaten (5,5 mm diameter), met 3 mm hoge randen aan de ene kant (figuur 2C - D). Lijm een ​​glazen dekglaasje aan de achterzijde, met cyanoacrylaatlijm (superlijm). Let op: Aan het einde van het experiment, zet de kamer in het water voor een nacht aan het dekglaasje te verwijderen en zich te ontdoen van de lijmresten met schuurpapier. </li><li> Methode 2: Gebruik 35 mm MatTek glazen bodem gerechten (zie de lijst van materialen) met een 10 mm gat. </li></ol></li><li> embryo Montage <ol><li> Vul een glazen flacon met 1 ml warm 0,2% agarose in embryo medium.Bewaren bij 42 ° C in een warmte-blok. </li><li> Onder de fluorescerende stereomicroscoop, selecteer een embryo waarin rood getransplanteerde cellen maken deel uit van de aspirant-prechordale plaat gelabeld in groen (dwz rode getransplanteerde cellen zijn binnen de groene prospectieve prechordale plaat, en zijn begonnen met het migreren naar het dier pool). </li><li> Transfer een geselecteerde embryo in de agarose-oplossing met een brand-gepolijste Pasteur pipet. Gooi het overtollige embryo medium uit de pipet. Teken de embryo in de pipet met agarose, en overdracht van de embryo in de beeldvorming kamer, het aanbrengen van een druppel agarose. Voordat agarose is ingesteld, oriënteren het embryo met een wimper. Plaats de potentiële prechordale plaat omhoog voor beeldvorming met een rechtopstaande microscoop of op de glazen bodem voor beeldvorming met een omgekeerde microscoop. Wacht tot de agarose is ingesteld (ongeveer 1 min, afhankelijk van de kamertemperatuur) Voor montage een embryo in het volgende putje van de kamer. Let op: een beeldvormende chamber met 4 putten laat montage tot 4 embryo&#39;s. </li><li> Wanneer de agar is ingesteld, vult de kamer met Pen / Strep EM om uitdroging te voorkomen. </li></ol></li></ol> 8. Live-Imaging <ol><li> Gebruik een 40X water-immersie lange afstand lens. Gebruik de juiste filter sets op de foto om GFP en mCherry (voor GFP: excitatie BP 470/40, beam splitter FT 510, en emissie BP 540/50, want mCherry: excitatie BP 578/21, beam splitter FT 596, en emissie LP 641 / 75). Pas de blootstellingsduur om afbeeldingen dynamiek te optimaliseren. </li><li> Om beeld alle cellen in de plaat verwerven z-stacks vanaf enkele urn boven de potentiële prechordale plaat (in het ectoderm) en eindigend enkele urn onder de toekomstige prechordale plaat (in de dooier). Gebruik een z-stap van 2 urn. Om overname snelheid te optimaliseren, schakelen kleuren tussen de z-stacks in plaats van tussen frames. Opmerking: Dit kan leiden tot kleine verschillen tussen de groene en rode afbeeldingen, maar is geen probleem want geen precieze co-localization tussen de groene en rode signalen vereist. Verder beeldvormingstijd en blootstelling aan licht, groen worden slechts eens 5 tijdstippen, die voldoende is om prechordale plaat voorlopercellen identificeren verkregen. </li><li> Het gebruik van dergelijke instellingen, stock maximaal 4 embryo binnen twee minuten tijdsinterval dat nodig is om uitsteeksel frequentie en oriëntatie analyseren. Voor de analyse van uitsteeksel leven, te verminderen tijdsinterval tot 30 sec om hogere tijdsresolutie te krijgen. Afbeelding van 60% tot 80% epiboly epiboly. </li></ol> 9. Cell Dynamics Analyse <ol><li> Laad 4D afbeeldingen in ImageJ Opmerking: Afhankelijk van de gebruikte software voor de verwerving, worden de beelden opgeslagen in verschillende formaten (één bestand per beeld, een bestand per z-stack, een bestand voor het hele experiment). Sommige ImageJ Plugins zijn online beschikbaar voor 4D stapels te openen. Onze gegevens worden opgeslagen als een bestand per z-stack. Omdat de dataset groot kan zijn, kan het geschikt zijn om slechts een deel ervan (sommige tim openene punten, of een subdeel van de z-stack, of 8-bit omgezet beelden ...). We maken gebruik van een op maat gemaakte ImageJ plugin om dit te doen, die we graag verspreiden op aanvraag zou zijn. </li><li> Analyse van de oriëntatie en de frequentie van de Cel Uitsteeksels <ol><li> Gebruik GFP beelden naar de belangrijkste richting van de potentiële prechordale plaat migratie te bepalen. Neem dit als referentie voor de cel uitsteeksels hoek metingen. Draai de stapel, zodat deze referentierichting parallel aan een zijde van het beeld. </li><li> Volg een cel. Kies een hoek tool. Voor elk frame en elk uitsteeksel, gebruikt de hoek hulpmiddel om de hoek tussen het uitsteeksel en de referentierichting (figuur 3A) te meten. Gebruik de Analyseer / Meet commando om de waarde (of druk op M op het toetsenbord) op te slaan. Sla de resultaten als een txt-bestand. Herhaal dit met de volgende cel. </li><li> Importeer de gegevens in R en plot hoek zoals histogrammen. Gebruik de Kolmogorov-Smirnov-test (ks.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken. Opmerking: De hoek hulpmiddel biedt waarden tussen 0 ° en 180 °, waardoor het gebruik van klassieke statistische tests en niet cirkelvormig testen. </li><li> Met deze dataset berekenen zendfrequentie als het aantal uitsteeksels per cel per minuut. Gebruik Student T-toets (t.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken. </li></ol></li><li> Analyse van de Cel Uitsteeksels Lifetime <ol><li> Voor elke cel en elk uitsteeksel, te meten uitsteeksel duur (aantal frames waarin het uitsteeksel aanwezig x tijd-interval tussen de frames). </li><li> Importeer de gegevens in R. Met Student T-toets (t.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken. Opmerking: Other migratiefuncties kan interessant zijn om te analyseren om de celmigratie te karakteriseren. Deze omvatten cel tracks, voor snelheid, richting en volharding metingen of celmorfologie. Sommige commerciële software-applicaties beschikbaar zijn om deze functies te meten, maar een groot aantal open-source software toepaskationen en ImageJ plugins zijn ook beschikbaar, zoals bijvoorbeeld aanpassen aan morfodynamica 12 te analyseren, Diper te kijken naar mobiele trajecten en directionele doorzettingsvermogen 13, CellTrack naar cel grenzen te volgen tijdens de migratie 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+A+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model.</a> Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Dang, I., Gorelik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Dumortier, J. G., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TORC2+Component%2C+Sin1%2C+Controls+Migration+of+Anterior+Mesendoderm+during+Zebrafish+Gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation.</a> Plos One. 10, e0118474(2015).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+things%3A+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li>
<li>Ulrich, F., Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slb%2FWnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li>
<li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).</li>
<li>Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+patterns+the+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling patterns the organizer.</a> Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , (2000).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li>
<li>Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTrack%3A+An+open-source+software+for+cell+tracking+and+motility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis.</a> Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).</li>
<li>Tahinci, E., Symes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+Rho+and+Rac+are+required+for+convergent+extension+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation.</a> Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).</li>
<li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li>
<li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol geeft een eenvoudige manier om de rol van een kandidaatgen in celmigratie in vivo te bestuderen, door het combineren van het creëren van chimere embryo gebruik celtransplantatie live imaging. Oprichting van mozaïek embryo Het bestuderen van de dynamica van een cel moet het visualiseren van de contour cytoplasmische extensies analyseren. Dit kan worden bereikt door het merken van geïsoleerde cellen in een anders ongemerkt - of verschillend ge...

In multicellulaire organismen, celmigratie van essentieel belang is voor de ontwikkeling van het embryo, waar het zorgt voor het complex van cellen in weefsels en organen, en volwassen leven, waar het deelneemt aan weefsel homeostase (bloedstolling) en immuniteit. Naast deze fysiologische functies, celmigratie is ook betrokken in verschillende pathologische situaties, waaronder met name kanker metastase. Cel migratie is geanalyseerd in vitro voor tientallen jaren, het verstrekken van een globaal inzicht in de moleculaire mechanismen die zorgen cel bewegingen op een vlakke ondergrond. In vivo echter cellen worden geconfronteerd met een meer complexe omgeving. Er wordt duidelijk verscheen in de afgelopen jaren dat migratie in een organisme kan worden beïnvloed door externe stimuli zoals de extracellulaire matrix, buurcellen of uitgescheiden chemokinen geleiden migratie, en dat de mechanismen achter celmigratie kunnen per hetgeen beschreven &lt;em&gt; In vitro 1,2. De mechanismen die zorgen voor in vivo celmigratie hebben minder aandacht gekregen tot nu toe, vooral als gevolg van de toegenomen technische moeilijkheid, vergeleken met in vitro studies. In vivo analyse van celmigratie in het bijzonder directe optische toegang tot migrerende cellen vereist, technieken om unieke cellen in labelen teneinde de dynamiek en morfologie, alsmede winst of verlies van functie te zien zal de rol van kandidaatgenen testen. Tot dusver zijn slechts enkele modelsystemen harboring deze code gebruikt te ontleden in vivo celmigratie 3. Onlangs hebben we gebruikten de migratie van de potentiële prechordale plaat vroege zebravisembryo&#39;s als een nieuw geschikt modelsysteem om de functie van kandidaatgenen beoordelen regelen in vivo celmigratie 4,5. Prospectieve prechordale plaat (ook bekend als anterior mesendoderm) is een groep cellen vormen bij het begin van Gastrulation aan de rugzijde van het embryo. Tijdens gastrulatie deze groep migreert gezamenlijk de richting van het dier pool van de embryo 6-8, aan de prechordale plaat, een mesendodermal verdikking, juist voor de notochord te vormen, en die ten grondslag liggen aan de neurale plaat. Het voorste deel van de plaat prechordale geven aanleiding tot de broedeieren klier geven, terwijl de achterste delen die bijdraagt ​​aan mesoderm 9 head. Dankzij de buitenlandse ontwikkeling en optische helderheid van het vis embryo, kunnen celmigratie direct en gemakkelijk worden waargenomen in deze structuur. Celtransplantatie is een zeer krachtige techniek die zorgt voor de snelle en gemakkelijke creatie mozaïek embryo 10. Het uiten van fluorescerende cytoskelet markers in getransplanteerde cellen resulteert in de etikettering van geïsoleerde cellen, de morfologie en de dynamiek van die gemakkelijk kan worden waargenomen. De combinatie van dit verlies of winst van de functie benadert toelaat de analyse van cel-autonome functies van een blikjedaat-gen. De gepresenteerde protocol beschrijft hoe wij de functie van de component TORC2 sin1 geëvalueerd beheersen celmigratie actine dynamiek in vivo 5. Maar, zoals vermeld in de resultaten en verder besproken, kan worden gebruikt om de mogelijke betrokkenheid van elke kandidaatgen analyseren beheersen celmigratie in vivo.

<table><tbody><tr><td>Glas capillairen (buitendiameter 1,0 mm, binnendiameter 0,58&nbsp;mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>standaard dikte</td></tr><tr><td>Glas capillairen (buitendiameter 1,0 mm, binnendiameter 0,78 mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>dunwandig</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp;000&nbsp;eenheden penicilline en 10&nbsp;mg streptomycine per ml</td></tr><tr><td>fijne pincetten</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>glazen bodemschotels</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Luchtinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-smeedwerktuig</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromolen</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (voor injectie)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (voor celtransplantatie)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton-spuit</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-trekker</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantatievorm</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Buisconnector</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-buis</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analyseren<em&gt; in vivo</em&gt; cell migratie behulp cell transplantaties en time-lapse imaging in zebravis embryo&#39;s

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Celmigratie is essentieel voor veel fysiologische en pathologische toestanden, inclusief kankermetastase. De cellulaire en moleculaire basis van celmigratie is grondig geanalyseerd in vitro. Echter, in vivo celmigratie verschilt op de een of andere manier van in vitro migratie, en is moeilijker te analyseren, omdat het minder toegankelijk is voor directe observatie en manipulatie. Dit protocol gebruikt de migratie van de prospectieve prechordale plaat in het vroege zebravisembryo als een modelsysteem om de functie van kandidaatgenen in celmigratie te bestuderen. Prechordale plaat-progenitors vormen een groep cellen die tijdens de gastrulatie een gerichte migratie ondergaat van de embryonale organizer naar de dierlijke pool van het embryo. Het voorgestelde protocol gebruikt celtransplantatie om mozaïek-embryo's te creëren. Dit biedt de gecombineerde voordelen van het labelen van geïsoleerde cellen, wat essentieel is voor goede beeldvorming, en van het beperken van gain/loss of function effecten tot de waargenomen cellen, waardoor cell-autonome effecten worden gegarandeerd. We beschrijven hier hoe we de functie van de TORC2-component Sin1 in celmigratie hebben beoordeeld, maar het protocol kan worden gebruikt om de functie van elk kandidaatgen in het controleren van celmigratie in vivo te analyseren.

De gepresenteerde techniek werd gebruikt om de rol van sin1, een van de belangrijkste onderdelen van het complex Tor 2 (TORC2) analyse, het beheersen in vivo celmigratie. Het gebruik van celtransplantatie maakt labeling van geïsoleerde cellen en analyse van cel-autonome effecten. Movie S1 toont de migratie van getransplanteerde prechordale plaat voorlopercellen. Actine labeling met ABP140 maakt het gemakkelijk visualisatie van actine-rijke cytoplasmatische uitsteeksels. We meten...

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van een kandidaatgen bij de regulatie van in vivo celmigratie te analyseren, gebruikmakend van celtransplantatie in combinatie met live-imaging in het zebravisembryo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van celmigratie, zoals het bepalen van de rol en het belang van nieuwe kandidaatgenen bij in vivo celmigratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er mozaïekembryo's worden gecreëerd, wat een goede beeldvorming en celadenomyose mogelijk maakt.Om naalden voor celtransplantatie voor te bereiden, wordt een glazen capillair getrokken met een micropipet-trekker. Snijd vervolgens met een microforge de punt van de naald af op het punt waar de binnendiameter 35 micrometers is. Schuin de afgeknipte zijde van het capillair af onder een hoek van 45 graden met behulp van een microslijper.Om glasresiduen te verwijderen, plaatst u de naald in een naaldhouder die op een spuit is gemonteerd en spoelt u de binnenkant van de naald drie keer door 2% hydrofluoric acid op te zuigen en weer uit te stoten. Spoel de naald vervolgens drie keer met aceton. Om schaaltjes voor injectie of celtransplantatie

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Zebravis celtransplantatie maakt de combinatie van genetica en embryologie aan het weefsel specifieke hersenschimmen te genereren. Deze video toont gastrula geënsceneerde cel transplantaties die hebben onze lab naar de rol van astroglial bevolking en de specifieke begeleiding signalen tijdens commissuur vorming in de voorhersenen te onderzoeken.

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

Deze video beschrijft een micro-injection methode voor de levering van borstkankercellen in de perivitelline ruimte van transgene zebravis embryo's. Na incubatie visualiseren we het embryo onder een fluorescerende microscoop om kankercelinvasie, verspreiding en metastase te observeren.

zPDX-analyse van invasiviteit: onderzoek naar invasief gedrag van gemetastaseerde kankercellen in zebravisembryo xenografts

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Hier presenteren we een protocol voor het transplanteren van cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie in zebravisembryo's en -larven in elk stadium tussen ten minste 1 en 7 dagen na de bevruchting.

Celtransplantatie met hoge resolutie bij embryonale en larvale zebravissen

Leer celmigratie-analyse in vivo met celtransplantatie en time-lapse imaging in zebravis-embryo's. Deze methode onderzoekt genfunctie in ontwikkelingsbiologie en creëert mozaïekembryo's voor optimale beeldvorming.

analyseren

Meer video's verkennen