Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden Xenopus Kidney
3 mei 2016
Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om microinjecties te richten op de zich ontwikkelende xenopus nier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe de nier zich vormt en welke genen belangrijk zijn voor dit proces. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de aflevering van microgeïnjecteerde reagentia naar een doelweefsel maximaliseert.
Visualisatie van deze methode is belangrijk omdat identificatie van de juiste blastomeer voor gerichte micro-injectie cruciaal is. Om deze procedure te beginnen, werden beide teelballen geïsoleerd van een enkele mannelijke kikker en geplaatst in een 60 millimeter petrischaal gevuld met 10 milliliter teelbalopslagoplossing. Bewaar vervolgens de teelballen op vier graden Celsius.
Vervolgens werden eieren verzameld van een vrouwelijke kikker in een 100 millimeter petrischaal. Giet overtollig water uit de petrischaal. Snijd daarna een kwart van een teelbal af in Teelbalopslagoplossing.
Breng het stuk teelbal over naar de petrischaal met de eieren. Snijd vervolgens het teelbaldeel in kleine stukjes. Voeg MMR plus Gentamycine toe aan de petrischaal om de eieren te bedekken.
Meng ze door de schaal te zwaaien en wacht vervolgens ongeveer 30 minuten om bevruchting plaats te laten vinden bij kamertemperatuur. Na bevruchting moet de gepigmenteerde kant van de embryo's omhoog staan. Verwijder MMR uit de petrischaal met een overdrachtspijp en voeg voldoende de-jelly-oplossing toe om de embryo's te bedekken.
Roer vervolgens de schaal de komende paar minuten om de jellylaag op de embryo's op te lossen. Zodra de embryo's elkaar nauw contact maken in het midden van de schaal, is de jellylaag verwijderd. Verwijder de de-jelly-oplossing met een overdrachtspijp.
Was vervolgens de ontdaan van de jelly-embryo's 3 tot 5 keer in MMR plus Gentamycine door voorzichtig de MMR af te gieten en de schaal te vullen met nieuwe MMR. Verwijder niet alle MMR uit de schaal, omdat dit de embryo's kan beschadigen. Verwijder vervolgens alle onbevruchte eieren of stukjes teelbal uit de petrischaal.
Om hun ontwikkeling uit te stellen, plaats de helft van de embryo's van een enkele bevruchting in een petrischaal op 14 graden Celsius, en de andere helft van de embryo's in een petrischaal op 18 graden Celsius. Embryo's ontwikkelen zich langzamer bij 14 graden Celsius dan bij 18 graden Celsius. Hierdoor kunnen meerdere sets injecties worden uitgevoerd vanuit een enkele bevruchte koppeling.
Bereid de injectieoplossing voor met punt nul een nanogram per nanoliter Membraan-gebonden Rood Fluorescerend Eiwit mRNA. Terwijl de embryo's zich ontwikkelen tot de 4-cellige of 8-cellige fase. Houd de injectieoplossing op ijs tot gebruik.
Laad vervolgens een zevenduims vervangende glazen capillaire buis in een naaldtrekker met de bovenkant van de vervangende buis uitgelijnd met de bovenkant van de naaldtrekkerkast. Stel de hittewaarde twee op 800 in en de trekwaarde op 650 en druk op de trekknop om de naald te trekken. Knip daarna het uiteinde van de getrokken naald af met een paar Dumont-tang.
Schuif de micropipetcollet op de achterkant van de naald. Plaats vervolgens de grote gat O-ring op de achterkant van de naald achter de collet. Vul nu de naald met minerale olie met behulp van een 27 gauge hyperdermische naald, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de naald komen.
Schuif de naald op de plunjer van de micro-injector, zet de naald in de grote gat van de witte plastic ruimte geïnstalleerd op de plunjer. Bevestig de naald door de collet vast te draaien. Druk vervolgens op en houd de knop "Empty" op het micro-injector controlepaneel ingedrukt tot er twee piepjes klinken.
Pijp daarna drie microliter injectieoplossing op een stukje parafilm. Steek vervolgens de punt van de naald in de drop injectieoplossing op de parafilm. Druk en houd de knop "Fill" op het micro-injector controlepaneel ingedrukt om de injectieoplossing in de naald te trekken.
Voor micro-injectie is het belangrijk om de vroege celdelingen van het xenopus-embryo te begrijpen. Het enkelcellige embryo heeft een donker gepigmenteerde, dierlijke pool en een plantaardige pool die wit en eierlijk is. In het tweedubbele embryo vindt de eerste klieving doorgaans plaats tussen de linker- en rechterkant van het embryo.
Deze cellen dragen gelijkwaardig bij aan de pronefrische lijn. De tweede klieving verdeelt de dorsale en ventrale helften van het embryo, wat leidt tot een 4-cellig embryo. De dorsale cellen zijn kleiner en hebben minder pigment dan de ventrale cellen.
Als je in een 4-cellig embryo injecteert, injecteer dan de linker ventrale blastomeer om de linker nier te richten. De derde klieving snijdt de dierlijke en plantaardige zijden doormidden. Dit resulteert in een 8-cellig embryo.
Op dit punt zijn er vier dierlijke blastomeren en vier plantaardige blastomeren. Om de linker nier van een 8-cellig embryo te richten, injecteer je in de linker ventrale plantaardige blastomeer. Vul vervolgens een 60 millimeter petrischaal bekleed met 500 micron polyester gaas met vijf procent fycol in MMR plus Gentamycine.
Pipet voorzichtig 20 tot 30 8-cellige embryo's in de schaal. Gebruik een haarlokken om de embryo's te manipuleren zodat de blastomeer die moet worden geïnjecteerd naar de naald is gericht. Om de linker nier te richten, lijn de embryo's zo uit dat de linker ventrale plantaardige blastomeren van 8-cellige embryo's naar de naald zijn gericht.
Injecteer 10 nanoliter injectieoplossing in de geselecteerde blastomeer van elk embryo in de schaal. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's over in de putjes van een kweekplaat met vijf procent fycol in MMR plus Gentamycine. Incubeer de geïnjecteerde embryo's gedurende ongeveer één tot twee uur op 16 graden Celsius om de geïnjecteerde blastomeren te laten genezen.
Breng vervolgens de microgeïnjecteerde embryo's over in nieuwe putjes in de kweekplaat gevuld met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het gericht uitvoeren van micro-injecties in individuele blastomeren die zich ontwikkelen tot de nier van Xenopus laevis-embryo's. Het doel is om ons begrip van de niervorming en de genen die bij dit proces betrokken zijn te vergroten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Embryologie
- Genfunctieanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van de nierontwikkeling is van cruciaal belang in de ontwikkelingsbiologie.
- Microinjectietechnieken maken een nauwkeurige toediening van reagentia mogelijk.
- Het identificeren van de juiste blastomeer is essentieel voor succesvolle injecties.
- Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van genrollen in de organogenese.
Doel van het onderzoek
- Om de vorming van de nier in Xenopus laevis te onderzoeken.
- Om belangrijke genen te identificeren die betrokken zijn bij de nierontwikkeling.
- Om technieken voor gerichte microinjectie in embryo's te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van de testikels van een mannelijke kikker.
- Bereiding van de bewaaroplossing voor testikels.
- Bewaring van testikels bij lage temperaturen.
- Visualisatiietechnieken voor het identificeren van blastomeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle targeting van micro-injecties naar specifieke blastomeren.
- Verbeterd begrip van de processen van nierontwikkeling.
- Identificatie van sleutelgenen die de niervorming beïnvloeden.
- Verbeterde methodologie voor toekomstige studies naar ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van de nierontwikkeling.
- Gerichte micro-injecties kunnen belangrijke inzichten verschaffen in genfuncties.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om organogenese te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Gerichte micro-injectie in Xenopus-embryo's maakt een precieze ruimtelijke controle van genexpressie mogelijk, waardoor off-target effecten worden verminderd en de mechanistische helderheid in ontwikkelingsstudies wordt verbeterd. Deze benadering ondersteunt target-validatie door specifieke genen te koppelen aan organogenese-paden, zoals de vorming van de pronefros, met minimale systemische verstoring. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door genfuncties te isoleren binnen gedefinieerde weefselcontexten.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genen te overexpresseren of uit te schakelen in specifieke blastomeren die bijdragen aan de pronefros.
- Operationele waarde: Vermindert secundaire effecten in niet-doelweefsels, waardoor de signaal-ruisverhouding in fenotypische readouts toeneemt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanisch de-risking door de rol van genen in de nierontwikkeling te verduidelijken via ruimtelijk beperkte manipulatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde biologische systemen met cellen waarvan de lineage is gevolgd voor downstream-analyse van de bijdrage aan de pronefros.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van whole-mount immunostaining in stadium 38–40 om de integratie van getargete cellen in de pronefros kwantitatief te beoordelen.
- Reproduceerbaarheid: Vertrouwt op gevestigde fate maps en consistentie bij het targeten van blastomeren in 4-cel en 8-cel embryo's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Relevantie: De Xenopus-pronefros dient als een ziekterelevant systeem voor het modelleren van geconserveerde mechanismen van nierontwikkeling bij gewervelden.
- Mechanistische Continuïteit: Maakt de overgang mogelijk van de ontdekking van genfuncties in embryo's naar pathway-analyse in preklinische modellen.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door target-engagement te valideren in een ontwikkelend orgaansysteem voorafgaand aan studies bij zoogdieren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De techniek past binnen vroege discovery-workflows, waarbij blastomeerspecifieke genmodulatie wordt gekoppeld aan fenotypische beoordeling in ontwikkelende weefsels, wat bijdraagt aan de selectie van targets voor verdere validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door genmanipulatie te beperken tot blastomeren van de pronefros-lijnage, wat de betrokkenheid van signaalpaden bij organogenese verduidelijkt.
- Assay Readiness: Produceert embryo's met geverifieerde lokalisatie van de tracer, wat gestandaardiseerde immunokleuring en beeldvorming mogelijk maakt voor kwantitatieve pronefros-analyse.
- Analytics: Faciliteert de vergelijking van de pronefrotische structuur en de co-lokalisatie van de tracer om de impact van genfunctie op de nierontwikkeling te evalueren.
- Translationeel onderzoek: Koppelt bevindingen uit de embryonale pronefros aan geconserveerde mechanismen die toepasbaar zijn in modellen voor nieraandoeningen bij zoogdieren.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar voor andere weefsels (bijv. neurale buis, hart) met behulp van hetzelfde kader voor micro-injectie op basis van fate mapping.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de precisie van targetvalidatie door confoundende effecten van wijdverspreide genmodulatie te minimaliseren.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare, schaalbare microinjectie in gedefinieerde blastomeren mogelijk middels gestandaardiseerde preparatie- en incubatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert de triage van de portfolio door duidelijkere genotype-fenotypekoppelingen te bieden in een emitterend orgaansysteem.
- Impact op portfolio: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door vroege mechanistische risicoreductie van niergerelateerde targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Xenopus-embryo's, blastomeeridentificatie en microinjectietechnieken.
- Afhankelijk van functionele injectieapparatuur, waaronder naaldtrekkers, microinjectoren en temperatuurgecontroleerde incubatiesystemen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor embryo-stadiëring, fixatie en immunokleuring om consistentie tussen experimenten te waarborgen.
- Aanpassing aan andere weefsels is afhankelijk van nauwkeurige fate maps en de precisie van de blastomeerdoelwitbepaling.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid van de levensvatbaarheid van embryo's voor temperatuurschommelingen en injectietrauma.
