inkapselen van cytochroom

Het algemene doel van deze procedure is om cytochroom c in Silical sol-gels te inkapselen. Deze gels worden vervolgens superkritisch verwerkt tot bio-aerogels, die gebruikt kunnen worden om stikstofmonoxide snel te herkennen via een gasfasereactie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biosensoring- en bioanalytische velden, zoals welke omstandigheden noodzakelijk zijn om cytochroom c actief te houden wanneer het is ingekapseld in een zeer poreuze aerogel?

Het belang van deze techniek is dat het een eenvoudige procedure is voor het inkapselen van een eiwit in een matrix waarin eiwitten tot nu toe zelden succesvol zijn ingekapseld. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in cytochroom c, kan het ook leiden tot procedurele ontwikkelingen voor het inkapselen van andere eiwitten in aerogels met potentieel belang voor toekomstige bio-analytische apparaten. Maak een oplossing met een concentratie cytochroom c in het bereik van 0,7 tot millimolair.

Evenals een verdunde 0,105 millimolair cytochroom c-oplossing, zoals beschreven in het tekstprotocol. Label vervolgens een wegwerpbeker van 50 milliliter van polypropyleen als Beker A. Plaats de beker op het plateau van een analytische balans en gebruik een glazen pasteurpipet om 1,88 gram tetramethoxysilaan in de beker toe te voegen. Zet de balans op nul.

Pipette vervolgens 2,88 gram methanol in Beker A. Dek Beker A af met parafilm. Voeg daarna een magnetische roerkolf toe aan een wegwerpbeker van 50 milliliter polypropyleen, gelabeld als Beker B, en plaats deze op de weegpan van een analytische balans. Gebruik een glazen pipette om 0,75 gram water en 3,00 gram methanol toe te voegen voordat Beker B met parafilm wordt afgedekt.

Begin met het roeren van de inhoud van Beker B op een roerplaat in een zuurkast. Gebruik vervolgens een spuit om 5 µL ammoniumhydroxidolutie (28,0 tot 30,0%) door de parafilm-afsluiting in het mengsel te brengen terwijl er wordt geroerd. Voeg direct na deze stap de inhoud van Beker A toe aan Beker B. Roer het mengsel 20 minuten lang terwijl het is afgedekt met parafilm.

Terwijl het silica sol-mengsel wordt gemengd, neemt u acht tot negen scintillation vials van polypropyleen en de bijbehorende doppen. Plaats vershoudfolie over het uiteinde van de dop van de vial om een vlak oppervlak te creëren waarop de gel zich kan vormen. Plaats vervolgens de dop eroverheen.

Zorg ervoor dat de vershoudfolie intact blijft in de dop. Zet de vials met de dop naar beneden op het werkvlak, zodat de open onderkanten naar boven wijzen. Snijd vervolgens stukjes parafilm die gebruikt zullen worden om elke vial af te dekken.

Voeg na voltooiing van het mengen van de sol 3 milliliter van het solmengsel toe aan een schoon wegwerpbeker van 50 milliliter van polypropyleen. Gebruik een glazen pasteurpipet om zeer langzaam 500 microliters van de 0,105 millimolaire verdunde cytochroom c-oplossing langs de wand van de beker in het 3 milliliter solmengsel te druppelen gedurende ongeveer één minuut. Zorg ervoor dat het mengsel voorzichtig wordt gewaai terwijl cytochroom c wordt toegevoegd om de vorming van grote rode klompen te voorkomen.

Pipetteer 0,5 milliliters van de resulterende cytochroom c silica sol in elke voorbereide mal. Pipetteer daarnaast 0,5 milliliters van de overgebleven gewone silica sol in één of twee mallen om als controlemonsters te gebruiken tijdens het superkritische drogingsproces. Dek de open bovenzijden van de mallen af met parafilm en plaats ze gedurende de nacht, of gedurende ten minste 12 uur, in de koelkast om sol-gels te produceren.

Haal de mallen uit de koelkast. Verwijder de parafilm van de bovenkant van één mal die een cytochroom c sol-gel bevat, en verwijder ook de dop en de plasticfolie van de onderkant. Voeg wat ethanol uit een spoelfles aan de mal toe en gebruik vervolgens het ronde schijfvormige uiteinde van een spuitenzuiger om de gel voorzichtig uit de mal en in een schoon glazen scintillatieflesje van 20 milliliter te duwen, dat ongeveer 5 milliliters ethanol bevat.

Herhaal deze procedure voor het verwijderen van de gel totdat alle cytochroom c-gels aan het vial zijn toegevoegd en alle silicagels aan een apart vial zijn toegevoegd. Vul de vials vervolgens tot de rand met ethanol. Sluit ze af en bewaar ze tussen 2 en 8 graden Celsius.

Haal de gels gedurende de dag elke vier uur uit de koelkast. Giet de ethanol van de gels af en vervang deze door verse ethanol. Dompel de natte sol-gels gedurende nog eens drie dagen onder in aceton, waarbij de aceton drie keer per dag wordt afgegoten en vervangen door verse aceton.

Koel een apparaat voor kritisch punt drogen af tot 10 graden celsius door de temperatuur van een aangesloten circulator op acht graden celsius in te stellen. Zodra het apparaat 10 graden celsius heeft bereikt, wordt er een lektest op het apparaat uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat is vastgesteld dat het apparaat lekvrij is, worden de natte gels samen met het grootste deel van de aceton voorzichtig uit de scintillatiebuisjes in de drie lange secties van de transportbak gegoten.

Voeg indien nodig meer aceton toe om er zeker van te zijn dat alle gels volledig zijn ondergedompeld in aceton voordat de boot in het apparaat wordt afgesloten. Open de vulklep van het apparaat om kooldioxide toe te voegen. Zodra is waargenomen dat de kooldioxide naar de bodem van het apparaat zakt via het kijkgat van het apparaat, open dan de afvoerklep om gedurende vijf minuten aceton af te voeren.

Het wegzakken van de aceton naar de bodem zal plaatsvinden voordat het apparaat volledig is gevuld met koolstofdioxide. Houd daarom het vulventiel open tijdens het aftappen, zodat het apparaat gevuld blijft worden. Sluit vervolgens het aftapventiel.

Houd de vulkraan een klein beetje open. In het begin bevat het uitvloeiende mengsel water, omdat de aceton niet anhydrisch is. Bevriezing, verstopping en drukopbouw in de afvoerbuis zijn mogelijk.

Als er een verstopping wordt vastgesteld, sluit dan de afvoerklep tot de verstopping is gesmolten. Open vijf minuten later de afvoerklep gedurende nog eens vijf minuten en stel de vulklep zo in dat deze voldoende openstaat zodat het apparaat gedurende de gehele afvoerperiode vol blijft. Sluit na vijf minuten de afvoerklep en laat de vulklep een klein beetje openstaan.

Herhaal deze afgietstap vervolgens nog een keer, vijf minuten later. Zodra de afgietstappen zijn voltooid, sluit u de vulklep en laat u het vloeibare koolstofdioxide aflopen, zodat het niveau net boven de pinnen van de boot zichtbaar blijft door het venster van de apparatus. Stel vervolgens de temperatuur van de aangesloten circulator van de apparatus in op 40 °C om ervoor te zorgen dat het vloeibare koolstofdioxide boven zijn kritische temperatuur en druk komt.

Observe na ongeveer 15 minuten via het venster van de apparatus de overgang van vloeistof naar superkritisch fluïdum, terwijl de vloeistofmeniscus boven de pinnen van het bootje verdwijnt. Open na een equilibratietijd van ten minste 15 minuten de ontluchtingsklep een klein stukje om de afvoer van het superkritische fluïdum te starten. Open de ontluchtingsklep gedurende ongeveer 45 minuten stapsgewijs verder, zodat een constant maar zeer zacht sissend geluid van het ontsnappende fluïdum hoorbaar is en de manometer langzaam afloopt naar nul.

Zodra de druk van het apparaat naar nul is gedaald, opent u de deur van het apparaat. Verwijder de boot. Gebruik een pincet om de vers gedroogde aerogels in schone glazen scintillatie vials te plaatsen.

De cytochroom c silica-aerogels zijn nu klaar voor gebruik om de aanwezigheid van stikstofmonoxidegas aan te tonen, na karakterisering zoals beschreven in het tekstprotocol. Aerogels waarin 15 micromolaire cytochroom c is ingekapseld in 4,4 millimolaire, 40 millimolaire en 70 millimolaire kaliumfosfaatbuffer worden hier getoond in vergelijking met een muntstuk. Hier wordt een representatief spectrum van cytochroom c in buffer getoond, vergeleken met cytochroom c ingekapseld in aerogels onder verschillende omstandigheden.

De soret-piek van cytochroom c bij 409 nanometer blijft in aerogels in wezen onverschuven en vertoont een karakteristieke roodverschuiving wanneer de bio-aerogels worden blootgesteld aan gasvormig stikstofmonoxide. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe silica sol-gels gesynthetiseerd kunnen worden, hoe cytochroom c in deze sol-gels kan worden ingekapseld en hoe deze composiet sol-gels gedroogd kunnen worden tot aerogels. Verdere informatie is te vinden in het tekstprotocol over de karakterisering van de bio-aerogels en over het gebruik van de bio-aerogels voor de detectie van gasvormig stikstofmonoxide.