Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Het algemene doel van deze procedure is om gezonde langdurige culturen van primaire muis hippocampale neuronen te vestigen bij ultralage dichtheid, om immunocytochemische labeling en de studie van neuronale celautonome mechanismen te vergemakkelijken. Deze studie kan helpen om enkele belangrijke vragen in het veld van neurowetenschappelijk onderzoek te begrijpen, zoals de studies over de specificiteit van eiwitten in de neuromorfologie van functie van ontwikkeling. Het grote voordeel van deze techniek is dat het neuronen toestaat om te groeien bij ultralage dichtheid op een dekglas zonder de ondersteuning van een gliale feederlaag.

De procedure wordt gedemonstreerd door Mariel Piechowicz, een student uit mijn laboratorium. Bereid twee hoog-dichtheid en twee laag-dichtheid 24-well platen. Gebruik een 28 gauge naald om de bodem van 24 well platen te etsen, zodat de verplaatste kunststof als ondersteuning zal dienen voor de dekglazen met laag-dichtheid neuronen die erop groeien.

Breng de steriele glazen dekglazen over naar de twee 24-well platen die zijn aangewezen voor laag-dichtheid culturen. Bekleed alle vier platen met 300 microliter 0,1 milligram per milliliter Poly-D-lysine verdund in boraatbuffer, en plaats ze terug in de incubator voor een nachtelijke incubatie. Voor de weefselcollectie, bereid twee 10 centimeter petrischalen voor die gevuld zijn met ijskoud sterieel HBSS.

Onder de microscoop, houd het embryo bij de nek vast met de pincet, en maak de eerste snede precies op de middenlijn, onder het niveau van de kleine hersenen. Vervolgens, maak een snede aan de linkerkant van de basis van de schedel. Daarna, maak nog een snede aan de rechterkant van de basis van de schedel.

Laat een klein deel van het schedelbot en huidweefsel aan het rostrale uiteinde ongesneden zodat de hele hersenen gemakkelijk omzij kunnen worden gedraaid voor extractie. Breng nu de hersenen in de HBSS-oplossing. Inspecteer de hersenen om er zeker van te zijn dat ze intact zijn zonder grove afgesneden regio's.

Herhaal vervolgens de procedures om de rest van de embryohersenen te verzamelen in een nieuwe petrischaal met 20 milliliter koude HBSS-buffer. Positioneer elke hersenen met de ventrale kant omhoog. Terwijl je de hersenen met pincetten op de caudale kant vasthoudt, maak je een snede diagonaal tussen het middelste rostrale punt en de caudale temporale regio met een scherpe pincet.

Herhaal dit voor het andere halfrond. Vervolgens, scheid de twee halfronden met intacte hippocampus van de rest van de hersenstammenweefsels. Herhaal de procedures voor alle hersenen en verzamel alle gedissekteerde halfronden bij elkaar.

Vervolgens, verwijder de hersenvliezen met behulp van twee paar pincetten. Identificeer de zich ontwikkelende hippocampus als een gebogen structuur die in de temporale kwab is gevouwen en scheid deze van de aangrenzende corticale weefsels. Verzamel en verzamel alle hippocampusweefsels bij elkaar.

In deze procedure, breng alle gedissekteerde hippocampussen over naar de enzymatische verteringsoplossing in een 15 milliliter conische buis. Plaats vervolgens de buis in een waterbad en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 25 minuten. Na 25 minuten, verwijder voorzichtig de enzymoplossing.

Voeg vervolgens vijf milliliter warm wasmedium toe om het totale volume tot 10 milliliter te brengen. Was het weefsel voorzichtig door de buis langzaam vijf keer om te draaien. Verwijder het wasmedium en voeg weer 10 milliliter wasmedium toe, voor een extra wasbeurt.

Daarna, verwijder het wasmedium en voeg drie milliliter vers warm wasmedium toe. Schud de buis krachtig 15 keer met de hand om de verteerde neuronen uit het weefsel los te maken. Het medium zou troebel moeten worden zodra de cellen zijn gescheiden van het weefsel in het wasmedium.

Verzamel vervolgens de celsuspensie in een nieuwe 15-milliliter conische buis, terwijl het resterende weefsel in de buis wordt achtergelaten. Voeg daarna nog eens twee milliliter wasmedium toe aan het weefsel, en scheid het resterende weefsel voorzichtig door 15 keer met een plastic pipette te tritureren. Laat de celsuspensie vijf minuten zitten voordat je het verzamelt in een nieuwe 15-milliliter conische buis die de verzamelde schudcels bevat.

Tel vervolgens de dichtheid van neuronen met een hemocytometer. Bereken het celsuspensievolume dat nodig is om een dichtheid van 250.000 neuronen per milliliter te verkrijgen, en voeg het toe aan een van de twee conische buizen die 30 milliliter compleet kweekmedium bevatten, om een hoog-dichtheid neuron kweekmedium te verkrijgen. Breng 1,2 milliliter van deze hoog-dichtheid neuronoplossing over naar nog eens 30 milliliter compleet kweekmedium, om een concentratie van 10.000 neuronen per milliliter te verkrijgen, en gebruik deze oplossing om de laag-dichtheid dekglazen te zaaien.

In deze procedure, plaats 24-well platen met geëtste bodems voor hoog-dichtheid neuronen in de kweekhood. Verwijder 300 microliter voorgeconditioneerd medium door middel van vacuüm, en plateer vervolgens 0,6 milliliter hoog-dichtheid celsuspensie bij 250.000 neuronen per milliliter. Plaats de andere twee 24-well platen met dekglazen in de kweekhood.

Verwijder 300 microliter voorgeconditioneerd medium door middel van vacuüm, voordat je 0,6 milliliter laag-dichtheid celsuspensie plateert bij 10.000 neuronen per milliliter op de dekglazen. Breng vervolgens alle vier de 24-well platen terug naar de incubator en incubeer gedurende twee uur. Draai daarna de laag-dichtheid dekglazen met hechtende neuronen om naar de hoog-dichtheid cultuur en zorg ervoor dat de neuronen elkaar tegenover staan.

Breng vervolgens de twee platen met co-cultuur terug naar de incubator. Voer de co-culturen door 300 microliter vers voedingsmedium toe te voegen bij DIV vijf. Na deze eerste voeding, voeg elke week 300 microliter vers voedingsmedium zonder cytosine arabinoside toe aan elke put.

Als de cultuur langer dan een maand wordt bewaard, vervang dan elke week de helft van het medium met