Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte Plasmodium sporozoieten

Het algemene doel van deze reeks procedures is om muizen te immuniseren met door straling verzwakte plasmodium-parasieten. Om de analyse van myeloide celrecrutering in de muizenhuid en lymfeklieren te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het malariaveld, zoals welke cellulaire actoren betrokken zijn bij de aangeboren immuunrespons op levende verzwakte parasieten.

Tussen 18-25 dagen na de infectiebloedmaal, verzamel en koel geïnfecteerde muggen in een buis van 15 milliliter op ijs. Draai vervolgens de buis voorzichtig om in een petrischaal op ijs en stel de insecten bloot aan een dosis van 12 kilorad gamma- of X-straling. Verzamel de bestraalde speekselklieren van de mug in 15 microliters DPBS op ijs.

En vervolgens de klieren voorzichtig verpletteren om de sporozoïeten vrij te maken. Het injecteren van een zeer geconcentreerde parasietensuspensie in een klein volume is cruciaal, dus het is belangrijk om voldoende speekselklieren te oogsten van goed geïnfecteerde muggen, zoals blijkt uit een robuuste expressie van groene fluorescentie. Breng de parasietensuspensie opnieuw in suspensie voordat u door een zeef van 35 micrometer filtreert die is aangepast aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Tel het totale aantal geïsoleerde sporozoïeten met behulp van een microscooptellingkamer en pas de parasietensuspensie aan tot een concentratie van 8,3 maal tien tot de vierde sporozoïeten per microliter in koude DPBS op ijs. Voordat u de sporozoïeten injecteert, bevestigt u het juiste niveau van sedatie van het experimentele dier door met een teen te knijpen en brengt u oogzalf aan om hoornvliesdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens, terwijl u snel werkt, helder plakband om de buikzijde van de oorlelle van de muis voorzichtig te fixeren onder een stereomicroscoop en laad een spuit van tien microliter, uitgerust met een naald van 35 gauge, met 0,6 microliter van de resuspendeerde parasieten.

Breng vervolgens voorzichtig de naald, met de snijkant naar boven, onder de opperhuid aan de dorsale zijde van het oor aan en injecteer 0,15 microliter sporozoïeten op de plaats. Er zal een karakteristieke papule worden waargenomen op de injectieplaats. Na het injecteren van de dermis nog drie keer, zoals zojuist is gedemonstreerd, verwijdert u voorzichtig het plakband en controleert u de muis totdat deze volledig is hersteld.

Op het gewenste tijdstip na inoculatie met sporozoïeten, offert u de muis op en begint u onmiddellijk met de procedure. Zorg ervoor dat de muis tekenen van klinische dood vertoont. Desinfecteer het oor en de bijbehorende nekregio met 70 procent ethanol.

Maak vervolgens met behulp van steriele schaar en pincetten een incisie in het jugulo-carotidale gebied. Rek vervolgens de incisie uit met twee pincetten om de grijs uitziende lymfeklieren bloot te leggen. Knijp voorzichtig het bindweefsel direct boven de lymfeklieren en verwijder het en extraheer het met een tweede paar pincetten, onder het lymfekliertissue geplaatst.

Breng de lymfeklieren over in een zeef van 70 micrometer in een put van een zes-putjes kwekenschaal, die 4,5 milliliter standaardmedium bevat, aangevuld met collageenase en DNase. Verzamel vervolgens het volledige geïnjecteerde oor en gebruik twee pincetten om het oor in de dorsale en ventrale aspecten te knijpen en te scheiden. Plaats vervolgens elke zijde van het oor in een put van een tweede zes-putjes plaat, die 4,5 milliliter per putje medium bevat, aangevuld met spijsverteringsenzymen, en zorg ervoor dat elk weefsel volledig in het medium is ondergedompeld.

Om de immuuncellen van de lymfeklieren te isoleren, incubeer de plaat met lymfoïde weefsel bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2 onder zachte agitatie. Voeg na 15 minuten tien millimolair EDTA toe aan elke put en plaats de plaat op ijs. Gebruik vervolgens voor elke lymfeklieren het uiteinde van een nieuwe vijf millimeter spuitplunger en druk de lymfeklieren met cirkelvormige bewegingen tegen de zeef om het weefsel te dissociëren.

Wanneer er alleen wit bindweefsel over is, spoelt u de zeef twee keer met 500 microliter DPBS bevattende FBS en EDTA en brengt u de spoeling over naar een kegelvormige buis van 15 milliliter. Spoel vervolgens de put twee keer meer met 500 microliter van het aangevulde DPBS en brengt u de spoeling over naar de buis op ijs. Om de immuuncellen uit het oor te isoleren, incubeer de oordopjes bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2 met zachte agitatie.

Na 20 minuten snijdt u de weefsels in kleinere stukken om hun vertering te vergemakkelijken en brengt u de monsters terug naar de incubator. Na 40 minuten stopt u de vertering met tien millimolair EDTA en plaatst u de plaat op ijs. Gebruik een pipet van één milliliter met een afgesneden punt om de inhoud van elke put over te brengen naar nieuwe putjes met 70 micron zeefjes.

En gebruik een spuitplunger van vijf milliliter om de oorweefselfragmenten te dissociëren met cirkelvormige bewegingen zoals zojuist is gedemonstreerd. Wanneer er alleen wit bindweefsel en haar overblijven, spoelt u de zeefjes en putjes met DPBS plus FBS en EDTA zoals zojuist is gedemonstreerd, en verzamelt u de spoelingen in een buis van 50 milliliter op ijs. Was tenslotte de put twee keer met aangevuld DPBS en brengt u de spoeling over naar de buis op ijs.

In deze video is de migratie van door straling verzwakte sporozoïeten in de muizenhuid 15 minuten na intradermale injectie van de parasieten te zien. 24 uur na intradermale injectie van sporozoïeten worden de totale cellen geïsoleerd uit de huid en de lymfeklieren. Zoals te zien is op deze figuur, is de frequentie van myeloide cellen in de huid en de lymfeklieren robuust verhoogd in vergelijking met naïeve muizen.

Nadat de eerste stappen van het protocol voor muggenbestraling tot sporozo