Name: Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer een protocol voor de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen naar volledig gepigmenteerde melanocyten via neurale lijn en melanoblast tussenstadia. Deze methode maakt grootschalige productie mogelijk voor onderzoek naar pigmentatie en ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een beurs voor melanoom onderzoekers van de Joanna M. Nicolay Foundation en door de National Institutes of Health onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dit werk werd verder ondersteund door middel van subsidies uit NYSTEM en de Tri-institutionele stamcel-initiatief (Starr Foundation).

LET OP: De melanocyten protocol hier beschreven werd voor het eerst gedemonstreerd door Mica et al. 1. Voorbereiding van Cultuur Medium, Coated Schotels en onderhoud van hPSCs <ol><li> mediumbereiding Opmerking: Bewaar alle bij 4 ° C in het donker gedurende maximaal 2 weken. Filter alle medium voor sterilisatie. <ol><li> Bereid DMEM / 10% FBS. Meng 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep en 5 ml L-glutamine. Filter voor sterilisatie. </li><li> Bereid hESC-medium. Meng 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamine, 10 ml MEM minimale essentiële aminozuren oplossing, 1 ml β-mercaptoethanol en 5 ml Pen / Strep. Na affiltreren voeg 10 ng / ml FGF-2. </li><li> Bereid KSR-differentiatie medium: Meng 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing en 1 ml β-Mercaptoethanol. Filter voor sterilisatie. </li><li> Bereid N2-differentiatiemedium. Los op 12 g DMEM / F12 poeder in 980 ml ​​dH 2 O. Voeg 1,55 g glucose, 2 g natriumbicarbonaat en 100 mg apo humaan transferrine. Meng 2 ml dH 2 O met 25 mg humane insuline en 40 pi 1 N NaOH; eenmaal opgelost, voeg het mengsel aan het medium. Voeg 100 ul putrescine dihydrochloride, 60 pl seleniet, 100 ul progesteron. Breng het uiteindelijke volume tot 1 l met dH 2 O voor filtering. </li><li> Bereid Volledige melanocyten medium. Combineer 50% Neurobasal medium, 30% Lage glucose DMEM, en 20% MCDB201. Om deze add: 0,8% ITS +, 250 nM L-glutamine, 100 uM ascorbinezuur (L-AA), 50 ng / ml Cholera toxine, 50 ng / ml SCF, 0,05 uM dexamethason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Steriel filter voeg dan de resterende reagentia: 2% B27 supplement, 25 ng / ml BMP4, 3 urn CHIR99021, 500 uM cAMP. </li></ol></li><li> Coating van Cultuur Gerechten <ol><li> Verricht coaten met behulp van gelatine-achtige eiwit zoals Matrigel. Bij de opening, hoeveelheid en vries Matrigel tot 1 ml delen om herhaalde vries dooi c voorkomenycles. Dooi en opnieuw op te schorten een 1 ml bevroren monster met 19 ml DMEM / F12. Plaat 5 ml op een 10 cm schaal. Incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij KT. Zuig het gelatineuze eiwit direct voor het uitplaten van de cellen en wassen met DMEM / F12. </li><li> Verricht coating met behulp van Poly-L ornithin hydrobromide / muis laminine-I / fibronectine (PO / Lam / FN). Coat schotel met PBS dat 15 ug / ml Poly-L ornithin hydrobromide. Incubeer O / N bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Verstuif de oplossing en wassen van de platen met PBS driemaal eerder coaten met PBS dat 1 ug / ml muizen-laminine I en 2 ug / ml fibronectine. Incubeer de gerechten O / N bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. <ol><li> Voorafgaand aan plating cellen, zuigen de oplossing en laat de platen drogen zonder deksel in de weefselkweek kap. Laat de platen drogen gedurende ongeveer 10-15 min. Opmerking: De gerechten zijn droog en klaar voor mobiele plating wanneer kristalstructuren verschijnen op het oppervlak op het oog. de plates kan met PBS dat LAM / FN in de incubator gedurende twee weken, zolang de vloeistof verdampt niet bewaard. De platen kunnen gedroogd bij kamertemperatuur gedurende enkele uren bewaard. </li></ol></li></ol></li><li> Onderhoud van hPSCs Opmerking: hPSCs worden gehandhaafd op 0,1% gelatine en mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in hESC-medium. De cellen dienen om de 6-8 dagen verdeeld. <ol><li> Coat een 10 cm schaal met 0,1% gelatine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Ontdooi bevroren MEFs snel in een 37 ° C waterbad. </li><li> Zuig het gelatine en het bord van de cellen. MEFs plaat bij een dichtheid van ~ 50.000 cellen / cm2 in DMEM / 10% FBS. Incubeer bij 37 ° MEF CO / N voorafgaand aan het toevoegen hPSCs. </li><li> Zuig het DMEM / 10% FBS uit de voorbereide MEF plaat, wassen plaat met PBS en voeg 10 ml hESC-medium met hPSCs. Passage de hPSCs in een verhouding van 1: 5/10 afhankelijk dichtheid voorafgaand aan passage. Opmerking: Als de hPSCs worden ontdooid of gepasseerd als enkele cellen, supcomplement met 10 uM Y-27632 dihydrochloride (Rocki) tot de eerste passage. </li><li> Voeden cellen dagelijks met verse 10 ml hESC-medium. </li><li> Voorafgaand aan het starten van een differentiatie verwijder pluripotente kolonies die verschijnen om gedifferentieerde cellen, onregelmatige randen, of transparante centra 28 bevatten. Mechanisch los en zuig het onregelmatige kolonies met een pipet onder een laminaire stroming kap met een dissectie microscoop. </li></ol></li></ol> 2. Plating van hPSCs voor differentiatie Opmerking: Differentiatie zijn beschreven voor de 10 cm schalen. <ol><li> Bereid 10 cm Matrigel gerechten voordat de differentiatie zoals beschreven in stap 1.3.1. </li><li> Wanneer plating hPSCs een differentiatie beginnen met een plaat van hPSCs een dichtheid klaar voor passage (~ 80% confluent) zuig het hESC-medium, wassen met PBS en voeg 3 ml 0,05% trypsine-EDTA op de cellen. </li><li> Schud de schotel horizontally voor 2 minuten onder te visualiseren onder de microscoop tot MEF tillen als enkele cellen. De HPSC kolonies moet vast blijven zitten als kolonies. </li><li> Zuig het trypsine na de MEF hebben opgeheven, maar voordat de hPSCs kolonies los te maken. </li><li> Voeg 10 ml van hESC-medium dat 10 uM Y-27632 dihydrochloride op de plaat en maak de cellen door pipetteren op en neer over de koloniën. </li><li> Zuig het Matrigel oplossing uit de 10 cm schotel bereid in stap 2.1 en wassen met DMEM / F12 om klonten te verwijderen. Plate de hPSCs bij een 1: 2 verhouding op de Matrigel plaat. Voeg hESC-medium dat 10 uM Y-27632 dihydrochloride tot 10ml. Incubeer bij 37 ° CO / N. Opmerking: Deze laag moet leiden tot ongeveer 100.000 cellen / cm2. </li></ol> 3. Inductie van neurale differentiatie Opmerking: Het onderscheid moet worden gestart (dag 0) als de hPSCs zijn 80% confluent. De cellen kunnen dagelijks worden gevoed met hESC-mediummet 10 pM Y-dihydrochloride 27.632 tot begin de differentiatie. <ol><li> Op dag 0 en dag 1, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium bevattende 100 nM en 10 uM LDN193189 SB431542. </li><li> Op dag 2, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium bevattende 100 nM LDN193189, 10 pM SB431542 en 3 uM CHIR99021. </li><li> Op dag 3, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium dat 10 uM SB431542 en 3 uM CHIR99021. </li><li> Op dag 4 en 5 voer de cellen met 15 ml 75% KSR-differentiatiemedium en 25% N2-differentiatie medium dat 3 uM CHIR99021. Let op: Wees niet gealarmeerd om een ​​grote hoeveelheid van celdood te zien in termen van zwevende cellen. Dit is normaal en te verwachten. </li><li> Op dagen 6 en 7 voer de cellen met 15 ml 50% KSR-differentiatiemedium en 50% N2-differentiatiemedium beide met 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3. </li><li> Op dagen 89 en voer de cellen met 20 ml 25% KSR-differentiatiemedium en 75% N2-differentiatiemedium beide met 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3. </li><li> Op dagen 9 en 10 voor te bereiden PO / Lam / FN gerechten zoals aangegeven in 1.2.2 voor re-plating van de cellen op dag 11. </li><li> Op dag 10 voer cellen met 20 ml N2-differentiatie medium dat 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3. </li></ol> 4. replating in Droplets voor NC Specification <ol><li> Op dag 11 aspireren Lam / FN van de voorbereide PO / LAM / FN borden en droog volledig. </li><li> Verwijder medium uit de Dag 11 cellen, wassen met PBS en voeg 4 ml cel onthechting oplossing zoals Accutase per 10 cm schotel. Incubeer gedurende 25 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 5 ml Volledige Melanocyte medium om de schotel en resuspendeer de cellen door handmatig en neer te pipetteren met een 10 ml pipet totdat alle cellen van de plaat zijn opgeheven. Breng de suspensie aan een 15 ml buis. </li><li> Spin decellen die voor 5 min bij 200 xg en resuspendeer de cellen bij 2 x 10 6 cellen per ml in volledig medium melanocyten. Tel de cellen met behulp van de trypan blauw exclusie op een hemocytometer of gelijkwaardige techniek. </li><li> Plaat 10 pl druppels dicht bij elkaar (zonder aan te raken) op de gedroogde PO / Lam / FN 10 cm schalen. Als de plaat voldoende is gedroogd, moet de druppels goed gedefinieerde randen en niet lopen. Opmerking: Dit creëert een hoge dichtheid omgevingskwaliteit cellen, wat belangrijk is wanneer de cellen opnieuw platen, met behoud van ruimte in de schotel voor uitbreiding. </li><li> Laat de druppels bij kamertemperatuur staan ​​gedurende 10-20 minuten om cellen te hechten, dan langzaam (niet de gehechte cellen verstoren) voeg 10 ml van volledige Melanocyte medium. Verplaats schotel naar de incubator. </li></ol> 5. Uitbreiding Melanocyt Progenitors <ol><li> Blijven voeden met Full Melanocyt medium elke 2 tot 3 dagen. Opmerking: pigmentatie moet beginnen zichtbaar w te zijnedurende clusters van cellen door het einde van de eerste week en wordt duidelijk door de tweede week. Bekijk de plaat op een witte achtergrond, zoals een vel papier om deze vroege kleine, donkere clusters onderscheiden. Cellen zullen geleidelijk gepigmenteerde loop van de tijd, totdat de hele plaat gelijkmatig gepigmenteerde (zie figuur 2B). </li><li> Passage cellen eenmaal per week in een verhouding van ~ 1: 6 (plateren zoals druppels niet langer noodzakelijk in dit stadium). Gebruik Accutase om cellen te scheiden en tweemaal wassen met gewoon Neurobasal medium vooraleer opnieuw plating in Full Melanocyt medium. Handhaaf cellen op PO / LAM / FN platen. Let op: We hebben gemerkt dat de Full Melanocyt medium is het meest geschikt voor het behoud en de uitbreiding van hESC en iPSC-afgeleide melanocyten. Echter kunnen cellen kort gekweekt in commercieel verkrijgbaar M254 medium maar de vereenvoudigde media verhoogt het risico van afsterven en tillen van de plaat. </li></ol>

<ol><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li>
<li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat methods. 7, 25-27 (2010).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2FGlutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Diamond+Blackfan+Anemia+in+Vivo+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Blood. 124, (2014).</li>
<li>Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammed+Cells+for+Disease+Modeling+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine.</a> Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> Embo J. 33, 409-417 (2014).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest+and+the+opportunities+of+life+on+the+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge.</a> Dev biol. 275, 1-11 (2004).</li>
<li>White, R. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+in+development%2C+regeneration%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Melanocytes in development, regeneration, and cancer.</a> Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phox2b+function+in+the+enteric+nervous+system+is+conserved+in+zebrafish+and+is+sox10-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+develop%22%5BJournal%5D)">Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent.</a> Mech develop. 122, 659-669 (2005).</li>
<li>Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+proteins+in+melanocyte+development+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigm+cell+melanoma+r%22%5BJournal%5D)">Sox proteins in melanocyte development and melanoma.</a> Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).</li>
<li>Herbarth, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Sry-related+Sox10+gene+in+Dominant+megacolon%2C+a+mouse+model+for+human+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease.</a> PNAS. 95, 5161-5165 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat genetics. 18, 60-64 (1998).</li>
<li>Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+3+induces+the+reversion+of+melanocytes+to+glia+through+a+neural+crest-derived+glial-melanocytic+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor.</a> PNAS. 97, 7882-7887 (2000).</li>
<li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126, 3757-3767 (1999).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127, 5379-5389 (2000).</li>
<li>Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MITF%3A+master+regulator+of+melanocyte+development+and+melanoma+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+mol+med%22%5BJournal%5D)">MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene.</a> Trends mol med. 12, 406-414 (2006).</li>
<li>Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-KIT+signaling+depends+on+microphthalmia-associated+transcription+factor+for+effects+on+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation.</a> PloS one. 6, e24064(2011).</li>
<li>Grichnik, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+expression+reveals+a+population+of+precursor+melanocytes+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+invest+dermatol%22%5BJournal%5D)">KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin.</a> J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J cell sci. 123, 853-860 (2010).</li>
<li>Nishimura, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+role+of+the+niche+in+melanocyte+stem-cell+fate+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination.</a> Nature. 416, 854-860 (2002).</li>
<li>Zur Nieden, N. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZur+Nieden%2C+NI+%22Embryonic+stem+cell+therapy+for+osteo-degenerative+diseases+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-content+screening+for+novel+pigmentation+regulators+using+a+keratinocyte%2Fmelanocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+dermatol%22%5BJournal%5D)">high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system.</a> Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.

Voor de succesvolle differentiatie van melanocyten uit hPSCs de volgende suggesties in overweging moeten worden genomen. Allereerst is het noodzakelijk om onder steriele kweekomstandigheden te allen tijde. Daarnaast is aangevangen met pluripotente volledig ongedifferentieerde hPSCs; indien de startpopulatie gedifferentieerde cellen bevat zal de opbrengst steeds dalen als de verontreinigingen niet kunnen worden gericht op melanocyten en kunnen verder verstoren de juiste differentiërende cellen. <p class="jove_content...

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) bieden een platform om de normale differentiatie na te bootsen in een schaalbare manier voor de ziekte modelleren, drug discovery, en cel vervangende therapieën 1-6. Van bijzonder belang, hPSCs openstellen van mogelijkheden voor het bestuderen van moeilijk te isoleren of zeldzame / transient types cel waar de patiënt monsters zijn schaars. Bovendien, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) onderzoekers in staat om ontwikkeling en ziekte modelleren studeren in een patiënt specifieke manier om unieke mechanismen 1,2,7-11 ontrafelen. De eerder gepubliceerde protocol voor differentiatie van melanocyten uit hPSCs is maximaal 6 weken differentiaties en omvat het kweken van cellen met geconditioneerd medium van L- Wnt3a 12 cellen. Het protocol voor het eerst gepresenteerd door Mica et al., En hier beschreven produceert gepigmenteerde cellen in drie weken en verwijdert de dubbelzinnigheid en inconsistenties in verband met geconditioneerd medium. melanocyten are afgeleid van de neurale kam, een trekkende populatie cellen uniek vertebraten. De neurale gedefinieerd tijdens gastrulatie en vertegenwoordigt een populatie cellen aan de rand van de neurale plaat, grenzend tussen de neurale en niet-neurale ectoderm. Tijdens neurulatie, het zenuwweefsel evolueert van een neurale plaat neurale plooien, die convergeren in de dorsale middellijn waardoor de neurale buis 13,14 vormen. De neurale cellen die voortkomen uit de dakplaat van de neurale buis, tegenover de notochord en een epitheliale naar mesenchymale transitie ondergaan vóór de migratie weg om tot een diverse bevolking van gedifferentieerde cellen te geven. Het lot van de kam cellen op een deel van de anatomische locatie van de dakplaat langs de lichaamsas van het embryo. Neurale cel derivaten omvatten lineages kenmerkend zowel mesoderm (gladde spiercellen, osteoblasten, adipocyten, chondrocyten) en ectoderm (melanocyten, Schwann cells, neuronen) 14. Neurale stamcellen reguleert de transcriptiefactor SOX10 en kan worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering met antilichamen tegen p75 en HNK1. De neurale cellen gedoemd om te worden melanocyten passeren een melanoblast podium en upregulate KIT en MITF (-microphthalmia geassocieerde transcriptiefactor) 6,21 MITF is een meester regulator van melanocyten ontwikkeling en is een transcriptiefactor die verantwoordelijk is voor het besturen van een groot deel van melanocyten ontwikkeling 22- 24. Menselijke melanoblasten migreren naar de basale laag van de epidermis wanneer zij ofwel in het haar of uitstulping omgeven door keratinocyten in de epidermis (pigmentatie vormende eenheden) fungeren als voorlopers van de rijpe, gepigmenteerde melanocyten bevinden. De differentiatie en rijping van melanoblasten in gepigmenteerde melanocyten gebeurt gelijktijdig met de kolonisatie van de haarbol en expressie van het melanine traject (TYRP1, TYR, en OCA2PMEL) 25,26. Het isoleren van menselijke melanocyten en melanoblasten van patiënten is duur, moeilijk en het beperken in kwantiteit. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om hPSCs (geïnduceerd of embryonale) in de melanocyten of melanocyt voorlopers differentiëren in een goed gedefinieerde, snelle, reproduceerbare, schaalbare en goedkope methode zonder celsortering. Het protocol werd vroeger gebruikt om de ziekte-specifieke afwijkingen identificeren wanneer differentiëren iPSCs van patiënten met pigmentatie stoornissen.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo human transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (B27 Supplement)</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R&amp;D Systems</td><td>4423</td><td>6 mM</td></tr><tr><td>Cholera toxin</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>cAMP (cyclicAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 &mu;M</td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 powder</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (Endothelin-3, human)</td><td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 &mu;M</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>200 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>gelatin (PBS without Mg/Ca)</td><td>in house</td><td></td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Human insulin</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Universal Culture Supplement Premix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (Knockout Serum Replacement)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Low glucose DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Dissolve 1:20 in DMEM/F12</td></tr><tr><td>MCDB201 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM minimum essential amino acids solution</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin-I</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml</td></tr><tr><td>Poly-L Omithin hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>0.032 g in 100 ml 100% ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (Recombinant human FGF basic)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R&amp;D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human)&nbsp;</td><td>Peprotech Inc.</td><td>300-07</td><td>50 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>TYRP1 (G-17) Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>TYRP2 Antibody</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris-R&amp;D Systems</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

feeder-vrij afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vormen een platform om menselijke ontwikkeling in vitro te bestuderen onder zowel normale als ziektecondities. Onderzoekers kunnen de differentiatie van hPSC's richten naar het celtype van belang door de kweekomstandigheden te manipuleren om signalen na te bootsen die tijdens de ontwikkeling worden gezien. Een van deze celtypen is de melanocyt, een pigmentproducerende cel van neurale-kam (NC) oorsprong die verantwoordelijk is voor de bescherming van de huid tegen UV-straling. Dit protocol presenteert een uitbreiding van een momenteel beschikbaar in vitro Neurale-kam differentiatieprotocol van hPSC's om NC verder te differentiëren in volledig gepigmenteerde melanocyten. Melanocyt-precursors kunnen worden verrijkt uit het Neurale-kam protocol via een getimede blootstelling aan activatoren van WNT-, BMP- en EDN3-signalering onder dubbel-SMAD-remmingscondities. De resulterende melanocyt-precursors worden vervolgens gezuiverd en gerijpt tot volledig gepigmenteerde melanocyten door cultuur in een selectief medium. De resulterende melanocyten zijn volledig gepigmenteerd en kleuren op de juiste manier voor eiwitten die kenmerkend zijn voor rijpe melanocyten.

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het afleiden volledig gepigmenteerde volwassen melanocyten uit hPSCs in een in vitro voedingsvrije, kostenefficiënt en reproduceerbare wijze. In tegenstelling tot de eerder vastgestelde Fang et al. Protocol HPSC-afgeleide melanocyten, heeft de geschetste protocol niet geconditioneerd medium vereist en vermindert de vereiste tijd. Fang et al. Protocol gebruikt geconditioneerd medium van een Wnt3a-producerende cellijn van...

Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Het algemene doel van dit protocol is om menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren tot volledig gepigmenteerde, mature melanocyten. Deze methode kan helpen bij het identificeren van sleutelfactoren tijdens de ontwikkeling van melanocyten. Daarnaast stelt dit protocol ons in staat om factoren te identificeren die afwijkend zijn tijdens de ontwikkeling van ziekten, alsook om belangrijke geneesmiddelen te screenen tijdens drug discovery.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het ons in staat stelt om grote aantallen volledig gepigmenteerde melanocyten te produceren. Het isoleren van melanocyten van patiënten resulteert doorgaans in relatief weinig cellen. Ontdooi na het aliquoteren en invriezen van het gelatinous protein een aliquot van 1 ml en resuspendeer deze in 19 ml DMEM f12.Voeg vervolgens vijf milliliters van dit mengsel toe aan een enkele weefselkweekschaal van 10 centimeter. Nadat meerdere van dergelijke schalen zijn voorbereid, kunnen deze gedurende één uur bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Begin daarna met het voorbereiden van schalen gecoat met PO, laminine en fibronectine door eerst PBS met 15 micrograms per milliliter PO aan een kweekschaal

feeder-free-derivation-melanocytes-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.

Isoleren Primaire Melanocyte-achtige cellen van de Muis van het Hart

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Neurale lijst (NC) cellen afkomstig van menselijke pluripotente stamcellen (HPSC) hebben een groot potentieel voor het modelleren van de menselijke ontwikkeling en ziekte en voor celvervangingstherapieën. Hier, een voedingsvrije aanpassing van de momenteel...

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Dit document meldt dat de toevoeging van Y-27632 aan TIVA medium de opbrengst van melanocyten uit volwassen huidweefsels aanzienlijk kan verhogen.

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Leer een protocol voor de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen naar volledig gepigmenteerde melanocyten via neurale lijn en melanoblast tussenstadia. Deze methode maakt grootschalige productie mogelijk voor onderzoek naar pigmentatie en ziekten.

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen