Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Het algemene doel van deze procedure is het vestigen van gezonde langetermijnculturen van primaire hippocampale neuronen van muizen bij een ultralage dichtheid, om immunocytochemische labeling en de studie van neuronale celautonome mechanismen te faciliteren. Deze studie kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen binnen het neurowetenschappelijk onderzoek, zoals studies naar de specificiteit van eiwitten in de neuromorfologie of de ontwikkelingsfunctie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het neuronen in staat stelt om bij een ultralage dichtheid op een dekglasje te groeien zonder de ondersteuning van een gliale feederlaag.

Mariel Piechowicz, een student uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Bereid twee 24-wells platen met een hoge dichtheid en twee 24-wells platen met een lage dichtheid voor. Ets met een naald van 28 gauge de bodem van de 24-wells platen, zodat het verplaatste plastic als ondersteuning dient voor de dekglasjes waarop neuronen met een lage dichtheid groeien.

Verplaats de steriele glazen dekglasjes naar de twee 24-wells platen die bestemd zijn voor culturen met lage dichtheid. Coat alle vier de platen met 300 µL Poly-D-lysine van 0,1 mg/mL verdund in boraatbuffer, en plaats ze terug in de incubator voor een nachtelijke incubatiecoating. Bereid vóór de weefselafname twee petrischalen van 10 cm voor, gevuld met ijskoud steriel HBSS.

Houd onder de microscoop het embryo bij de nek vast met de pincet en maak de eerste incisie precies op de middellijn, onder het niveau van het cerebellum. Maak vervolgens een incisie aan de linkerzijde van de schedelbasis. Maak daarna nog een incisie aan de rechterzijde van de schedelbasis.

Laat een klein deel van het schedelbot en het huidweefsel aan het rostrale uiteinde ongesneden, zodat het gehele brein gemakkelijk terzijde kan worden geklapt voor extractie. Breng het brein vervolgens over naar de HBSS-oplossing. Inspecteer het brein om er zeker van te zijn dat het intact is en dat er geen grove weggesneden regio's aanwezig zijn.

Herhaal vervolgens de procedures om de resterende embryo-hersenen te verzamelen in een nieuwe petrischaal met 20 milliliters koude HBSS-buffer. Plaats elk brein met de ventrale zijde naar boven. Terwijl het brein aan het caudale uiteinde met een pincet wordt vastgehouden, wordt er met een scherpe pincet een diagonale snede gemaakt tussen het middelste rostrale punt en de caudale temporale regio.

Herhaal dit voor de andere hersenhelft. Scheid vervolgens de twee hersenhelften met intacte hippocampus van de rest van het hersenstamweefsel. Herhaal de procedures voor alle hersenen en voeg alle gedisseceerde hersenhelften samen.

Verwijder vervolgens de hersenvliezen met twee paren pincetten. Identificeer de ontwikkelende hippocampus als een gebogen structuur die in de temporale kwab is gevouwen en scheid deze van het aangrenzende corticale weefsel. Verzamel en voeg alle hippocampusweefsels samen.

Overbreng bij deze procedure alle gedissecteerde hippocampi naar de enzymatische digestie-oplossing in een conische buis van 15 milliliter. Plaats de buis vervolgens in een waterbad en incubeer deze gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na 25 minuten voorzichtig de enzymoplossing.

Voeg vervolgens vijf milliliter warm wasmedium toe om het totale volume op 10 milliliter te brengen. Was het weefsel voorzichtig door de buis vijf keer langzaam om te keren. Verwijder het wasmedium en voeg opnieuw 10 milliliter wasmedium toe voor een extra wasbeurt.

Verwijder daarna het wasmedium en voeg opnieuw drie milliliter vers warm wasmedium toe. Schud de buis 15 keer krachtig met de hand om de gedigesteerde neuronen los te maken van het weefsel. Het medium moet troebel worden zodra de cellen van het weefsel in het wasmedium zijn gescheiden.

Verzamel vervolgens de celsuspensie in een nieuwe conische buis van 15 milliliter, terwijl het resterende weefsel in de buis blijft. Voeg daarna nog twee milliliter wasmedium toe aan het weefsel en scheid het resterende weefsel voorzichtig door 15 keer te tritureren met een plastic pipet. Laat de celsuspensie vijf minuten staan voordat u deze samenvoegt in een nieuwe conische buis van 15 milliliter die de verzamelde losgeschudde cellen bevat.

Tel vervolgens de dichtheid van de neuronen met een hemocytometer. Bereken het benodigde volume van de cel-suspensie om een dichtheid van 250.000 neuronen per milliliter te verkrijgen, en voeg dit toe aan een van de twee conische buisjes die 30 milliliter compleet kweekmedium bevatten, om een neuron-platingmedium met hoge dichtheid te verkrijgen. Draag 1,2 milliliter van deze neuron-oplossing met hoge dichtheid over naar nog eens 30 milliliter compleet kweekmedium om een concentratie van 10.000 neuronen per milliliter te verkrijgen, en gebruik deze oplossing om de dekglasjes met lage dichtheid te zaaien.

Plaats bij deze procedure 24-wells platen met geëtste bodems voor hoge-dichtheid neuronen in de kweekkap. Verwijder 300 microliter van het geconditioneerde medium via vacuüm en zaai vervolgens 0,6 milliliter van de cellensuspensie met hoge dichtheid uit bij 250.000 neuronen per milliliter. Plaats de andere twee 24-wells platen met dekglas in de kweekkap.

Verwijder 300 µL van het geconditioneerde medium via vacuüm, voordat 0,6 mL van de cellesuspensie met lage dichtheid van 10.000 neuronen per mL op de dekglasjes wordt geplaatst. Plaats vervolgens alle vier de 24-wells platen terug in de incubator en laat ze twee uur incuberen. Draai daarna de dekglasjes met lage dichtheid en hechtende neuronen om naar de cultuur met hoge dichtheid en zorg ervoor dat de neuronen naar elkaar toe gericht zijn.

Plaats vervolgens de twee platen met co-culturen terug in de incubator. Voed de co-culturen door op DIV vijf 300 microliters vers voedingsmedium toe te voegen. Voeg na deze eerste voeding elke week 300 microliters vers voedingsmedium zonder cytosine arabinoside aan elke put toe.

Indien de cultuur langer dan één maand wordt bewaard, dient na de eerste maand wekelijks de helft van het medium te worden vervangen door vers voedingsmedium. Morfologisch gezien moeten zowel neuronen met een hoge dichtheid als neuronen met een lage dichtheid tot drie maanden gezond ogen. Hier wordt immunocytochemische kleuring gebruikt om de functionele glutamaterge synapsen aan te tonen, waarbij de NMDA-receptor subunit NR1 en de ApoE-receptorsubunit GluR1 via dubbele kleuring zijn gelabeld.

De functionele synapsen kunnen eenvoudig worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met ImageJ. Neuronen met een lage dichtheid worden daarnaast gelabeld met antilichamen tegen de dendritische eiwitmarker MAP2 in combinatie met de axonale eiwitmarker p-Tau. Deze dubbele labeling maakt een duidelijk onderscheid tussen dendrieten en axonen mogelijk. Culturen met een lage dichtheid kunnen ook succesvol worden getransfecteerd met DNA-plasmiden via calciumfosfaatmethoden, hoewel de transfectie-efficiëntie in latere stadia doorgaans zeer laag is.

Deze figuur illustreert dat EGFP-transfectie de neuronale morfologie kan onthullen en fijne structuren van dendritische spines zichtbaar kan maken. Ten slotte kunnen, als bewijs van concept, neuronen met een ultra-lage dichtheid worden gekweekt onder condities die de vorming van autapsen bevorderen. Deze autaptische neuronen met een ultra-lage dichtheid, gekweekt op met Poly-D-lysine gecoate micro-eilandjes, kunnen met dit co-kweekprotocol gedurende meer dan twee maanden in stand worden gehouden door de hoog-dichte feeder-neuronen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze op de dag van de celkweek in twee tot drie uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het cruciaal om de glazen dekglasjes en de bodems van de 24-wells plaat te coaten met Poly-D-lysine. Een eenvoudige etsing van de plaatbodems is voldoende om mechanische en nutritionele ondersteuning te bieden aan de hippocampale neuronen met lage dichtheid om op de dekglasjes te groeien.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire hippocampaal neuronen uit muisembryo's kunt kweken met een ultralage dichtheid, zonder gebruik van een gliale feederlaag. Hopelijk kunt u deze methode gebruiken voor uw eigen experimentele doeleinden.