Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Het algemene doel van dit protocol is om menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren tot volledig gepigmenteerde, mature melanocyten. Deze methode kan helpen bij het identificeren van sleutelfactoren tijdens de ontwikkeling van melanocyten. Daarnaast stelt dit protocol ons in staat om factoren te identificeren die afwijkend zijn tijdens de ontwikkeling van ziekten, alsook om belangrijke geneesmiddelen te screenen tijdens drug discovery.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het ons in staat stelt om grote aantallen volledig gepigmenteerde melanocyten te produceren. Het isoleren van melanocyten van patiënten resulteert doorgaans in relatief weinig cellen. Ontdooi na het aliquoteren en invriezen van het gelatinous protein een aliquot van 1 ml en resuspendeer deze in 19 ml DMEM f12.

Voeg vervolgens vijf milliliters van dit mengsel toe aan een enkele weefselkweekschaal van 10 centimeter. Nadat meerdere van dergelijke schalen zijn voorbereid, kunnen deze gedurende één uur bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Begin daarna met het voorbereiden van schalen gecoat met PO, laminine en fibronectine door eerst PBS met 15 micrograms per milliliter PO aan een kweekschaal toe te voegen.

Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator. Aspireer daarna de oplossing en was de schaaltjes drie keer met 1X PBS. Ga verder met het coaten door 10 ml PBS toe te voegen dat 1 µg/ml muis laminine 1 en 2 µg/ml fibronectine bevat.

Incubeer vervolgens de schalen zoals eerder beschreven. Voeg hiervoor 0,1% gelatine in PBS toe aan een schaal van 10 centimeter. Laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur staan.

Terwijl deze plaat wordt gecoat, worden bevroren embryonale fibroblasten van muizen, of MEF's, in een waterbad van 37 °C geplaatst om ze snel te ontdooien. Aspireer vervolgens de gelatine uit de schaal en zaai de MEF's uit met een dichtheid van ongeveer 50.000 cellen per vierkante centimeter in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum. Na incubatie van de schaal gedurende de nacht bij 37 °C wordt het medium geaspireerd en wordt de voorbereide MEF-plaat gewassen met 1X PBS.

Voeg 10 milliliters van het eerder bereide hESC-medium met humane pluripotente stamcellen, afgekort als hPSCs, toe aan een schaal van 10 centimeter. Nadat de cellen zijn uitgezaaid met een dichtheid van 5 miljoen cellen per schaal, worden de platen geïncubeerd bij 37 degrees Celsius in vijf procent kooldioxide. Voed de cellen dagelijks met 10 milliliters vers hESC-medium.

Inspecteer de plaat vóór aanvang van de differentiatie op kolonies die gedifferentieerde cellen, onregelmatige randen of transparante centra lijken te bevatten. Verwijder dergelijke onregelmatige kolonies mechanisch met een pipet onder een dissectiemicroscoop in een laminaire flowkast. Om een coating met een gelatineus eiwit zoals Matrigel uit te voeren, dient het eiwit eerst in aliquots van één milliliter te worden verdeeld en ingevroren om herhaalde vries-dooi-cycli te vermijden.

Ontdooi vervolgens een bevroren aliquot van 1 ml en resuspendeer deze in 19 ml DMEM f12. Plaats vervolgens 5 ml van dit mengsel in een schaal van 10 cm en laat de schalen één uur incuberen bij RT. Aspireer daarna het gelatineuze eiwit onmiddellijk voor het uitplaten van de cellen en was met DMEM F12. Terwijl deze schaal wordt gecoat, selecteert u een plaat waar de hPSCs een confluentie van ongeveer 80% hebben.

Zuig het hESC-medium af. Was daarna de cellen met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS drie milliliter 0,05%trypsine-EDTA toe aan de plaat.

Schud de schaal vervolgens twee minuten krachtig horizontaal totdat onder een microscoop te zien is dat de MEF's als enkelvoudige cellen beginnen los te laten. Gedurende deze tijd zullen de hPSC-koloniën naar verwachting aan de plaat bevestigd blijven. Aspireer de trypsine zodra de MEF's zijn losgekomen, maar voordat de hPSC-koloniën zijn losgelaten.

Voeg vervolgens 10 milliliters hESC-medium toe aan de plaat, mengandung 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride, een ROCK-remmer. Detacheer daarna de cellen door met een pipet op en neer te bewegen over de kolonies. Keer vervolgens terug naar de schaal met een gelatineus eiwit en aspireer de oplossing.

Was deze kweekschaal met DMEM f12 om alle klontjes te verwijderen. Zaai vervolgens hPSCs uit in een verhouding van 1 op 2. Voeg daarna hESC-medium toe aan de plaat, mengandung 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride, tot een volume van 10 milliliters.

Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Voed de cellen dagelijks met medium aangevuld met ROCK-inhibitor. Wanneer de hPSCs een confluentie van 80% bereiken, kan men overgaan tot het initiëren van de neurale differentiatie; deze tijdstap wordt aangeduid als Dag 0.

Om de differentiatie te starten, worden de cellen op Dag 0 en Dag 1 gevoed met 10 milliliter KSR-differentiatiemedium bevatten 100 nanomolar LDN-193189 (een MP-remmer) en 10 micromolar SB 431542 (een remmer van activine en Nodal). Ga op Dag 2 verder door het medium te vervangen door medium met dezelfde concentraties BNP- en activine- en Nodal-remmers, aangevuld met drie micromolar CHIR99021, een Wnt-agonist. Voed de cellen vervolgens op Dag 3 met KSR-differentiatiemedium, aangevuld met enkel 10 micromolar SB 431542 en drie micromolar CHIR99021.

Bereid een mengsel voor van 75% KSR-differentiatiemedium en 25% N2-differentiatiemedium, dat tevens drie micromolair Wnt-agonist bevat. Voed de cellen op dag 4 en 5 met 15 milliliter van deze vloeistof. Voed de cellen vervolgens op dag 6 en 7 met 15 milliliter medium bestaande uit 50% KSR-differentiatiemedium en 50% N2-differentiatiemedium, aangevuld met drie micromolair CHIR99021, 25 nanogram per milliliter BMP4 en 100 nanomolair EDN3.

Voed de cellen vervolgens op dag 8 en 9 met 20 milliliters van 25%KSR differentiatiemedium en 75%N2 differentiatiemedium, aangevuld met dezelfde concentraties factoren als op dag 6 en 7. Ga op dag 10 verder met de neurale differentiatie door de cellen te voeden met 20 milliliters N2 differentiatiemedium dat drie micromolar CHIR99021, 25 nanograms per milliliter BMP4 en 100 nanomolar EDN3 bevat. Aspireer op dag 11 de oplossing uit de schalen die vooraf waren gecoat met PO laminine 1 en fibronectine.

Laat de platen vervolgens ongeveer 10 tot 15 minuten onafgedekt in een weefselkweekkast staan, zodat ze volledig kunnen opdrogen. Verwijder vervolgens het medium van de cellen van Dag 11 en was deze met PBS. Voeg daarna vier milliliter celdetacheringsoplossing toe aan de schaal en incubeer deze 25 minuten bij 37 °C.

Voeg na incubatie vijf milliliter volledig melanocytmedium toe aan de schaal. Resuspendeer de cellen door handmatig met de pipet op en neer te gaan tot ze van de plaat zijn losgekomen. Breng de suspensie over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen vijf minuten bij 200 Gs. Nadat de cellen zijn geteld met behulp van Trypaanblauw-exclusie en een hemocytometer, worden ze geresuspendeerd in volledig melanocytmedium bij een dichtheid van 2X10⁶ cellen per milliliter.

Pipette druppels van 10 µL van de cel-suspensie op de gedroogde, gecoate schaaltjes. Zorg ervoor dat de druppels dicht bij elkaar liggen maar elkaar niet raken, scherp gedefinieerde randen hebben en niet uitlopen. Laat de druppels 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur staan om de cellen te laten hechten.

Voeg vervolgens langzaam 10 milliliters volledig melanocytenmedium toe aan de schaal, waarbij u erop let de aangehechte cellen niet te verstoren. Plaats de schaal daarna in de incubator. Voed de cellen elke twee tot drie dagen met volledig melanocytenmedium.

Verwacht pigmentatie in clusters van cellen te observeren aan het einde van de eerste week. Passeer de cellen eenmaal per week door ze eerst te behandelen met een celdetacheringsoplossing zoals eerder beschreven. Was de cellen na het verzamelen en centrifugeren tweemaal met puur neurobasaal medium.

Zaai de cellen vervolgens opnieuw uit in een verhouding van één op zes in volledig melanocytenmedium op schaaltjes gecoat met PO, laminine 1 en fibronectine. Na ongeveer 30 dagen differentiatie zullen de cellen sterk gepigmenteerd zijn, wat gemakkelijk zichtbaar is wanneer ze bij een hoge dichtheid worden uitgezaaid of wanneer ze als pellet worden verkregen tijdens het passeren.

Hier wordt een brightfield-afbeelding getoond van cellen uit een transgene psox10 GFP menselijke embryonale stamcellijn, gekweekt tot dag 11 van het beschreven differentiatieprotocol voordat de cellen opnieuw worden geplaatst. In deze culturen zijn duidelijk gedefinieerde donkere ruggen van cellen zichtbaar. Wanneer deze culturen werden beoordeeld op GFP-signaal, waren de donkere ruggen verrijkt met sox10-positieve cellen.

Aangezien sox10 een transcriptiefactor is die wordt opgereguleerd door neurale kamstamcellen en behouden blijft in melanoblasten, suggereren deze resultaten dat deze differentiatiemethode tegen dag 11 verrijkt was met cellen die uiteindelijk melanocyten zullen vormen. Als bewijs hiervoor bevatten de culturen tegen dag 20 van het protocol ongepigmenteerde, rijpende en volledig volwassen gepigmenteerde melanocyten. Op dag 25 worden dezelfde celtypen in de culturen waargenomen.

De aanwezigheid van rijpende en gepigmenteerde melanocyten in deze preparaten wordt bevestigd door kleuring met twee eiwitten die betrokken zijn bij de melanineproductie. TYRP2, dat dient als marker voor zowel melanoblasten als melanocyten, en TYRP1, wat een marker is voor melanocyten in een laat stadium en hier uitsluitend tot expressie komt in gepigmenteerde melanocyten. Zodra dit protocol onder de knie is, kan het worden gebruikt om menselijke pluripotente stamcellen in 25 dagen te differentiëren tot volledig gepigmenteerde rijpe melanocyten.

Het protocol verloopt via de normale ontwikkeling van melanocyten door eerst de status van de neurale lijst en vervolgens het stadium van de melanoblast te doorlopen.