Name: Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden Xenopus Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Leer micro-injectietechnieken voor nierontwikkeling bij Xenopus laevis embryo's. Deze methode maximaliseert reagensafgifte naar specifieke blastomeren en helpt genfuncties in orgaanvorming te ontrafelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health subsidie ​​NIDDK (K01DK092320) en het opstarten van de financiering van de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Texas McGovern Medical School.

Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston&#39;s Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, dat dient als de institutionele zorg en gebruik Comite (protocol #: HSC-AWC-13-135). 1. Identificatie en selectie van blastomeren voor-Kidney gerichte Injecties <ol><li> Voorafgaand aan productie embryo Gebruik Normal Table of Xenopus Development 21 de oriëntatie van de eerste celdelingen in het embryo begrijpen. Als alternatief, de toegang schema&#39;s van de vroege ontwikkelingsstadia van Xenopus op Xenbase 11. </li><li> Toegang tot de interactieve Xenopus lot van de cel kaarten op Xenbase 11 om te selecteren welke blastomere zal worden gericht voor micro-injectie. </li><li> Merk op dat de enkele cel embryo heeft een donkergekleurde dier paal en een vegetatieve pool, die is wit en Yolky. Merk op dat een beschermend membraan, bekend als de vitelline envelope, heeft het embryo. </li><li> Merk op dat de eerste klieving treedt meestal tussen de linker- en rechterkant van het embryo. Deze cellen in gelijke mate bijdragen aan de pronephric afstamming. </li><li> Merk op dat de tweede splitsing verdeelt de dorsale en ventrale helften van het embryo, waardoor een 4-cel embryo. De dorsale cellen zijn kleiner en hebben minder pigment dan de ventrale cellen (Figuur 2A en Figuur 3A). <ol><li> Identificeer de ventrale blastomeren (V, de grote donkere cellen) links en rechts, waarbij meer de ontwikkelende nier dragen dan de dorsale (D, kleine, lichte cellen) blastomeren (Figuur 2A). </li><li> Als het injecteren in een 4-cel embryo, injecteer de linker ventrale blastomeer naar de linker nier (figuur 3A en deel 3) richten. </li></ol></li><li> De derde splitsing doorsnijdt de dierlijke en plantaardige kanten, waardoor een achtcellige embryo. Op dit moment zijn er vier dieren blastomeren [linker en rechter ventrale(V1) en dorsale (D1)] en vier plantaardige blastomeren [linker en rechter ventrale (V2) en dorsale (D2)] (Figuur 2B en Figuur 3B). <ol><li> Zoek het ventrale, plantaardige blastomeren (V2). Deze blastomeren meer bijdragen aan de ontwikkeling van nieren andere cellen in deze fase (Figuur 2B). Om de linker nier van een 8-cel embryo te richten, te injecteren in de linker V2 blastomere (Figuur 3B en hoofdstuk 3). </li></ol></li><li> Merk op dat de vierde en vijfde breuklijnen halveren van het dier en plantaardige blastomeren. Twee nageslacht wordt geproduceerd uit elk blastomeer, resulterend in een 16-cel embryo. De cellen worden genoemd naar hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2 blastomeer van het 8-cellig stadium ontstaat V2.1 en V2.2 nakomelingen op de 16-cellig stadium (figuur 2C). De V2.2 cel aan het 16-cellig stadium geeft de meerderheid van de cellen die bijdragen tot de ontwikkeling van nieren. </li><li> Let op de zesde en zevende breuklijnen resulteren in een 32-cel embryO. Nogmaals, twee nakomelingen worden geproduceerd uit elk blastomere, die genoemd na hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2.2 blastomeer van de 16-cellig stadium leidt tot V2.2.1 en V2.2.2 bij de 32-cellig stadium. Er is een alternatieve naamgeving systeem de 32-cellig stadium waarin geïdentificeerd zijn in vier rijen A, B, C en D (van dieren bij plantaardig), en vier kolommen 1, 2, 3 en 4 ( van dorsale ventrale). Dus de V2.2.2 blastomeer, waarvan de meest bijdraagt ​​aan de ontwikkeling pronephros, heet C3 onder deze alternatieve naamgeving (figuur 2D). </li></ol> 2. Voorbereiding van embryo&#39;s <ol><li> Bereid 50 ml Dejelly oplossing (2% cysteine, NaOH tot pH 8,0). </li><li> Isoleer beide testes van een mannelijke kikker volgens standaardprotocollen 14. Plaats de testes in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml testes opslagoplossing (1x Marc&#39;s gemodificeerd Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% runderserumalbumine, 50 ug / ml gentamycine). Bewaar de testes bij 4 ° C. Opmerking: Testes kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 7-10 dagen bij 4 ° C, maar bevruchting efficiëntie zal afnemen hoe langer de testes werden vastgelegd. </li><li> Knijp een vrouwelijke kikker om eieren volgens standaardprotocollen 14 te verkrijgen. Verzamel de eieren in een 100 mm petrischaal. Giet het overtollige water. </li><li> Snijd ¼ van een testis terwijl deze in Testikels Storage Solution behulp van een tang en een scheermesje. Transfer het stukje testis aan de petrischaal met eieren. Pas de grootte van de testis gebruikte gedeelte rekening voor de grootte van de testis, hoe lang de testis is opgeslagen, en hoeveel eieren worden bevrucht. Over het algemeen gebruiken ¼ tot 1/3 van een vers ontleed testis een koppeling van de eieren te bevruchten. </li><li> Snijd de testis gedeelte in kleine stukjes met behulp van een tang en een scheermesje. Voeg genoeg 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycine de petrischaal om de eieren te dekken. Swirl de BMR in de schaal te mengen. </li><li> Wacht ongeveer 30 min voor de bevruchting te laten plaatsvinden bij kamertemperatuur. Merk op dat het dier hemisfeer (de gepigmenteerde zijde van het embryo) bovenop het embryo op effectieve bevruchting zitten. Verwijder vervolgens de BMR van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet. Voeg genoeg Dejelly Solution om de schotel naar de embryo&#39;s te dekken. </li><li> In de komende paar minuten zachtjes wervelen de schotel met tussenpozen. Krachtig schudden van de schotel op dit moment kunnen defecten as veroorzaken. &#160; De gelei laag op de embryo&#39;s zal oplossen, en de embryo&#39;s zullen samenkomen in het midden van het gerecht tijdens de wervelende. Zodra de embryo&#39;s sterk op elkaar raken in het midden van de schaal, verwijdert het Dejelly oplossing met een transferpipet. Niet embryo&#39;s in de Dejelly Solution vertrekken langer dan 5 minuten, of de embryo&#39;s kunnen worden beschadigd. </li><li> Was de dejellied embryo 3-5 keer in 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycine door voorzichtig te gieten of pipetteren uit de BMR en het vullen van de schaal met nieuwe MMR. Niet alle MMR uit de schotel of het embryo kan worden beschadigd. </li><li> Verwijder eventuele onbevruchte eieren of stukjes van testis van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet. </li><li> Incubeer embryo&#39;s tussen de 14 en 22 ° C. Opmerking: Embryo&#39;s gekweekt bij lagere temperaturen langzamer ontwikkelen dan embryo&#39;s gekweekt bij hogere temperaturen. Timing van de ontwikkelingsstadia is te vinden op Xenbase 22. <ol><li> Om ruimte hun ontwikkeling plaats helft van de embryo&#39;s van een enkele bevruchting in een petrischaal bewaard bij 14 ° C, en de andere helft van de embryo&#39;s in een petrischaal bewaard bij 18 ° C. Dit maakt twee injecties in 4-cel of 8-cel embryo&#39;s van een enkele bevruchting. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van injectieoplossingen en Micro-injectie van embryo <ol><li> Bereid de injectie oplossing die 0,01ng / nl membraangebonden rood fluorescerend eiwit (RFP-MEM) mRNA 9 terwijl de embryo&#39;s ontwikkelen om de 4-cel of 8-cellig stadium. Bewaar de injectie-oplossing op ijs pas klaar om te injecteren. </li><li> Laad een 7 &quot;vervangingsglas capillaire buis in een naald trekker, waarbij de bovenkant van de vervangende buis uitgelijnd met de top van de naald trekker geval. Zet de warmte # 2 waarde 800, en uitschuifbare waarde 650. Druk de&quot; pull &quot;toets om de naald te trekken. Dit zal 2 naalden te maken van een enkele 7&quot; glazen capillaire buis. </li><li> Knip de punt van een naald getrokken met een paar Dumont tang. Let op: Na het trekken van de naald, is de tip dichtgemaakt en moet worden opengesneden. Hoe dichter bij het punt van de naald die het uitsnijden hoe kleiner de diameter van de naald zijn. Hoewel de diameter van de punt niet van invloed op de injectievolume de micro-injectie systeem hier gebruikt, een tip met een grotere diameter is waarschijnlijk een embryo beschadigen. </li><li> Zet de micropipette Collet op de achterkant van de naald. Vervolgens zet de grote gat O-ring op de achterkant van de naald achter de kraag. </li><li> Vul de naald met minerale olie met behulp van een 27 gauge injectienaald, zorg dat u luchtbellen in de naald niet te krijgen. </li><li> Zet de naald op de plunjer van de microinjector, het plaatsen van de naald in het grote gat van de witte plastic spacer op de plunjer geïnstalleerd. De plunjer moet een kleine O-ring dichtst bij het lichaam van de microinjector, gevolgd door de blanke afstandhouder groot gat O-ring en spantang. Zet de naald door het aandraaien van de kraag. Trek voorzichtig aan de naald om ervoor te zorgen dat deze goed is beveiligd. </li><li> Houd de &quot;lege&quot; knop op de microinjector regelkast tot er twee piepjes. </li><li> Pipetteer 3 pi injectieoplossing op een stuk Parafilm. Steek de punt van de naald in de parel injectieoplossing op de Parafilm. Houd de &quot;vullen&quot; knop op de microinjector schakelkast aan de injectie oplossing in de naald te trekken. </li><li> Vul een 60 mm petrischaal bekleed met 500 micron polyester gaas met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Zorgvuldig pipetteren 20-30 april-cel of 8-cellige embryo in de schaal. </li><li> Met behulp van een haar lus 14, manipuleren van de embryo&#39;s, zodat de blastomere te injecteren wordt geconfronteerd met de naald. Om de linker nier te richten, line-up van de embryo&#39;s, zodat de linker ventrale blastomeren van 4-cellige embryo&#39;s of links V2 blastomeren van 8-cellige embryo gezicht van de naald. </li><li> Injecteer 10 nl injectieoplossing in de geselecteerde blastomeren van elk embryo in de schaal. Opmerking: De mazen onderaan de petrischaal stabiliseert het embryo en stopt de rollen, waardoor ze worden geïnjecteerd zonder het gebruik van een haar lus te stabiliseren. </li><li> Transfer geïnjecteerde embryo&#39;s in putjes van een kweekplaat die worden opgevuld met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Incubeer de geïnjecteerde embryos bij 16 ° C gedurende ten minste één uur, om het geïnjecteerde blastomeren te genezen. </li><li> Breng de genezen embryo&#39;s in putjes van een nieuwe kweekplaat die worden opgevuld met 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine per stadium 9 (voor gastrulatie). </li><li> Incubeer de embryo&#39;s bij 14-22 ° C totdat het embryo bereiken stadium 38-40 21. </li></ol> 4. Fixatie en Immunokleuring van embryo&#39;s <ol><li> Bereid 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfaat / formaline Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) formaldehyde]. </li><li> Met behulp van een overdracht pipet, zet 10-20 stadium 38-40 embryo&#39;s in een glazen flacon. Voeg 10 ul 5% benzocaïne in 100% ethanol aan de flacon en flacon omkeren om te mengen. Wacht 10 minuten om de embryo verdoven. </li><li> Verwijder de MMR uit de flacon met behulp van een glazen pipet. Indien voor flesjes met meerdere tegelijk, kan de flesjes rechtop gehouden in een 24-well celcultuur plaat. </li><li> Met een glas pijptte, vul de flacon met MEMFA. Plaats de flacon op een driedimensionale rocking platform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder de MEMFA uit de flacon met een glazen pipet. Vul het flesje met 100% methanol. Plaats de flacon op een driedimensionale schudapparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap nog een keer, en de embryo&#39;s in 100% methanol gedurende de nacht opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-runderserumalbumine-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml bovine serum albumine, 0,1% Triton X-100. </li><li> Bereid de primaire antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum met een 1: 5 verdunning van monoklonaal antilichaam 4A6, een 1:30 verdunning van muis monoklonale antilichaam 3G8 (aan de membranen van de tussenliggende en distale tubuli verbinden 20 label) (etiket lumen van de proximale tubuli 20), en een 1: 250 verdunning van konijn polyklonaal antilichaam RFP (de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid de secondary antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum, 1: 500 Alexa 488 geit anti-muis IgG (stock concentratie 2 mg / ml; labelen 4A6 en 3G8), en 1: 500 Alexa 555 geit anti-konijn IgG (stock concentratie 2 mg / ml, om de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C, die de buis folie ter bescherming tegen licht. </li><li> U kunt ook het verzamelen van de primaire en secundaire antilichamen na kleuring, en op te slaan bij 4 ° C voor hergebruik in toekomstige experimenten. Als het antilichaam moet worden opgeslagen voor hergebruik, voeg 0,01% natriumazide. </li><li> Immunostain de embryo behulp vastgestelde protocollen 18. </li></ol> 5. Visualisatie van embryo&#39;s en analyse van Gerichte Pronephric Tissue <ol><li> Zeef de immunostained embryo&#39;s om te controleren of de juiste blastomere werd geïnjecteerd door het bekijken van de fluorescentie van de tracer onder een tl-stereomicroscoop bij 1X (op hele embryo te zien) en 5X vergroting (tot nier bekijken). Plaats embryo in een multi-well glasplaat met de weLLS gevuld met 1x PBT met behulp van een overdracht pipet met de tip afgesneden. Manipuleren van de embryo&#39;s met een haar loop. Gebruik alleen embryo&#39;s die de co-geïnjecteerde tracer in de pronephros aan de linkerzijde van het embryo hebben (figuur 3C, F en figuur 4C, F) overexpressie of knockdown analyse. </li><li> Als alternatief duidelijk de embryo&#39;s in Murray&#39;s Clear (2 delen benzylbenzoaat: 1 deel benzylalcohol) door het plaatsen van de embryo&#39;s in een glazen flesje en het vullen van de flacon met Murray&#39;s Clear. Visualiseer de embryo&#39;s met behulp van een glazen plaat goed. Opmerking: Murray&#39;s Clear is een organisch oplosmiddel, en moet met zorg worden behandeld. Draag handschoenen, en alleen gebruik maken van glazen flesjes en pipetten met Murray&#39;s Clear. </li><li> WINKEL embryo bij 4 ° C in 1x PBT gedurende 2-3 weken. Voor langdurige opslag van embryo, dehydrateren de embryo&#39;s door tweemaal in 100% methanol wassen bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Bewaar de embryo&#39;s bij -20 ° C in 100% methanol. </li></ol>

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Gericht op de pronephros van het ontwikkelen van Xenopus embryo&#39;s baseert zich op het identificeren en het injecteren van de juiste blastomere. Injectie van de V2 blastomeer 8-cellige embryo richt zich op de linker pronephros 18. Dit laat de contralaterale rechter pronephros als een interne controle. Als morfolino knockdown of RNA overexpressie wordt gebruikt om nierontwikkeling veranderen, kan de contralaterale rechter pronephros worden gebruikt om de effecten van gen knockdown of overexpressie ...

De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo&#39;s ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros 1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoogdieren en amfibieën vereisen dezelfde signaling cascades en inductieve evenementen om nefrogenese 2, 3 ondergaan. De Xenopus pronephros bevat één nefron bestaat uit proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden, en een glomus (analoog aan het zoogdier glomerulus) 1, 4-6 (figuur 1 </strong&gt;). De enkele, grote nefron in de Xenopus pronephros maakt het geschikt als een eenvoudig model voor de studie van genen betrokken bij nier- ontwikkeling en ziekteprocessen. Lot van de cel kaarten zijn vastgesteld voor de vroege Xenopus embryo&#39;s, en zijn vrij bij Xenbase 11/7 online beschikbaar. We beschrijven een techniek voor micro-injectie van lineage tracers voor de ontwikkeling Xenopus pronephros gericht, hoewel dezelfde techniek kan worden aangepast aan andere weefsels zoals het hart of ogen targeten. Lineage tracers zijn labels (zoals vitale kleurstoffen, fluorescent gelabelde dextranen, histochemisch detecteerbare enzymen en mRNA coderend fluorescerende eiwitten) die kan worden geïnjecteerd in een vroeg blastomeer, waardoor de visualisatie van de nakomelingen van die cel tijdens de ontwikkeling. Dit protocol maakt gebruik van MEM-RFP mRNA coderend membraan gerichte rood fluorescerend eiwit 12, een lijn tracer. De beoogde micro-injectie technieken voor individuele blastomeren in de 4- en 8-cellige embryo beschreven kunnen worden gebruikt voor injectie met morpholinos te breken genexpressie, of exogene RNA een gen van belang tot overexpressie. Door injecteren in de ventrale, vegetale blastomeer, vooral de pronephros van het embryo zal gericht, waardoor de contralaterale pronephros als ontwikkelings controle. Co-injectie van een tracer controleert of de juiste blastomere werd geïnjecteerd, en laat zien welke weefsels in het embryo is ontstaan ​​uit de geïnjecteerde blastomere, het verifiëren van de gerichtheid van de pronephros. Immunokleuring van de pronephros maakt visualisatie van hoe goed de pronephric buisjes zijn gericht. Overexpressie en knockdown effecten kunnen dan worden gemaakt tegen de contralaterale zijde van het embryo, die als ontwikkelings- controle en kan worden gebruikt om de pronephric index 13 berekend. De beschikbaarheid die het lot maps toelaat gerichte micro-injectie technieken worden gebruikt om weefsels oth targetener dan pronephros en co-injectie van een fluorescente tracer kan de gerichte micro-injectie op elk weefsel vóór de analyse worden geverifieerd. Tijdens embryo micro-injectie, dient ontwikkelings temperatuur strak gereguleerd, omdat de snelheid van Xenopus ontwikkeling sterk afhankelijk is 14. Embryo&#39;s worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (14-16 ° C) voor de 4- en 8-cell injecties omdat de ontwikkeltijd wordt vertraagd. Bij 22 ° C, ontwikkeltijd uit stap 1 (1 cel) naar fase 3 (4 cellen) ongeveer 2 uur, terwijl bij 16 ° C ontwikkelingstijd naar fase 3 ongeveer 4 uur. Het duurt ongeveer 15 minuten om een ​​4-cel embryo een 8-cel (stap 4) embryo bij 22 ° C, maar duurt ongeveer 30 minuten bij 16 ° C. Evenzo, bij 22 ° C duurt slechts 30 minuten voor een 8-cellige embryo op weg naar een 16-cel embryo (stap 5). Ditmaal echter 45 minuten bij 16 ° C. Dewaardo or, is het nuttig om langzaam de ontwikkelingssnelheid van de embryo voldoende voor injecties in het 8-cellig stadium schakelen voordat de embryo&#39;s ontwikkelen tot het 16-cellig stadium. Bovendien kan groeitemperatuur gemoduleerd versnellen of vertragen van embryonale ontwikkeling tot de nier volledig is ontwikkeld. De epidermis van kikkervisje stadium Xenopus embryo&#39;s is relatief transparant, zorgen voor gemakkelijke beeldvorming van de ontwikkelingslanden pronephros zonder dissectie of clearing van het weefsel 15. Door de relatieve transparantie van embryonale ontwikkeling, live cell imaging is ook mogelijk 16,17. Whole-mount immunokleuring aan de pronephros visualiseren is mogelijk met gevestigde antilichamen die de proximale, tussengelegen, distale en het aansluiten van buisjes van het podium 38 labelen - 40 embryo&#39;s die het mogelijk maken voor de beoordeling van pronephric ontwikkeling na gerichte manipulatie van genexpressie in Xenopus embryo&#39;s 18-20.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin solution, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Benchtop incubator for embryos.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plasmid</td><td></td><td></td><td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7" Drummond replacement tubes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Microinjection needles.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>For breaking microinjection needle tip.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Microinjector.</td></tr><tr><td>Mineral oil, heavy</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Oil for needles.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hypodermic needle</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Polyester mesh</td><td>Small Parts</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Screw thread vial</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>For fixing, staining, and storing embryos.</td></tr><tr><td>24-well cell Culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumen</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum, New Zealand origin</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 3G8 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label proximal tubules.</td></tr><tr><td>Monoclonal 4A6 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Secondary antibody to label kidney tubules.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>9 Cavity spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optioneel - voor het ophelderen van embryo's</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optioneel - voor het ophelderen van embryo's</td></tr></tbody></table>

micro-injectie techniek om target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; xenopus</em&gt; kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

De embryonale nier van Xenopus laevis (kikker), de pronephros bestaat uit een nefron en kan worden gebruikt als model voor nierziekte. Xenopus embryo&#39;s groot extern ontwikkelen, en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door micro-injectie of chirurgische procedures. Daarnaast zijn lot kaarten vastgesteld voor vroege embryonale ontwikkeling. Gerichte micro-injectie in individuele blastomere die uiteindelijk leiden tot een orgaan of weefsel van belang geven kan worden gebruikt om selectief overexpressie of neerslaan van genexpressie in deze beperkte regio afneemt neveneffecten in de rest van de ontwikkelende embryo. In dit protocol beschrijven we hoe u gebruik maken van gevestigde Xenopus lot toegewezen aan de ontwikkeling van Xenopus nier (de pronephros), door middel van micro-injectie te richten op specifieke blastomeren van 4- en 8-cellige embryo. Injectie van lineage tracers maakt verificatie van de specifieke targeting van de injectie.Na embryo&#39;s ontwikkeld stadium 38-40, whole-mount immunokleuring gebruikt om pronephric ontwikkeling visualiseren, en de bijdrage van doelcellen om het pronephros kan worden beoordeeld. Dezelfde techniek kan worden aangepast aan targeten andere weefseltypen naast de pronephros.

Micro-injecties van 4- en 8-cell Xenopus embryo&#39;s met MEM-RFP mRNA tonen verschillende richten naar de pronephros. Figuur 4 toont stage 40 embryo&#39;s met correcte MEM-RFP mRNA expressiepatronen. Embryo&#39;s werden geïnjecteerd in de linker ventrale blastomeer (figuur 4A) en gesorteerd voor de goede expressiepatroon van MEM-RFP mRNA. Naast expressie MEM-RFP in de proximale, tussenliggende en distale tubuli van de nier verbinden, correct ge...

Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Het algemene doel van deze procedure is om micro-injecties specifiek op de ontwikkelende nier van de xenopus te richten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de ontwikkelingsbiologie, zoals de wijze waarop de nier wordt gevormd en welke genen essentieel zijn voor dit proces. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de afgifte van gemicro-injecteerde reagentia naar een specifiek doelweefsel maximaliseert.Visualisatie van deze methode is belangrijk omdat de identificatie van de juiste blastomeer voor gerichte microinjectie cruciaal is. Om deze procedure te starten, werden beide testikels geïsoleerd van één mannelijke kikker en geplaatst in een petrischaal van 60 millimeter gevuld met 10 milliliter testikelbewaaroplossing. Bewaar de testikels vervolgens bij vier graden Celsius.Vervolgens werden eitjes van een vrouwelijke kikker verzameld in een petrischaal van 100 millimeter. Giet het overtollige water uit de petrischaal af. Snijd daarna een kwart van een testis af in Testes Storage Solution.Breng het stukje testis over naar de petrischaal met de eieren. Snijd vervolgens het deel van de testis in kleine stukjes. Voeg MMR plus Gentamycine toe aan de petrischaal om de eieren te bedekken.Meng ze door de schaal te draaien en wacht vervolgens ongeveer 30 minuten tot de bevruchtingsproces bij kamertemperatuur heeft plaatsgevonden. Na de bevruchting moet de gepigmenteerde zijde van de embryo's naar boven gericht zijn. Verwijder de MMR uit de petrischaal met een transferpipet en voeg voldoende de-jelly-oplossing toe om de embryo's te bedekken.Draai de schaal vervolgens de volgende minuten voorzichtig rond om de geleiomhulling van de embryo's op te lossen. Zodra de embryo's elkaar in het midden van de schaal nauw raken, is de geleiomhulling verwijderd. Verwijder de de-jelly oplossing met een transferpipet.Was vervolgens de gedejelliseerde embryo's 3 tot 5 keer in MMR plus Gentamycine door het MMR voorzichtig af te gieten en de schaal te vullen met nieuw MMR. Verwijder niet al het MMR uit de schaal, omdat dit de embryo's kan beschadigen. Verwijder daarna alle onbevruchte eitjes of stukjes testis uit de petrischaal.Om de ontwikkeling te spreiden, plaatst u de helft van de embryo's van een enkele bevruchting in een petrischaal bij 14 °C, en de andere helft van de embryo's in een petrischaal bij 18 °C. Embryo's zullen bij 14 °C langzamer ontwikkelen dan bij 18 °C. Hierdoor kunnen meerdere sets injecties worden uitgevoerd vanuit één enkele bevruchte batch.Bereid de injectieoplossing voor die 0,01 ng/nl mRNA van het membraangebonden rood fluorescent eiwit bevat. Terwijl de embryo's zich ontwikkelen tot het 4-cel- of 8-celstadium. Bewaar de injectieoplossing op ijs tot gebruik.Laad vervolgens een glazen reservecapillaire buis van zeven inch in een naaldtrekker, waarbij de bovenkant van de reservebuis is uitgelijnd met de bovenkant van de behuizing van de naaldtrekker. Stel de waarde voor hitte twee in op 800 en de trekwaarde op 650, en druk op de trekknop om de naald te trekken. Knip daarna de punt van de getrokken naald af met een Dumont-pincet.Schuif de klem van de micropipet over de achterkant van de naald. Schuif vervolgens de O-ring met het grote gat over de achterkant van de naald, achter de klem. Vul de naald nu met minerale olie met behulp van een hypodermische naald van 27 gauge, waarbij u er zorgvuldig op let dat er geen luchtbellen in de naald terechtkomen.Schuif de naald op de zuiger van de micro-injector, waarbij de naald in het grote gat van de witte plastic afstandhouder wordt geplaatst die op de zuiger is gemonteerd. Zet de naald vast door de klemring aan te draaien. Houd vervolgens de "Empty"-knop op de bedieningskast van de micro-injector ingedrukt tot er twee pieptonen klinken.Pipette vervolgens drie µL van de injectieoplossing op een stukje parafilm. Steek daarna de punt van de naald in de druppel injectieoplossing op de parafilm. Druk op de knop "Fill" op de bedieningskast van de micro-injector en houd deze ingedrukt om de injectieoplossing in de naald te trekken.Voorafgaand aan de micro-injectie is het belangrijk om de vroege celdelingen van het xenopus-embryo te begrijpen. Het eencellige embryo heeft een donker gepigmenteerde animalpool en een vegetalpool die wit en dooryolk is. In het tweecellige embryo vindt de eerste klieving doorgaans plaats tussen de linker- en rechterzijde van het embryo.Deze cellen dragen in gelijke mate bij aan de pronefrotische lijn. De tweede splitsing verdeelt de dorsale en ventrale helften van het embryo, wat leidt tot een embryo met 4 cellen. De dorsale cellen zijn kleiner en bevatten minder pigment dan de ventrale cellen.Indien er in een 4-cel-embryo wordt geïnjecteerd, injecteer dan de linker ventrale blastomeer om de linker nier te targeten. De derde klievingsgang splitst de animale en vegetatieve zijden, wat resulteert in een 8-cel-embryo.Op dit punt zijn er vier animale blastomeren en vier vegetale blastomeren. Om de linker nier van een 8-cellig embryo te targeten, injecteert u in de linker ventrale vegetale blastomeer. Vul vervolgens een petrischaal van 60 millimeter, bekleed met een polyester gaas van 500 micron, met vijf procent fycol in MMR plus Gentamycine.Pipette voorzichtig 20 tot 30 8-cellige embryo's in de schaal. Manipuleer de embryo's met een haarloop zodat de blastomeer die geïnjecteerd moet worden naar de naald is gericht. Om de linker nier te targeten, lijnt u de embryo's zo uit dat de linker ventrale vegetatieve blastomeren van de 8-cellige embryo's naar de naald gericht zijn.Injecteer 10 nanoliters van de injectieoplossing in de geselecteerde blastomeer van elk embryo in de schaal. Breng de geïnjecteerde embryo's vervolgens over naar de wells van een kweekplaat met vijf procent fycol in MMR plus Gentamycine. Incubeer de geïnjecteerde embryo's bij 16 degrees Celsius gedurende ongeveer één tot twee uur om de geïnjecteerde blastomeren te laten herstellen.Breng daarna de gemicro-injecteerde embryo's over naar nieuwe putjes in de kweekplaat gevuld met MMR plus Gentamycine. Incubeer de embryo's bij 14 tot 22 graden Celsius totdat ze stadium 38 tot 40 bereiken. Breng in deze procedure 10 tot 20 embryo's in stadium 38 tot 40 over naar een glazen vial.Voeg 10 µL van vijf procent benzocaïne in 100 procent ethanol toe aan het vial. Meng door het vial om te keren en wacht 10 minuten om de embryo's te anesthetiseren. Verwijder vervolgens de MMR uit het vial en vul het met MEMFA.Plaats het vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur op een driedimensionaal schudplatform. Verwijder na één uur de MEMFA uit het flacon en vul deze met 100% methanol. Plaats het flacon vervolgens gedurende tien minuten bij kamertemperatuur op een driedimensionaal schudplatform.Herhaal deze wasstap nog een keer en bewaar de embryo's gedurende de nacht in 100 procent methanol bij minus 20 graden Celsius. De embryo's zijn nu gefixeerd en klaar voor immunokleuring. Dit schema laat zien welke blastomeer geïnjecteerd moet worden voor targeting van de linker pronefros van xenopus-embryo's in het 8-celstadium, gebruikmakend van Membrane-bound Red Fluorescent Protein mRNA als tracer.De lokalisatie van de tracer na injectie in de linker ventrale vegetale blastomeer is in het rood weergegeven, terwijl de nier in het groen is gelabeld. Deze afbeelding laat zien dat de nier groen is gekleurd met de antilichamen 3G8 en 4A6. Hier is een detailopname van de nierregio die de lokalisatie van de tracer toont, en hier is de samengevoegde afbeelding die de co-lokalisatie van de tracer met de nier laat zien.Hier wordt de confocale afbeelding getoond van de nier van een tweede embryo, gekleurd met 3G8 en 4A6. Dit is de lokalisatie van de rode tracer in de nier en het omliggende weefsel, en dit is de samengevoegde afbeelding die de co-lokalisatie van de tracers 3G8 en 4A6 in de nier laat zien. Voordat u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om bekend te raken met het vroege xenopus-embryo.Hiermee kunt u micro-injecties correct richten aan de hand van de vastgestelde xenopus-atlas. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden aangepast om andere weefsels te targeten, zoals de neurale buis of het hart.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Leer micro-injectietechnieken voor nierontwikkeling bij Xenopus laevis embryo's. Deze methode maximaliseert reagensafgifte naar specifieke blastomeren en helpt genfuncties in orgaanvorming te ontrafelen.

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden

Meer video's verkennen