Name: Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer hoe je nasale epitheelcellen van kinderen kweekt en reprogrammeert naar iPSCs met lentivirale transductie. Deze niet-invasieve methode biedt een betrouwbare bron voor astma- en luchtwegonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de pluripotente Stem Cell Facility en de confocale Imaging Core op Cincinnati Children&#39;s Hospital te erkennen. Dit werk werd ondersteund door R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) en 2U19AI70235 (GKKH).

Het volgende protocol volgt de richtlijnen van de instellingen menselijk onderzoek ethische commissie. 1. Sampling het neusslijmvlies OPMERKING: Zorg monsters van patiënten die vrij zijn van symptomen van de luchtwegen virale infectie. <ol><li> Bereid een 15 ml conische verse voordat de deelnemer bezoek en voeg 2 ml BEGM (bronchiale epitheelcellen Growth Medium) plus 20 ul steriel Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> Open cytologie borstel net voor het nemen van het monster, en zorg ervoor dat borstel steriel te houden en het niet aanraken om elk oppervlak naast de nasale oppervlakken. </li><li> Vraag deelnemer om stil te zitten en tilt hoofd omhoog naar het plafond. Hebben kleinere of meer onrustige kinderen zitten op hun handen en / of liggen om te voorkomen swatting borstel weg. </li><li> Richt borstel aan de achterkant van de neus, waar de doorgang vernauwt (Ziet eruit als een klein zwart gat). Schuif borstel naar beneden en draai de polsen als de borstel nostri wordt verwijderdl. </li><li> Plaats de borstel in conische en dompel in BEGM. Snijd overtollig borstel en dop te vervangen op de buis. NIET VORTEX. LET OP: Als de deelnemer bereid is, het verkrijgen van een tweede borstel op dezelfde manier, maar in de tweede neusgat. Het verkrijgen van een poetsen van beide neusgaten leidt tot een grotere kans dat de bemonstering succesvol zal zijn. Bemonstering van hetzelfde neusgat kan leiden tot bloeden en zal waarschijnlijk niet verbeteren van het monster. </li><li> Houd monsters zo dicht mogelijk bij 37 ° C mogelijk tijdens transport met een bekerglas met warm water. </li></ol> 2. celgetal en Cytospin <ol><li> Schud voorzichtig de borstel in BEGM en neem 10 ul van het monster voor een telling cel met behulp van een hemacytometer. Voeg 10 ul van een levende / dode vlek tellen alleen levende cellen onder een microscoop. </li><li> Neem 50 pi van het monster en verdun tot 200 gl met 1x PBS. Naar cytospin trechter bevestigd aan glasplaatje en centrifugeren bij 300 rpm gedurende 2 min. Laat schuif droge O / N en vlek dia followininstructies g fabrikant. Laat O / N drogen, bij voorkeur in het donker. </li><li> Vlek Slide met Hema 3 Stain <ol><li> Transfer elke oplossing (Hema fixatief, lichtblauw, Hema 3 Solution I, roze en Hema 3 Solution II, diep blauw) in een kleuring schotel; Houd bedekt wanneer niet in gebruik. Plaats dia&#39;s in slide kleuring boot </li><li> Dip dia&#39;s voortdurend in fixatief gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia&#39;s continu in oplossing I gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia&#39;s continu in oplossing II voor 30 sec, dan laat overtollige uitlekken </li><li> Spoelen met gedemineraliseerd water tot het water helder is. Laten drogen O / N bij voorkeur in het donker </li></ol></li><li> Kijk naar dia onder de microscoop en tellen cellen te bepalen percentage van de epitheelcellen. Zou moeten zijn 90% of meer indien de monsterneming is goed. </li></ol> 3. Seeding Cellen OPMERKING: Voer alle celcultuur procedures op de juiste en gecertificeerde weefselkweekkap met behulp van steriele techniek. <ol><li> Coat platen met Bovine Collagen Dermaal (BDC), het type 1. Voeg 0,5 ml van 3 mg / ml BDC verdund in 49,5 ml 1x PBS. Bereid minder als slechts een enkele plaat worden gebruikt. Coat een T25 kolf met 2 ml BDC en incubeer in steriele kap O / N of bij 37 ° C gedurende 2 uur, indien nodig. </li><li> Na incubatie zuig resterende vloeistof. Expose kolven aan UV-licht voor 30min in steriele kap. Store kolven voor maximaal een maand bij 4 ° C, maar breng ze naar kamertemperatuur of 37 ° C voor het zaaien cellen. </li><li> Houd borstel en cellen in BEGM bij 37 ° C tot klaar aan zaad. Voorzichtig swish borstel binnen conisch, maar niet vortex. <ol><li> Plaat 7 x 10 5 cellen in een T25 fles. Als er minder, een kleinere houder, zoals een putje van een 6-wells plaat. Deze omvang plaat vereist ongeveer 3 x 10 5 cellen. LET OP: Als er niet zoveel cellen, is het niet raadzaam om verder te gaan. </li></ol></li><li> Onder een steriele kap, neem borstel uit de buis en gently roteren borstel op het oppervlak van de gecoate fles, zorg dat u de coating niet bekrast. Gooi penseel in een geschikte biohazard container. </li><li> Langzaam pipet de resterende cellen in BEGM uit de conische en in de T25 fles. Houd u aan de cellen onder de microscoop. Een aantal drijvende cellen worden waargenomen en kan er enige vuil van de neus, die in dit stadium (figuur 3A) aanvaardbaar zijn. </li></ol> 4. Cell Culture <ol><li> Na het zaaien cellen, laat ze genoegen nemen met 48 uur zonder onderbreking (figuur 3). Na 48 uur, langzaam en voorzichtig voeg 2 ml warm BEGM en 20 ul steriel penicilline / streptomycine / Fungizone (P / S / F). LET OP: NIET zuig het oorspronkelijke 2 ml media. </li><li> Op de 4de dag na het uitzaaien, zuig zorgvuldig alle vloeibare en vervangen door 4 ml vers verwarmd BEGM plus 1x Pen / Strep (fungizone niet meer nodig). Wijzig de media om de twee dagen en cellen hechten beoordelenment, groei en samenvloeiing. Wanneer cellen te bereiken ~ 80% confluentie, meestal in 2-3 weken, zijn ze klaar om te worden gepasseerd. </li><li> Een T25 fles (ongeveer 2,5 x 10 6 cellen wanneer confluent) kan worden gepasseerd in drie T25 flessen of een T75 kolf. Na de eerste passage, moeten de cellen robuust en gezond, tot confluentie ongeveer drie dagen. </li></ol> 5. Passage Cells <ol><li> Zuig het materiaal uit de plaat. Voeg 1 ml 0,05% trypsine oplossing per T25 fles aan de plaat en plaats in de incubator gedurende 4 min of totdat cellen los van de plaat. Controleer het niveau van onthechting van de cellen om de 2 min en niet verlaten trypsine op meer dan 10 min. </li><li> Voeg 5 ml trypsine neutraliserende oplossing (TNS) of serum-bevattende media om het enzym te neutraliseren. Verwijder alle vloeistof en cellen uit de kolf en plaats in een 15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg (versnelling 0 deceleratie 0) gedurende 5 min een celpellet te verkrijgen. aspireren Supernatant en resuspendeer cellen in BEGM + P / S in het gebruikte volume van de nieuwe flessen (4 ml voor een T25 kolf 10 ml van een T75 kolf) </li><li> Voer celgetal met een live / dode vlek zoals hierboven (2.1) beschreven. Voeg juiste hoeveelheid BEGM en cellen voor de beklede kolven en terug naar de incubator. Handhaaf gedetailleerde boven of worden ingevroren in invriesmedium (70% BEGM, 20% FBS en 10% DMSO) bij een concentratie van 0,5-2 x 10 6 cellen per ml. </li></ol> 6. herprogrammeren om iPSCs LET OP: Voor het genereren van iPSCs, zorgen voor naleving van alle institutionele regels voor de productie en het gebruik van menselijke iPSCs. Steriele techniek is vooral belangrijk voor iPSC culturen, als kweekmedium antibiotica niet routinematig bevat. Het is cruciaal dat NEC&#39;s gezond lijken en zijn robuust proliferatieve voor een succesvolle herprogrammering. <ol><li> Plate 5 x 10 5 NEC&#39;s per putje van een 6-well weefselkweek plaat. Na 24 uur, voeg polybreenBEGM om tot een eindconcentratie van 8 ug / ml en transduceren NEM door toevoeging lentivirale deeltjes expressie Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc aan de media. Streven naar een veelvoud van infectie (MOI) te realiseren van 5 ~ 27. <ol><li> Om het bepalen van de MOI, voor te bereiden seriële verdunningen van de geconcentreerde-lentivirale voorraad en transduceren HT1080 cellen met deze verdunningen. Na eerste ondubbelzinnige detectie van dTomato expressie in HT1080 cellen, bereken het aantal &quot;transducerende eenheden / ml&quot; door het scoren van het aantal dTomato-positieve cellen / kleine klompjes cellen bij elke verdunning. LET OP: Typisch, zal er verdunningen die te hoog zijn (alles is dTomato positief) en te laag is (geen of slechts een paar positieve cellen). </li><li> Voer scoren uit de verdunningen waarin discrete positieve cellen / kleine klompjes cellen geïdentificeerd. Bepaal de titer door het corrigeren van het aantal transducerende eenheden / ml met de juiste verdunningsfactor. MOI is dan de verhouding van het aantalgetransduceerde cellen om het aantal virusdeeltjes 27. OPMERKING: Elke dTomato positieve cel / klein groepje wordt verondersteld afkomstig te zijn uit een enkel virusdeeltje. </li></ol></li><li> Ongeveer 3 uur na transductie, verwijder de media en te vervangen door frisse BEGM. Gooi lentivirus-bevattende media met behulp van institutioneel-goedgekeurde procedures. Terugkeren getransduceerd NEC de incubator gedurende 3 dagen. </li><li> Op dag 3, vervangen met verse media BEGM, en incubeer gedurende nog 3 dagen. Zuig doorgebracht media, cellen te wassen met 1x PBS en voeg 1 ml 0,05% trypsine-oplossing naar de bron. Passage cellen met trypsine zoals hierboven (hoofdstuk 5) geschreven. aspireren supernatant en resuspendeer cellen voorzichtig in 4 ml BEGM + P / S. Cellen kunnen worden gepasseerd om een ​​nieuwe put van een 6 wells plaat bekleed met BDC, of ​​toegevoegd aan MEF culturen, als klaar (zie volgende stap). </li><li> Bereid MEF beklede platen. Op dag 4 voeg 0,1% gelatine-oplossing (1 ml / putje) tot 2 putjes van een 6 putjes (+/- uitvoeren Thiazovivin (SPT) zie stap 6,6). Op de volgendedag ontdooien een flacon geïnactiveerd MEFs 28. </li><li> Plaats MEF in 10 ml van MEF media (DMEM + 1x NEAA + 10% DFC&#39;s). Spin bij 200 xg gedurende 5 minuten tot pellet. Resuspendeer in MEF media. Aspireren gelatine van 6 well plaat en voeg 1,87 x 10 5 MEF per putje van de gelatine-gecoate plaat met 6 putjes. Incubeer O / N bij 37 ° C, of ​​gedurende ten minste 24 uur. </li><li> Overdracht 2 ml BEGM bevattende getransduceerde cellen per putje in 2 putjes van een eerder beklede plaat met 6 putjes en incubeer O / N. Op de volgende dag vervangen BEGM met 2,5 ml per putje van standaard hESC media met 4 ng / ml basische fibroblast groeifactor. Voeden cellen met verse hESC media +/- SPT daags gedurende 10 dagen LET OP: Het is mogelijk om een cocktail van kleine moleculen (SB431542, PD0325901 en Thiazovivin (SPT) cocktail) toe te voegen aan de efficiëntie en de kinetiek van herprogrammering voor NECs 23 te verbeteren. </li><li> Na tien dagen blijven dagelijks voeden met behulp van hESC media zonder SPT. Feed culturen dagelijks tot hESC-achtige koloniesverschijnen (Figuur 5A, P0 kolonie). Identificeer kolonies herbergen vermeende iPSCs door hun hoge kern: cytoplasma-verhouding en prominente nucleoli. </li><li> Handmatig accijnzen en overdracht kolonies met hESC-achtige morfologie te putten scheiden voor cultuur en uitbreiding als afzonderlijke lijnen in een feeder-free-systeem. Weggesneden kolonies moet snel aan te passen aan deze voorwaarden. <ol><li> Na plating weggesneden kolonies deze discrete vermeende iPSC lijnen nu worden beschouwd passage 1 (P1). Feed culturen per dag met mTeSR1. Passage en uit te breiden iPSC lijnen met behulp van standaard procedures. Het kan enkele dagen duren om een ​​week voor p1 kolonies op de grootte waarop ze moeten worden gepasseerd bereiken. </li></ol></li></ol> 7. Handhaving iPSCs in Cultuur <ol><li> Voeden en culturen dagelijks te evalueren. Handmatig accijnzen gebieden tentoonstellen openlijke differentiatie door schrapen met een steriele glazen pipet of micro pipet tip. Verander media na dag plukken. </li><li> Passage cellen na approximadellijk elke vier dagen: voorzichtig aspiraat media, voeg 1 ml warm Dispase (1 mg / ml) per putje van een 6-well plaat (half feeding volume), vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende ongeveer 4 minuten. De randen van de kolonies zal beginnen op te heffen, die eruit ziet als een wit overzicht rond de kolonie. Zuig voorzichtig het Dispase en was 3x met verwarmde DMEM / F12. </li><li> Voeg 2 ml mTeSR1 en het gebruik van een cel lifter naar de koloniën te tillen van de plaat. Gebruik een 5 ml serologische pipet of P1000 micropipet om voorzichtig vermaal de cellen tot de kolonies worden opgesplitst in kleinere clusters. <ol><li> Voorkomen die zeer kleine clusters of enkelvoudige cellen, zoals overleving en daaropvolgende proliferatie suboptimaal zijn. Bij het opnieuw uitplaten kolonies, een 1: 4 tot 1: 6 wordt gespleten optimale kolonie dichtheid handhaven. Voorzichtig koloniën en media te verwijderen uit de plaat en toe te voegen aan nieuwe, Matrigel beklede putjes. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Nasale epitheelcellen (NEC) zijn een toegankelijk platform voor het bestuderen van luchtwegaandoeningen en NEC-iPSCs bieden een spannende laan aan de ziekte ontwikkeling, de behandeling en therapie 1,31,32 verkennen. NEC&#39;s kunnen gemakkelijk worden verkregen zonder stress of potentieel schadelijke procedures 6,23. In onze ervaring, wordt de bemonstering van het neusslijmvlies zoals beschreven in dit protocol minder stressvol en beter ervaren dan bloedafname voor de kinderen te zijn. Daarom is d...

Geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke monsters (hiPSCs) zijn een snel ontwikkelende technologie van stamcelonderzoek. Ze bieden een alternatief voor embryonale stamcellen (hESC) onderzoek met veel minder ethische en morele bezwaren 1,2. Hoewel ze niet epigenetisch identiek hESCs 3-5, hiPSCs bieden een unieke manier om ontwikkeling en ziekte fenotypes modelleren, en ze kunnen worden afgeleid van weefsels naar de ziektetoestand 5-8 relevant. Nieuwe methoden voor het genereren hiPSCs worden voortdurend onderzocht om optimale celtypen te beginnen identificeren als een manier om GMP-kwaliteit iPSCs geschikt voor transplantatie te bereiden, en om de tijdigheid en efficiëntie van de herprogrammeringsproces 6,9-11 verhogen. Epitheelcellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van allergische ontsteking 12 en het epitheel is een belangrijke oorzaak van allergische reacties en luchtwegremodellering door interactie met immune en stromale cellen. Het luchtwegepitheel speelt een essentiële rol bij het ontstaan ​​en voortduren van longziekten zoals astma. De geringere epitheelcellen moeilijk te verkrijgen in een klinische omgeving, vooral van gezonde controle patiënten en kinderen. Gegevens uit verschillende studies ondersteunen de vooronderstelling dat epitheliale cellen van het neusslijmvlies zijn van een geldig en praktische proxy voor de lagere luchtwegen epitheelcellen 13-20, in het bijzonder bij het ​​bestuderen van de reacties op luchtverontreinigende stoffen en allergenen. Het neusslijmvlies bestaat uit meer dan 90% haartjes bedekte epitheelcellen en bemonstering deze nasale epitheelcellen (NEM) kan gemakkelijk worden uitgevoerd bij kinderen vanaf de leeftijd van vier of vijf, omdat die minder invasief dan andere cellen / weefsels bemonsteringstechnieken en geassocieerd met een minimale kans op bijwerkingen zoals een infectie 20-23. Het biedt een snelle en eenvoudige manier om zowel gezonde als zieke kinderen zonder lange, onnodige en vaak pijnlijke bronchoscopie procedu proevenres die sedatie noodzakelijk. Eerdere studies hebben aangetoond dat ziekte subtypes in verband met de ernst van astma kan worden onderscheiden in zowel de nasale mucosa en bronchiale cellen monsters van astmatische kinderen en genexpressie tussen de twee weefseltypen was vergelijkbaar in ongeveer 90% van de niet-ubiquitous genen 22 , 24. Als bron voor iPSCs, NEC&#39;s bieden voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikt celtypen. Fibroblasten worden vaak gebruikt voor iPSC generatie, maar hoewel deze cellen gemakkelijk gekweekt uit een huidbiopsie kan dit proces vereist gewoonlijk plaatselijke verdoving, een incisie, en hechtdraden, en is geassocieerd met een risico op infectie. Derhalve verkrijgen geïnformeerde toestemming van patiënten voor dit type biopsie kan lastig 25 worden. Een alternatief voor fibroblasten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het kan echter moeilijk zijn om voldoende bloed iPSC generatie verkrijgen bij pediatrische patiënten. Daarnaast zijn er beperkingen van stroomafwaartse appassingen voor fibroblast en bloed cel afkomstige iPSCs, met name hun differentiatie capaciteit om bepaalde celtypen 5,26. Daarom, gezien de relatieve bereikbaarheid en de lage risico op bijwerkingen na hun collectie, NEC&#39;s vormen een ideale mobiele bron voor iPSC generatie van pediatrische populaties. iPSCs hebben veel aandacht kreeg onlangs als een platform voor de studie van de menselijke ontwikkeling, het genereren van nieuwe ziekte-modellen, en als een potentiële bron van cellen voor gepersonaliseerde behandelingen. Voordat u het volledige potentieel van deze technologie kan worden gerealiseerd, de moleculaire onderbouwing van de herprogrammering proces moeten worden opgehelderd, maar voor nu dit protocol en de binnen geschetste procedures zullen de onderzoeken gericht op risico&#39;s van de luchtwegen toe te lichten, evenals een platform voor het bestuderen van de effecten van de gepersonaliseerde geneeskunde waarbij iPSCs. De gezamelijke werk van verschillende labs heeft geleid tot de generation een succesvolle techniek voor niet uitsluitend bemonsteringen het neusslijmvlies, maar ook kweken NEM en herprogrammering van deze cellen iPSCs 23. Dit artikel geeft een overzicht van een protocol voor een optimale bemonstering, kweken en herprogrammering omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>15 ml conische</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocol Step 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft cytology borstel</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocol Step 1.2.</td></tr><tr><td>trypan blauw</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>cytospin trechter</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>lege glij</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 kleurkit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Bovine Dermal Colagen, type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocol Step 3.2.</td></tr><tr><td>T25 fles</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocol Step 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Trypsine Neutralizing Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS), verwarmd op 65 &deg;C gedurende 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&trade;, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor hybridoma, &ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>polycistotisch lentivirus*</td><td>bijv. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocol Step 6.4.&nbsp; Een commerciële bron van herprogrammeringsvector wordt vermeld. We gebruiken routinematig het 4-in-1 plasmide gerapporteerd door Voelkel et al (PMID: 20385817) om VSV-G-pseudotyped polycistotisch herprogrammeringslentivirus in-house te genereren. Dit plasmide kan worden verkregen door contact op te nemen&nbsp;</td></tr><tr><td>polybreen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>Bestraalde CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>hESC media</td><td>Zie recept in het protocol</td><td></td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>hESC-gekwalificeerde Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>Corning plaat, 6 putjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml wegwerp filterfles (0.22 &micro;m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocol Step 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protocol Step 6.11. componenten moeten worden gemengd en vervolgens filter gesteriliseerd. Media kan maximaal twee weken op 4 &deg;C worden bewaard. Bij het opwarmen van media, niet langer dan 15 min op 37 &deg;C laten staan</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;11330-032</td><td>Finale Concentratie</td></tr><tr><td>KO vervangende serum (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x niet-essentiële aminozuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &micro;g/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultiveren primaire nasale epitheelcellen van kinderen en programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasale epitheelcellen (NECs) zijn het deel van de luchtwegen dat reageert op luchtverontreinigingen en zijn de eerste cellen die worden geïnfecteerd door respiratoire virussen. Ze zijn ook betrokken bij veel luchtwegaandoeningen door hun aangeboren immuunrespons en interactie met immuun- en luchtwegstromacellen. NECs zijn van bijzonder belang voor studies bij kinderen vanwege hun toegankelijkheid tijdens klinische bezoeken. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn gegenereerd uit meerdere celtypen en zijn een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van menselijke ontwikkeling en ziekte, evenals voor hun potentiële toepassingen in regeneratieve geneeskunde. Dit is het eerste protocol dat methoden beschrijft voor het succesvol genereren van iPSCs uit NECs die zijn afgeleid van pediatrische deelnemers voor onderzoeksdoeleinden. Het beschrijft hoe nasale epitheelcellen bij kinderen kunnen worden verkregen, hoe primaire NEC-culturen uit deze monsters kunnen worden gegenereerd en hoe primaire NECs kunnen worden herprogrammeerd tot goed gekarakteriseerde iPSCs. Nasale mucosa-monsters zijn nuttig in epidemiologische studies met betrekking tot de effecten van luchtvervuiling bij kinderen en bieden een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van luchtwegaandoeningen. Primaire nasale cellen en iPSCs die daaruit zijn afgeleid, kunnen een hulpmiddel zijn voor het leveren van onbeperkt materiaal voor patiëntspecifiek onderzoek op diverse gebieden van de luchtweg-epitheelbiologie, inclusief astma- en COPD-onderzoek.

Het eerste gedeelte van de neus, genaamd de nasale vestibule, is het gebied omringd door kraakbeen 29. De borstel moet soepel voorbij het ​​gebied van de neus, buiten de nasale klep (ostium internum, of de &quot;zwarte gat&quot; gezien op de achterkant van de nare), en het monster wordt verkregen van de inferieure turbinate (figuur 1). De nasale turbinates zijn benige structuren die het oppervlak van de neus 29 te verhogen, waardoor ze een ideale lo...

Deze publicatie toont methoden voor succesvol bemonsteren en kweken van nasale epitheliale mucosa van kinderen, en het herprogrammeren van deze cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's).

Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van nasale epitheelcellen verkregen van kinderen en het herprogrammeren hiervan tot geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van luchtwegaandoeningen, zoals de ontwikkeling van astma. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er luchtwegepitheelcellen van kinderen worden verzameld zonder stressvolle procedures.In cultuur bevinden deze zich in een homogene populatie en dienen ze als een uitstekende bron voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSCs. We kregen voor het eerst het idee voor deze studie toen we met Dr. Ji en Dr. Hershey spraken over hun onderzoek naar het verzamelen van meso-epitheliale cellen van kinderen om epigenetische variatie bij astma en luchtvervuiling te onderzoeken.Een visuele demonstratie van deze technieken is essentieel, aangezien neusbemonstering en het herprogrammeren van neusepitheelcellen tot iPSCs moeilijke technieken zijn om te leren, omdat ze gebaseerd zijn op persoonlijke ervaring en niet op vastgestelde protocollen. Overbreng vóór het bezoek van de deelnemer 2 mL vers bronchiaal epitheelgroeimedium, afgekort als BEGM, naar een conische buis van 15 mL. Voeg vervolgens 20 µL van een mengsel van penicilline, streptomycine en amfotericine B toe aan dit medium tot een eindconcentratie van 0,01%. Wanneer de deelnemer arriveert, verzoek deze dan om plaats te nemen op een stoel.Open vervolgens de cytologieborstel vlak voordat het monster wordt afgenomen, en raak deze nergens aan om te garanderen dat de borstel steriel blijft. Instrueer de deelnemer vervolgens om stil te zitten en het hoofd naar boven richting het plafond te kantelen. Als de deelnemer onrustig is, laat hen dan op hun handen zitten zodat ze niet proberen de borstel weg te slaan.Richt de borstel vervolgens en voer deze in tot aan de achterzijde van de neus, waar de passage versmalt. Verwijder daarna de borstel uit het neusgat door deze met een draaibeweging van de pols naar beneden te schuiven. Plaats de borstel vervolgens in de eerder voorbereide conische buis en zorg ervoor dat deze volledig is ondergedompeld in BEGM.Snijd vervolgens het overtollige deel van de borstel af en draai de dop op de buis. Plaats de beker direct na afname van het monster in een bekerglas met warm water, zodat het zo dicht mogelijk bij 37 °C wordt gehouden. Transporteer het monster vervolgens naar het laboratorium.Schud de borstel eenmaal in het laboratorium voorzichtig in het BEGM. Neem vervolgens 10 µL van de sample af en voeg hieraan 10 µL van een live/dead cell stain toe. Breng dit mengsel vervolgens aan op een hemocytometer.Tel vervolgens alleen de levende cellen onder een microscoop. Neem na het tellen van de cellen 50 µL van de sample en verdun deze tot 200 µL met 1X PBS. Breng de rest van het onverdunde cellengemeng, samen met de borstel, over naar een gereguleerd waterbad van 37 °C tot aan het uitzaaien van de cellen.Voeg vervolgensHet met PBS verdunde monster toe aan een cytospin-trechter die aan een glazen objectglas is bevestigd. Centrifugeer het gehele apparaat vervolgens gedurende twee minuten op 400 rpm. Verwijder daarna de trechter en laat het objectglas een nacht in het donker drogen.Nadat het preparaat is gekleurd met Hema 3, zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het onder een microscoop geobserveerd en worden de cellen geteld. Identificeer epitheelcellen aan hun unieke kenmerken: een cilindervorm, ciliën en één ronde nucleus, en bepaal het percentage van deze cellen in het preparaat.Om het zaaien te beginnen, wordt de borstel voorzichtig bewogen in de conische buis binnen een gecertificeerde weefselkweekkap, waarna de borstel uit de buis wordt gehaald. Draai de borstel vervolgens voorzichtig over het binnenoppervlak van een T25-fles, die vooraf is gecoat met dermaal rundercollageen, waarbij erop wordt gelet dat de coating niet wordt beschadigd. Gooi de borstel daarna weg in een geschikte container voor biologisch gevaarlijk afval.Pipetteer de resterende cellen in BEGM langzaam vanuit de kegelvormige buis in de T25-fles, ten minste 5 × 10⁵ cellen. Observeer vervolgens de cellen onder een inverted microscoop. Na het kweken en passeren van de cellen, zoals beschreven in de tekst, worden 5 × 10⁵ nasale epitheelcellen in twee milliliter BEGM per well van een six-well weefselkweekplaat uitgeplaat.Incubeer de cellen vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na de incubatie of de cellen robuust prolifereren. Voeg vervolgens in een zuurkast Polybrene toe aan elke put met BEGM tot een eindconcentratie van 8 µg/mL.Ga over tot het transduceren van de nasale epitheelcellen door lentivirale deeltjes, die Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc tot expressie brengen, toe te voegen aan het medium in elke put, zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het incuberen van de getransduceerde cellen gedurende ongeveer drie uur wordt het virusbevattende medium verwijderd en afgevoerd volgens de institutioneel goedgekeurde procedures. Vervang dit medium vervolgens door BEGM en plaats de getransduceerde nasale epitheelcellen terug in de incubator.Vervang na drie dagen het medium door vers BEGM. Incubeer vervolgens de getransduceerde cellen onder dezelfde omstandigheden. Voeg de volgende dag een 0,1% gelatine-oplossing toe aan twee wells van een six-well plaat om te beginnen met het prepareren van platen gecoat met muis embryonale fibroblasten.Dek vervolgens de plaat af met het bijbehorende deksel en incubeer deze een nacht bij 37 °C. Ga op dag vijf verder door een vial te ontdooien die ongeveer 5 × 10⁵ geïnactiveerde embryonale fibroblasten van muizen bevat, afgekort als MEFs. Plaats deze cellen vervolgens in 10 mL MEF-medium.Centrifugeer deze vervolgens gedurende vijf minuten bij 200 x g. Aspireer daarna het supernatant en resuspendeer de MEF's in hetzelfde medium. Zodra deze cellen zijn geteld, aspireert u de gelatineloplossing uit de eerder voorbereide zeswellplaat.Voeg vervolgens 1,87 × 10⁵ MEF's toe aan elke met gelatine gecoate wel van de plaat en incubeer deze gedurende minimaal 24 uur bij 37 °C. Aspireer vervolgens op dag zes van de cultuur het gebruikte medium van de getransduceerde cellen en was deze met 1X PBS. Voeg daarna 1 mL 0,05% trypsine-oplossing toe aan elke wel van de plaat.Nadat de cellen zijn losgemaakt, worden deze geneutraliseerd met trypsin-neutralisatieroplossing of TNS; vervolgens worden de cellen verzameld en gecentrifugeerd zoals eerder besproken. Aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de cellen in vier milliliter BEGM, aangevuld met penicilline en streptomycine. Voeg vervolgens twee milliliter van deze cel-suspensie toe aan elke met gelatine en MEF gecoate put van de eerder voorbereide plaat.Vervang na een nacht incuberen de BEGM door 2,5 milliliters standaard medium voor menselijke embryonale stamcellen, afgekort als hESC, dat vier nanogram per milliliter basic fibroblast growth factor bevat. Ga verder met het kweken van de cellen en voed ze dagelijks met vers hESC-medium totdat er hESC-achtige kolonies, die vermoedelijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, of iPSCs, bevatten, in de culturen worden waargenomen. Exciteer deze kolonies handmatig en breng ze over naar afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat om ze als afzonderlijke lijnen te kweken en uit te breiden in een feeder-vrij systeem.Aanvankelijk zijn neusmonsters een mengsel van celtypen en debris. Echter, na cultivering en mediumwisselingen worden epitheelcellen dominant in deze preparaten, zoals te zien is op deze afbeelding genomen één dag na het passeren van de cellen. Hier vertonen epitheelcellen, die uitgroeien tot confluentie, grote kernen en een uitgerekt cytoplasma.Vanwege de eigenschappen van de lentivirale particles die in deze studie zijn gebruikt, brengen deze nasale epitheelcellen bij transductie de fluorescente marker tdTomato tot expressie, zoals gedemonstreerd door de afbeelding van de cellen rechtsboven, vier dagen na transductie. Een vergelijking met de overeenkomstige bright-field afbeelding laat zien dat niet elke cel een tdTomato-signaal vertoont, zoals blijkt uit de samengevoegde afbeelding onderaan. Bijgevolg is niet elke cel getransduceerd.De transductie-efficiëntie is echter ongeveer 90%. Wanneer getransduceerde nasale epitheelcellen worden gekweekt zoals beschreven in het protocol, ontstaan er iPSC-kolonies. Na het oogsten van de iPSC-kolonies en kweek onder standaard feeder-vrije condities, vertoonden individuele cellen in dergelijke kolonies een typische hESC-achtige morfologie, zoals een ronde vorm, een grote nucleus en een hoge nucleus-cytoplasmaverhouding, zoals aangetoond door deze vergrote afbeelding. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in anderhalf uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het monster correct af te nemen, de cellen op 37 °C te houden en deze zo snel mogelijk bij de juiste dichtheid uit te platen. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals het opzetten van een lucht-vloeistofinterface met primaire nasale epitheelcellen, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop we reageren op allergenen en pathogenen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om ziekten zoals astma, COPD en cystische fibrose te modelleren.Deze techniek helpt ook bij het bestuderen van milieu-effecten op de longontwikkeling in het in vitro menselijke systeem. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u nasale epitheelcellen van kinderen kunt kweken en iPSCs uit deze populatie kunt genereren. Aangezien we werken met menselijke embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen, dient u zich altijd te houden aan de institutionele en nationale richtlijnen.

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Recente ontwikkelingen in door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatieprotocollen maken de stapsgewijze afleiding van orgaanspecifieke celtypen mogelijk. Hier geven we gedetailleerde stappen voor het onderhoud en de uitbreiding van iPSC-afgeleide luchtwegbasale cellen en hun differentiatie in een mucociliair epitheel in lucht-vloeistof interfaceculturen.

Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer hoe je nasale epitheelcellen van kinderen kweekt en reprogrammeert naar iPSCs met lentivirale transductie. Deze niet-invasieve methode biedt een betrouwbare bron voor astma- en luchtwegonderzoek.

Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen