Name: Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer een vereenvoudigde methode voor het kweken van primaire muizen hippocampusneuronen op ultra-lage dichtheid zonder gliale voedingslaag. Deze techniek maakt langdurige culturen mogelijk voor immunocytochemie en het bestuderen van neuronale autonome mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door een NIH/NIMH-subsidie aan S.Q. (R00MH087628).

Alle experimentele procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona, en gelijkvormig aan NIH richtlijnen. 1. Tissue Bron voor de hippocampus Neuron Cultuur <ol><li> Prenatale muis pups voor hippocampus neuron cultuur te genereren, gebruiken time-zwangere muizen (C57Bl6 / J) die worden gefokt in huis 17. De dag met een vaginale plug detectie wordt aangewezen als E0.5. De geplande oogsttijd voor cultuur is E16.5-E17.5. Opmerking: Dit protocol beschrijft kweken van twee 24-well platen van twee hoge dichtheid neuronen co-kweken met lage dichtheid neuronen (48 dekglaasjes totaal). Voor meer platen en reagentia kunnen dienovereenkomstig worden geschaald. </li></ol> 2. 24-well platen Voorbereiding voor High Density Neuron culturen Opmerking: Voer de volgende stappen (2-3) de dag vóór de geplande oogst embryo. <ol><li> Breng twee 24 goedplaten in de celkweek kap, opent u de individuele verpakking. </li><li> Sluit een 18 G naald in een 1 ml plastic voor eenmalig gebruik spuit. </li><li> Houd de spuit en richt de naaldpunt ~ 1 mm links naar het midden van de bodem van de put. Toepassen matige kracht (~ 250 g) aan de bodem van de put (~ 1 mm) te etsen. Een groef wordt gevormd en de kunststoffen verplaatst zal een verhoogde ondersteuning boven de vlakke bodem goed oppervlak te vormen. Etch andere ~ 1 mm lange parallelle groef ~ 1 mm rechts van het midden van de bodem op een gelijkaardige manier. </li><li> Herhaal deze stap voor alle putjes van de twee 24-well platen. De twee 24-well platen voor hoge kweekdichtheid zijn nu klaar voor bekleden met poly-D-lysine (zie stap 3.8 hieronder). </li></ol> 3. Coverslips Voorbereiding voor Low Density Neuron culturen <ol><li> Gebruik 12-mm diameter # 1 ronde glazen. </li><li> Plaats 50 dekglaasjes in een diameter van 100 mm steriele plastic petrischaaltje, en dompel dekglaasjesin 20 ml 70% ethanol. Plaats deze petrischaal op een roterend platform met matige (70 rpm) rotatiesnelheid voor een uur. Verwijder 70% ethanol en vervolgens vervangen door een verse partij van 70% ethanol. Roteren en was nog een uur. </li><li> Gooi 70% ethanol reinigingsmiddel. Voeg steriel water (gefilterd door 0,2 um filter eenheid). Spoel de dekglaasjes rigoureus door het draaien van de petrischaal met de hand. Spoel drie keer, telkens vervangen door vers steriel water. </li><li> Plaats de petrischaal met dekglaasjes in een steriele celkweek kap met laminaire stroming. Zuig het spoelwater door het vacuüm lijn, en voeg 10 ml gefilterd steriel water om de dekglaasjes onder te dompelen. De dekglaasjes moet steriel zijn en het oppervlak moet voldoende schoon zijn voor poly-D-lysine coating. </li><li> Open twee 24-wells platen uit hun individuele verpakking en plaats ze in de kap. </li><li> Zet het vacuüm lijn in de kap. Sluit een 200 ul pipet tip om het vacuüm lijn, en gebruik maken van een GCBsor de punt snijden om een ​​grotere opening te creëren. </li><li> Gebruik een fine-tip # 5 pincet te halen dekglaasjes van de petrischaal, een voor een, en gebruik het vacuüm lijn naar de dekglaasje drogen. Plaats dan een dekglaasje in elk van de putjes van de 24-well plaat. Het 50 gereinigde dekglaasjes moet genoeg zijn om elk van de putjes van de twee 24-well platen vullen. </li><li> Verdun het poly-D-lysine stockoplossing (1 mg / ml) in werkoplossing (0,1 mg / ml) met boraatbuffer (pH 8,5). Voor de vier 24-wells platen (waaronder twee high density platen met geëtst onder), bereid 30 ml totaal werkoplossing. </li><li> Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje met dekglaasjes. Zorg ervoor dat de dekglaasjes worden volledig ondergedompeld in oplossing. Zo niet, gebruik dan de # 5 pincet tip naar beneden te drukken dekglaasjes tegen de bodem van de put, en gebruik de tip om poly-D-lysine oplossing voor al het oppervlak van de dekglaasjes te dekken te begeleiden. Visueel te inspecteren alle dekglaasjes om su te makenre geen lucht gevangen zat tussen de plaat en dekglaasjes. </li><li> Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje van de hoge dichtheid kweekplaat met geëtste bodem. Hand gedraaid om de oplossing te verspreiden naar de gehele bodem van de put omvatten. </li><li> Het geven van de vier platen met poly-D-lysine om de incubator en incubeer O / N. </li></ol> 4. Wassen en Pre-conditioning Platen voor Cultuur Opmerking: De volgende stappen (4-9) worden uitgevoerd op de dag van de oogst weefsel uitgevoerd. <ol><li> Na incubatie / bekleding van dekglaasjes en 24-well platen O / N, brengen alle vier platen (twee dekglaasjes met donor, acceptor twee high density platen met geëtst kunststof bodem) in de cultuur kap. Gebruik het vacuüm lijn naar de poly-D-lysine oplossing te verwijderen. </li><li> Onmiddellijk na het verwijderen van de poly-D-lysine oplossing, voeg ~ 1 ml steriel water aan elk putje met een plastic pipet overdracht. Nadat alle putjes gevuldmet water, laat staan ​​voor 10 min. Water verwijderen door vacuüm, voeg 300 ul wasmedium in elk putje om de bodem van de put bedekken (met of zonder dekglaasjes). Laat niet de poly-D-lysine coating uitdrogen. </li><li> Geeft alle vier platen om de celincubator. De platen zijn klaar voor gebruik zodra de verspreide hippocampus neuronen worden bereid. </li></ol> 5. Bereiding van compleet kweekmedium en trypsine oplossing voor enzymatische digestie <ol><li> Bereid 60 ml Compleet Cultuur medium door het mengen van de bestanddelen (zie Materials). Gebruik een 50 ml spuit verbonden met een 0,2 urn poriegrootte spuitfilter, filtreer de complete kweekmedium in twee 50 ml conische buizen. Elke buis bevat 30 ml compleet cultuurmedium. </li><li> In een afzonderlijke 50 ml conische buis, voeg -30 ml wasmedium (zie Materialen) en verwarm tot 37 ° C. Deze wordt gebruikt om het weefsel te wassen na enzymatische digestie. </li><li> Bereid de enzymdigestie medium. In een 15 ml conische buis, voeg 4,5 ml wasmedium en 0,5 ml 2,5% trypsine-oplossing en 50 gl 100X DNase I. </li><li> Plaats de complete cultuur medium, Wash medium, en enzym spijsvertering medium in een 37 ° C waterbad. </li></ol> 6. Voorbereiding van de chirurgische instrumenten <ol><li> Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een sterilisatie zakje: twee kleine schaar, een pincet en twee # 5 pincet. </li></ol> 7. Verwijdering van Brains uit E16.5-E17.5 muizenembryo&#39;s en Dissection van Hippocampi <ol><li> Bereid twee 10-cm petrischalen gevuld met ijskoude steriele Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). </li><li> Euthanaseren de muis dam met een intraperitoneale injectie van natrium fenobarbital (100 mg / kg in een volume van ~ 0,5 ml). Na injectie, zodra de dam reactie op teen knijpen verliest, offeren met cervicale dislocatie. </li><li> Spray buik gebied van de dam met 70% ethanol, en een 2-cm lange incisie langs de middellijn van de buik bloot te leggende baarmoeder. </li><li> Verwijder de embryo&#39;s en plaats individuele die in een 10-cm diameter petrischaal met koude ontleden HBSS buffer. </li><li> Houd de embryo bij de nek met behulp van een tang, en gebruik een kleine schaar om de eerste snede goed te maken in de middellijn onder het cerebellum niveau en de sectie over het hersenweefsel. Mis het embryo niet onthoofden. <ol><li> Steek de rechterzijde topje van de kleine schaar uit caudale regio die open wordt gesneden, helemaal door de rostrale deel van de embryonale hersenen (niet cross middellijn), en maak een snee aan de linkerkant op het niveau van de schedelbasis. </li><li> Steek de linkerkant schaar tip opnieuw om een ​​snee aan de rechterkant te maken. Laat een smalle band van ongesneden schedel bot en huidweefsel aan de rostrale einde, zodat het hele brein opzij kan worden omgedraaid voor eenvoudige extractie. </li><li> Gebruik de punt van de schaar om schep de embryonale hersenen in de HBSS oplossing. Inspecteer de hersenen onder een stereomicroscoop. De hersenen moet intact zonder bruto cut-o zijnff regio&#39;s. </li><li> Herhaal deze stappen om alle embryo hersenen te verzamelen. </li></ol></li><li> Verzamel alle intact hersenen in een nieuwe petrischaaltje met 20 ml koud HBSS buffer. Plaats de petrischaal onder een dissectie microscoop. </li><li> Bekijk de hersenen van buikzijde. Houd de hersenen met een tang aan het caudale einde, plaatst u een scherpe # 5 pincet schuin naar een snee tussen het midden rostrale punt en de staartvin-temporale regio. Herhaal dit voor het andere halfrond. Na het snijden afzonderlijke twee hemisferen met intacte hippocampus van de rest van de hersenstam weefsels. <ol><li> Herhaal deze procedure voor elk van de hersenen. </li></ol></li><li> Zwembad alle ontleed hemisferen, en verwijder de hersenvliezen met behulp van twee paren van # 5 pincet. </li><li> Identificeer de ontwikkeling hippocampus als een gebogen structuur die is opgevouwen in de temporale kwab. Wissel de twee paren van pincet om de hippocampus te scheiden van aangrenzende corticale weefsels. Verzamelen en bundelen alle hippocampi weefsel (zie figuur 1). </li></ol> 8. enzymatische afbraak, scheiden in Single Neuronen <ol><li> Met een plastic overdracht pipet alle ontleed hippocampus in de enzymatische digestie oplossing die 5 ml wasmedium met 0,25% trypsine + 1X DNase I in een 15 ml conische buis. </li><li> Plaats de buis in een waterbad en incubeer bij 37 ° C gedurende 25 min met tussenpozen voorzichtig omkeren van de buis eenmaal per 5 minuten. </li><li> Na 25 min, verwijder voorzichtig het enzym oplossing met behulp van een hand gehouden plastic pipet door aspiratie. Voeg warm Wash medium tot 10 ml en voorzichtig het weefsel te wassen door langzaam het buisje 5 keer. Verwijder de Wash medium, en voeg 10 ml Wash medium opnieuw voor een extra wasbeurt. </li><li> Verwijder de Wash medium, en voeg 3 ml vers warm Wash medium weer. Schud de buis met de hand rigoureus voor 15 keer aan de verteerde neuronen te verjagen uit het weefsel. Het medium moet troebel nadat de cellen een gewordenopnieuw gescheiden van het weefsel in het wasmedium. Verzamel de celsuspensie in een nieuwe 15 ml conische buis terwijl de resterende weefsel in de buis. </li><li> Voeg nog eens 2 ml Wash medium aan het weefsel, en voorzichtig de resterende weefsel te scheiden door tritureren door een plastic pipet voor ~ 15 keer. Laat zitten voor 5 min. Verzamel de celsuspensie in de nieuwe 15 ml conische buis die bevat verzamelde &#39;shake-off&#39; cellen. </li><li> Tel de dichtheid van neuronen met een hemocytometer. Meestal kan 3000-5000 cellen per microliter worden verkregen afhankelijk van het aantal embryo&#39;s ontleed. Een gemiddeld aantal van 2,5 x 10 7 neuronen worden geschat als de veronderstelling zes embryo&#39;s worden ontleed. </li><li> Bereken het benodigde volume van de celsuspensie tot een dichtheid van 250.000 neuronen / ml werd verkregen na toevoeging 30 ml compleet cultuurmedium. Voeg dit volume op een van de twee conische buizen met 30 ml compleet kweekmedium hoge dichtheid neuron plating medium verkregen. </li> &lt;li&gt; Overdracht 1,2 ml van deze hoge dichtheid neuron oplossing nog 30 ml compleet kweekmedium tot een concentratie van ~ 10.000 neuronen / ml verkregen. Gebruik deze verdunning om de low-density dekglaasjes zaad. </li></ol> 9. Plating van neuronen en lange termijn Co-cultuur <ol><li> Breng de twee 24-well platen met geëtst bodems voor hoge dichtheid neuronen in de celkweek kap. Verwijder de 300 pi medium voorwaarde van vacuüm. Plate 0,6 ml high density celsuspensies op 250.000 neuronen / ml. </li><li> Breng de andere twee 24-well platen met dekglaasjes in de cultuur kap en verwijder de voorwaarde 300 ul medium met vacuüm. Plaat 0,6 ml lage dichtheid celsuspensies bij 10.000 neuronen / ml op de dekglaasjes in de twee 24-well platen. </li><li> Terug vier 24-well platen in de incubator. Laat zitten voor 2 uur. </li><li> Flip de lage dichtheid dekglaasjes met het naleven neuronen aan de hoge cultuur dichtheid. Zorg ervoor dat de neuronen worden tegenover elkaar (dat wil zeggen, not gescheiden door de glazen dekglaasje). Plaats dan de twee platen met co-cultuur aan de incubator. </li></ol> 10. Co-cultuur Sustaining <ol><li> Feed co-kweken door toevoegen 300 ul vers voedingsmedium (zie Materialen) op dag in vitro (DIV) 5. Het is niet nodig om 50% van de oorspronkelijke complete kweekmedium te verwijderen, zoals door veel andere studies. Het voedingsmedium bevat ook 15 uM cytosine arabinoside (Ara-C, tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM opbrengst) om de kans op verontreiniging glia en proliferatie minimaliseren. </li><li> Na deze eerste voeden, voeg 300 ul vers Feed medium zonder Ara-C naar de put elke week. Indien de kweek gedurende meer dan één maand worden bewaard, vervangen de helft van het medium met vers voedingsmedium wekelijks na één maand tijdspunt (het eerste medium halve vervanging op DIV33). Morfologisch, zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen zien er gezond uit tot drie maanden (de langste tijd waargenomen door de experimenters). </li></ol> 11. Illustratie van een experimentele manipulatie-Low Density Neuron Transfectie Opmerking: Wanneer transfectie in lage dichtheid neuronen gewenst is, kan een eenvoudige calciumfosfaat protocol worden vastgesteld. We hebben gevonden dat lage dichtheid culturen betere transfectie-efficiëntie met calciumfosfaat protocol voor DIV12, maar kunnen worden getransfecteerd met veel lagere efficiëntie bij DIV21 of ouder, gedurende welke tijd dendritische prominent. De haalbaarheid van de transfectie van gekweekte neuron lage dichtheid illustreert neuronen transfecteren met een plasmide pEGFP-C3 (zie hieronder). <ol><li> Bij DIV21, verwijder 600 ul geconditioneerde medium van elk putje van de co-cultuur, en over te dragen aan een nieuwe 24-well plaat. Voeg vervolgens 600 ul vers voedingsmedium aan de co-kweek om het terug naar het oorspronkelijke volume te brengen. <ol><li> Breng de dekglaasjes in de nieuwe 24-well plaat met 600 pl geconditioneerd medium. Zorg ervoor dat delage dichtheid neuronen naar boven. Plaats de hoge dichtheid platen en de nieuwe platen met dekglaasjes opnieuw in de incubator. </li></ol></li><li> Bereid twee 1,5 ml steriele buizen. In één buis, voeg 600 ul 2X HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS). Bereken het volume van 12 ug pEGFP-C3 DNA basis van plasmideconcentratie. In de andere buis, voeg 74 ui CaCl2 (2 M voorraad) en de hoeveelheid water die na het toevoegen van 600 pi plasmide maakt. Meng goed door pipetteren en voeg dan plasmide-DNA. Langzaam meng goed. Laat beide buizen zitten 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl de hand houden van de 2X HBS buis en matig schudden van de oplossing op een mixer, voeg alle van de 600 pi van het DNA-CaCl2 oplossing druppel voor druppel op de 600 pi 2X HBS buis. Het is cruciaal dat het gevormde precipitaat in de vorm van korrels fijn zand. Mengen te sterk en te snel is niet wenselijk, omdat het meer waarschijnlijk zal produceren grote &#39;snow flake&#39;-achtige neerslagen, which heeft drastisch lagere transfectie-efficiëntie op basis van onze waarnemingen. </li><li> Laat het neerslag nog steeds gevormd worden in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Voeg 100 ul neerslag in elk putje dat een lage dichtheid neuron op de dekglaasjes bevat, druppelsgewijs en gelijkmatig. Zet de plaat incubator en incubeer gedurende 2 uur. Uitgaande meeste CaCl 2 in vrije vorm, resulteert dit in een concentratie van ~ 17,6 mM Ca2 +, die toxisch voor neuronen na langdurige incubatie kan zijn. </li><li> Bereid een 50 ml conische buis met ~ 50 ml Wash medium, warm het op tot 37 ° C. </li><li> Aan het eind van 2 uur, breng de lage dichtheid neuron met DNA-calciumfosfaat precipitaten in de kap. Pick-up elke individuele dekglaasje met een scherp # 5 pincet, en dompel het drie keer in de 50 ml Wash medium om het kort te wassen. Dan terug naar de hoge dichtheid neuronen in de oorspronkelijke co-kweekplaten met lage dichtheid neuronen naar beneden. </li><li> Ga door met de cultuur totde lage dichtheid cultuur neuronen op dekglaasjes worden geoogst voor studies. </li></ol>

<ol><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Cultureing+Nerve+Cells%22">Cultureing Nerve Cells</a>. , 2nd edition, 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+microtubule-based+transport+of+dendritic+membrane+proteins+arises+in+concert+with+axon+specification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification.</a> J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Shi, Y., Ethell, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+control+dendritic+spine+plasticity+in+hippocampal+neurons+through+NMDA+receptor+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II-mediated+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization.</a> J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8, e83899(2013).</li>
<li>Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+protein+kinase+mediates+activity-regulated+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors.</a> J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).</li>
<li>Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+induces+synaptic+delivery+of+hnRNP+A2%2FB1+by+a+BDNF-dependent+mechanism+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons.</a> PLoS One. 9, e108175(2014).</li>
<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).</li>
<li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+rat+hippocampal+neurons+at+low+density+in+serum-free+medium%3A+combination+of+the+sandwich+culture+technique+with+the+three-dimensional+nanofibrous+hydrogel+PuraMatrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS One. 9, e102703(2014).</li>
<li>Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+peptidomics+of+supraoptic+magnocellular+and+hippocampal+neurons+in+low-density+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures.</a> ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).</li>
<li>Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+dendrite+development+in+hippocampal+neurons+by+binding+to+p75NTR+and+modulating+the+cellular+targets+of+Notch%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch.</a> Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).</li>
<li>Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+culturing+primary+fetal+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 803930(2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Qiu, S., Weeber, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signaling+facilitates+maturation+of+CA1+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses.</a> J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).</li>
<li>Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+receptor+tyrosine+kinase+controls+dendritic+complexity%2C+spine+morphogenesis%2C+and+glutamatergic+synapse+maturation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus.</a> J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de lange termijn de cultuur van ultra-lage dichtheid hippocampale glutamaat neuronen onder serum-vrije omstandigheden. Bij ~ 2000 neuronen / cm 2, de dichtheid ten minste twee maal lager dan de meeste lage dichtheid voor bereiding met of zonder glia steun van de bestaande literatuur 2,3,11,13,14 gerapporteerd. Naast het feit dat ultra-lage dichtheid, dit protocol is nieuw en belangrijk in twee opzichten. Eerst wordt geen glia feeder layer nodig als lag...

Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping 1 onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (&gt; 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie 2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, maakt deze werkwijze het observeren, zoals live imaging of immunocytochemie (ICC) kleuring via één brandvlak 3; of manipulaties, zoals de behandeling met geneesmiddelen en transfecties 3-6. Wanneer ze groeien bij hoge dichtheid, neuronen hebben de neiging om hoge tarieven van de overleving als gevolg van hogere co hebbenncentrations uitgescheiden groeifactoren naast voedings steun van de groeimedia, en vanwege neuriet contact-afhankelijke mechanismen 7. Echter, een lage dichtheid hippocampus neuronen zijn wenselijk voor morfologische studies, waarbij een individueel neuron in zijn geheel kan worden afgebeeld of gekleurd voor ICC-analyse. Lage dichtheid neuronen zijn moeilijk te handhaven in kweek door gebrek aan ondersteuning paracriene en dus vereisen vaak trofische ondersteuning van een gliale (typisch corticale astrocyten) voedsterlaag, die moet worden opgemaakt voor neuron cultuur 2. Als co-gekweekt met een gliale cel voedsterlaag worden lage dichtheid neuronen gekweekt op dekglaasjes en vervolgens omgedraaid bovenop de glia laag, zodat het lage dichtheid neuronen en glia tegenover elkaar. Een kleine afgesloten ruimte tussen glia en neuronen wordt gecreëerd door het plaatsen van paraffine stippen op de hoeken van de dekglaasjes derhalve tot een &#39;sandwich&#39; layout 2,8,9. De lage dichtheid neuronen zal groeien wedurende de beperkte ruimte tussen glia en het dekglaasje, die een tolerante micro-omgeving met geconcentreerde factoren uitgescheiden door neuronen en glia creëert. Deze aanpak levert een lage dichtheid, volledig ontwikkeld neuronen die redelijk uit elkaar geplaatst zijn, dus het vergemakkelijken van etikettering ICC of live-imaging studies. Een duidelijk nadeel van neuron-glia co-cultuur, afgezien van tijdrovend en moeizaam, is dat het voorkomt onderzoek neuron-specifieke of cel-autonome mechanismen. Hoewel dit systeem is veel minder complex dan in vivo zenuwweefsel, glia effect op neuron ontwikkeling door middel van uitgescheiden, nog-niet-helemaal-gedefinieerde factoren kunnen de experimenten 10 beschamen. Daarom is in experimenten die het onderzoek naar neuron specifieke mechanismen, gedefinieerd kweekomstandigheden die te verwijderen serum en gliacellen steunlaag nodig zijn nodig. Een eerdere studie heeft kunnen kweken lage concentraties van neuronen (~ 9000 cellen / cm2) met een eree dimensionale hydrogel matrix 11. Omdat een relatief zuivere neuronale populatie kan worden gekweekt met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden zonder glial steun Onze hypothese is dat ultra-lage dichtheid van hippocampale neuronen in serumvrij gedefinieerd kweekmedium worden gekweekt door co-kweken ze met hoge dichtheid neuronen, in een manier die analoog is aan de conventioneel aangenomen neuron-glia co-cultuur. Inderdaad, hoge dichtheid hippocampale neuron culturen in een &quot;sandwich&quot; configuratie zijn onlangs gebruikt om een klein aantal gespecialiseerde endocriene magnocellulaire neuronen 12 ondersteunen. Daarom kan co-kweek met hoge dichtheid neuronen mogelijk lage dichtheid neuronen trofische factoren ondersteuning die voldoende is om de overleving op lange termijn mogelijk ontvangen. Dit protocol van het kweken van ultra-lage dichtheid neuronen werd dus geformuleerd en gevalideerd. Het protocol kan worden uitgevoerd binnen een enkel experiment, door het bereiden van een hoge dichtheid (~ 250.000 cellen / ml) dispelde hippocampale neuronen, en dan het maken van een verdunning tot een dichtheid ~ 10.000 neuronen op / ml (~ 3000 neuronen / dekglaasje of ~ 2000 neuronen / cm 2), die veel lager dan de meeste gerapporteerde lage dichtheid cultures 2,3,9 , 11,13. Dit kweekomstandigheid is losjes aangeduid als &quot;ultra-low density cultuur en worden met&quot; lage dichtheid &quot;onderling verwisselbaar. De hoge dichtheid neuronen uitgeplaat op poly-D-lysine beklede 24-putjesplaten; terwijl de lage dichtheid neuronen gezaaid op poly-D-lysine beklede 12-mm dekglaasjes die in een andere 24-wells plaat geplaatst. De dekglaasjes met hechtende lage dichtheid neuronen worden omgedraaid op de top van de hoge dichtheid neuronen 2 uur later nadat de neuronen zijn afgedaald en aan de dekglaasjes. Bovendien, in plaats van paraffinewas stippen op de dekglaasjes boven de hoge dichtheid laag neuron verhogen, werd een 18 G naald gebruikt om de bodem van de 24 well platen etsen met twee evenwijdige strepen. De resulterende DISPLAced, grenzend aan plastics zorgen voor een verhoogde steun voor de dekglaasjes. Deze ruimte wordt consequent gemeten bij 150-200 urn, die voldoende zuurstof en kweekmedium uitwisseling mogelijk maakt, terwijl een micro-omgeving met geconcentreerd trofische factoren. Onder deze voorwaarde, de lage dichtheid neuronen groeien op grote schaal, en kan overleven dan drie maanden in de cultuur. Wanneer deze neuronen worden getransfecteerd met GFP plasmide na drie weken in cultuur worden de dendrieten rijkelijk bezaaid met dendritische stekels. Als bewijs van principe worden gegevens die aantonen dat deze co-kweeksysteem ondersteunt ultralage dichtheid kweken van hippocampale neuronen gezaaid op poly-D-lysine micro-eilanden, waarbij neuronen vormen autaptic verbindingen die onderzoek cel kan vergemakkelijken -autonomous, netwerk-onafhankelijke mechanismen.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>aliquot, bewaar in 0,6ml formaat</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>verdun 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>antibiotic-antimycotic (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>verdun 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Cultuur medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal medium met 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>Was medium</td><td></td><td></td><td>hetzelfde als 'Neurobasal medium'</td></tr><tr><td>Voedings medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal met 1X B27 supplement</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>bereid 100X stock op 0,6mg/ml</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>M.W. 70000-150000</td></tr><tr><td>boraat buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (boorzuur); 71997(borax)</td><td>1,24g boorzuur &amp; 1,9g borax in 400ml H2O, pH tot 8,5 gebruik HCl</td></tr><tr><td>12-mm ronde glazen deksels</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 glas, koop bij Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>proFection transfectie kit</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>zie&nbsp; protocol voor details</td></tr><tr><td>2X HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>zie&nbsp; protocol voor details</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0,2um poriegrootte</td></tr><tr><td>Endofree plasmide prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>voor bereiding van transfectiekwaliteit plasmide DNA</td></tr><tr><td>anti-MAP2 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td>muis antilichaam, clone AP20</td></tr><tr><td>anti-p-Tau antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB10417</td><td>konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-NR1 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>muis antilichaam, clone R1JHL</td></tr><tr><td>anti-GluR1 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td><td>konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>Hank's gebalanceerde zout oplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>500ml formaat</td></tr></tbody></table>

een vereenvoudigde methode voor de ultra-low density, long-term primaire hippocampus neuron cultuur

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Het kweken van primaire hippocampus neuronen in vitro vergemakkelijkt mechanistische ondervraging van de vele aspecten van neuronale ontwikkeling. Gedissocieerde embryonale hippocampale neuronen groeien vaak succesvol op dekglaasjes met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden, maar lage dichtheid kweken vereisen typisch een toevoer van trofische factoren door co-kweken ze met een glia voedsterlaag, bereiding kan tijdrovend zijn en moeizaam. Bovendien kan de aanwezigheid van glia interpretatie van de resultaten en te vermijden studies op neuron-specifieke mechanismen verwarren. Hier wordt een vereenvoudigde werkwijze voorgesteld voor ultralage dichtheid (~ 2000 neuronen / cm 2), lange termijn (&gt; 3 maanden) primaire hippocampale neuron cultuur die onder serumvrije omstandigheden en zonder glia Celdrager. Lage dichtheid neuronen gekweekt op poly-D-lysine beklede dekglaasjes en knipte hoge dichtheid neuronen gekweekt in een 24-wells plaat. In plaats van paraffine punten om een ​​ruimte te creëren between de twee neuronale lagen, kunnen de onderzoekers eenvoudig etsen plastic bodem van de put, waarop de hoge dichtheid neuronen bevinden, een microspace tot een lage dichtheid neuron groei. De co-kweek kan gemakkelijk worden gehandhaafd gedurende&gt; 3 maanden zonder aanzienlijk verlies van lage dichtheid neuronen, waardoor de morfologische en fysiologische studie van deze neuronen vergemakkelijken. Om deze succesvolle cultuur aandoening te illustreren, worden de gegevens verstrekt aan overvloedig synapsvorming in lage dichtheid cellen na langdurige cultuur te laten zien. Deze co-cultuur systeem vergemakkelijkt ook het voortbestaan ​​van schaarse individuele neuronen gekweekt in eilanden van poly-D-lysine substraten en dus de vorming van autaptic verbindingen.

De hier beschreven protocol maakt succesvolle ultra-lage dichtheid, langetermijnkweek zuivere glutamaat neuronen zonder de noodzaak van glia cellen dienen als voedsterlaag. Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1, die de bereiding van hoge dichtheid (op poly-D-lysine-gecoate 24 wells) en lage dichtheid neuronen (op poly-D-lysine beklede dekglaasjes) omvat afzonderlijk, en vervolgens co-cultuur kan worden maximaal drie maanden aangehouden. <p class="jove_c...

Cultures met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen vereisen meestal een glia-feederlaag om neurotrofe factoren te leveren en hun levensduur te ondersteunen. We beschrijven hier een vereenvoudigde methode om ultra-lage dichtheidsneuronen op glazen dekglasjes te kweken in de aanwezigheid van een neuronale feederlaag met hoge dichtheid, wat de onderzoek naar specifieke neuronaal-autonome mechanismen vergemakkelijkt.

Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Het algemene doel van deze procedure is het vestigen van gezonde langetermijnculturen van primaire hippocampale neuronen van muizen bij een ultralage dichtheid, om immunocytochemische labeling en de studie van neuronale celautonome mechanismen te faciliteren. Deze studie kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen binnen het neurowetenschappelijk onderzoek, zoals studies naar de specificiteit van eiwitten in de neuromorfologie of de ontwikkelingsfunctie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het neuronen in staat stelt om bij een ultralage dichtheid op een dekglasje te groeien zonder de ondersteuning van een gliale feederlaag.Mariel Piechowicz, een student uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Bereid twee 24-wells platen met een hoge dichtheid en twee 24-wells platen met een lage dichtheid voor. Ets met een naald van 28 gauge de bodem van de 24-wells platen, zodat het verplaatste plastic als ondersteuning dient voor de dekglasjes waarop neuronen met een lage dichtheid groeien.Verplaats de steriele glazen dekglasjes naar de twee 24-wells platen die bestemd zijn voor culturen met lage dichtheid. Coat alle vier de platen met 300 µL Poly-D-lysine

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De dissectie en de groei van cellen van een persoon hersengebied vergemakkelijkt onderzoek van cellulaire en fysiologische parameters. We beschrijven een methode voor primaire celcultuur dat neuron verrijkte culturen produceert in een serum-vrije omgeving.

Primaire Cultuur van hippocampale neuronen van P0 pasgeboren ratten

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Beschrijven we een protocol dat beeldvorming van mitochondriën kan in levende neuronen via fluorescentie microscopie over lange duur. Imaging gedurende langere perioden wordt bereikt door lentivirus-gemedieerde expressie van een mitochondrially gerichte fluorescerend eiwit en het gebruik van een goedkope stage-top incubator, dat is ontworpen en gebouwd in ons laboratorium.

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

Wij bieden een protocol voor de cultuur van sterk gezuiverd hippocampale neuronen van prenatale muis hersenen zonder het gebruik van een feeder-gliale cellaag.

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

This video demonstrates the method for culturing ultra-low-density neurons in the presence of a high-density neuronal feeder layer. It establishes a co-culture of varying-density neurons, ensuring close physical proximity. The growth factors secreted by high-density neurons help neuronal survival and growth, maintaining ultra-low-density neurons for a longer time period.

Generating an Ultra-Low-Density Neuronal Culture Using a High-Density Neuronal Feeder Layer

This video demonstrates the dissociation and culture of hippocampal neurons from hippocampal tissue samples using enzymatic and mechanical dissociations. The treatment with Ara-C inhibits the growth of non-neuronal cells, facilitating the selective growth of hippocampal neurons.

Dissociating and Culturing Neurons from Hippocampal Tissue Samples

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Een kant-en-klare bevroren voorraad neuronen is een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van synaptische functies. Hier introduceren we een eenvoudige primaire cultuur met lage dichtheid uit bevroren voorraad met behulp van een 96-well plaat.

Eenvoudige en reproduceerbare primaire cultuur met lage dichtheid met behulp van bevroren voorraad embryonale hippocampusneuronen

Leer een vereenvoudigde methode voor het kweken van primaire muizen hippocampusneuronen op ultra-lage dichtheid zonder gliale voedingslaag. Deze techniek maakt langdurige culturen mogelijk voor immunocytochemie en het bestuderen van neuronale autonome mechanismen.

Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Meer video's verkennen