analyseren In Vivo Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van een kandidaat-gen te analyseren bij het regelen van in vivo celmigratie met behulp van celtransplantatie gecombineerd met live-beeldvorming in het zebravis-embryo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celmigratie, zoals het bepalen van de rol en belangrijkheid van nieuwe kandidaat-genen bij in vivo celmigratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mozaïek-embryo's creëert die een goede beeldvorming en celadenomyosite mogelijk maken.

Gebruik een micropipet-puller om een glazen capillair te trekken om naalden voor celtransplantatie te bereiden. Snijd vervolgens met een microforge de punt van de naald op de plek waar de binnendiameter 35 micrometer is. Gebruik een microslijper om het gesneden uiteinde van het capillair onder een hoek van 45 graden te bevelen.

Om glasresten te verwijderen, steekt u de naald in een naaldhouder die op een spuit is gemonteerd en gebruikt u vervolgens 2% hydrofluorzuur om de binnenkant van de naald drie keer te spoelen door de oplossing erin en eruit te trekken. Spoel de naald vervolgens drie keer met aceton. Bereid schalen voor injectie of celtransplantatie door 1% agarose te bereiden door 50 milliliter embryomedium met 0,5 gram agarose een minuut lang op volledig vermogen in een magnetron te verwarmen.

Laat de agarosegel afkoelen tot ongeveer 60 graden Celsius en giet het gehele volume in een 90 millimeter petrischaal. Plaats een mal om lijnen voor injectie of om putjes voor celtransplantatie te maken. Wanneer de agarosegel is uitgehard, gebruikt u een pincet om de mal te verwijderen.

Gebruik onder een stereomicroscoop pincet om verzamelde transgene embryo's voorzichtig in de lijnen van een injectieschaal gevuld met embryomedium te knijpen. Orienteer de embryo's met behulp van pincet met de cellen naar de bovenkant en incubeer de schaal vervolgens bij 28 graden Celsius tot de embryo's de viercellenstadium hebben bereikt. Laad vervolgens een injectienaald met twee microliter van een eerder bereide injectieoplossing die het actin-bindende domein van het gistactin-bindende eiwit 140 bevat, gebonden aan mcherry.

Steek vervolgens de naald in een naaldhouder die is bevestigd aan een micromanipulator en verbonden is met een luchttransjecteur. Open de naald door de naaldtip voorzichtig aan te raken met behulp van fijn pincet of door deze aan het uiteinde te knijpen. Steek vervolgens de naald in een van de vier cellen en injecteer de oplossing om 70% van het celvolume te vullen.

Injecteer op dezelfde manier 30 embryo's. Wanneer de embryo's het sferestadium hebben bereikt, gebruikt u een plastic weidepijp om gascoid GFP-gastembryo's en eerder geïnjecteerde donorembryo's over te brengen in aparte 35 millimeter petrischalen die zijn bedekt met een millimeter agarose in embryomedium en gevuld met Pen/Strep-embryomedium. Gebruik fijne pincet om de embryo's handmatig uit hun chorion te extraheren.

Plaats vervolgens de embryo's in de incubator bij 28 graden Celsius. Wanneer de embryo's het schildstadium hebben bereikt, selecteert u onder een fluorescente microscoop donorembryo's die ABP140 mcherry tot expressie brengen binnen het groene schild. Gebruik een vuurgeslepen weidepijp om de gastembryo's over te brengen naar een rij putjes in de celtransplantatieschaal gevuld met Pen/Strep EM. Plaats vervolgens de donorembryo's in de aangrenzende rij.

Orienteer vervolgens de embryo's voorzichtig met een wimper met het schild naar boven. Gebruik vervolgens een naaldhouder die is bevestigd aan een spuit om het uiteinde van de naald te spoelen door 70% ethanol erin en eruit te trekken. Droog de naald door lucht erin te trekken.

Wanneer de naald droog is, steekt u deze in de naaldhouder die is verbonden met de Hamilton-sering met de bevel naar boven gericht. Om een schild-naar-schild transplantatie uit te voeren, steekt u met de transplantatieneus het schild van een donorembryo en trekt u ongeveer 10 tot 20 cellen aan die zijn gelabeld met ABP140 mcherry. Vermijd voorzichtig om dooier aan te trekken.

Transplanteer de cellen in het schild van het gastembryo en herhaal de celoverdracht totdat alle gastembryo's zijn getransplanteerd. Wanneer de transplantatie is voltooid, gebruikt u een vuurgeslepen weidepijp om eventuele beschadigde embryo's te verwijderen. Incubeer de getransplanteerde embryo's gedurende ongeveer 30 minuten bij 28 graden Celsius om ze de tijd te geven om te herstellen.

Om enkele prechordale plaatpregenitorcellen te transplanteren na het decorioneren van embryo's zoals eerder is aangetoond, gebruikt u een vuurgeslepen weidepijp om drie donorembryo's over te brengen naar een celtransplantatieschaal gevuld met Pen/Strep calciumvrij ringers. Gebruik voor elk embryo fijne pincet om een explantaat te dissecteren dat de geïnjecteerde ABP140 mcherry-gelabelde cellen bevat en gooi snel de rest van de embryo's weg. Gebruik een wimper om de explantaten voorzichtig te roeren totdat de cellen zich dissociëren.

Trek vervolgens een enkele, geïsoleerde cel op in de transplantatineus en transplanteer deze in het schild van een gastembryo zoals eerder in de video is aangetoond. Houd voor optimale controle van de aspiratie en transplantatie de scheiding van lucht/water op ongeveer 20 centimeter van het uiteinde van de naald. Om de embryo's te monteren, vult u een glazen bodemfles met een millimeter hete 0,2% agarose in EM. Plaats de fles bij 42 graden Celsius in een warmteblok.

Breng een geselecteerd embryo over in de agarose-oplossing en gooi het overtollige embryomedium van de pijp af. Trek vervolgens het embryo in de pijp met agarose en breng het over naar een eerder voorbereide beeldvormingskamer samen met een druppel agarose. Gebruik een wimper om het embryo te oriënteren door de prospectieve prechordale plaat naar boven te plaatsen voor beeldvorming met een rechtopstaande microscoop of op de glazen bodem voor beeldvorming met een omgekeerde microscoop, voordat de agarose is uitgehard.

Er zal ongeveer 40 second