Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van een neuronaal eiwit optisch te controleren met behulp van een genetisch gecodeerd, onnatuurlijk aminozuur in neuronen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de bijdrage van een specifiek neuronaal eiwit aan neuronale signalering in hersenfunctie met ruimtelijk-temporele resolutie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het potentieel heeft om toegepast te worden op verschillende neuronaal eiwitten om optische regulatie van verschillende neuronale processen te bereiken.

Begin deze procedure door hippocampale neuronen op dekglasjes te kweken in een 24-well plate met 500 microliter groeimedium, na filtering door een 40 micrometer nylon gaas. Daarna, incubeer de neuronale cultuur bij 35 graden Celsius in een incubator met vijf procent koolstofdioxide, 95 procent lucht, bevochtigd gedurende 2 tot 3 weken. Op de dag van de transfectie, maak verse 2.5 molar calciumchloride oplossing in twee keer gedestilleerd water, en sterialiseerd filter deze met een 0.22 micrometer filter.

Maak vervolgens verse 2X BBS op pH 7, en sterialiseerd filter deze met een 0.22 micrometer filter. Vervang daarna het groeimedium van de cultuur met 500 microliter vers, voorverwarmd transfectiemedium, en gooi het oude groeimedium niet weg. Bereid de transfectieoplossing onmiddellijk voordat u het aan de cultuur toevoegt door calciumchloride en twee keer gedestilleerd water te combineren, terwijl u de buis langzaam agiteert.

Agiteer de buis verder en voeg langzaam DNA toe aan de oplossing. Voeg vervolgens druppelsgewijs 2X BBS buffer toe. De bereiding van 2X BBS buffer is een cruciale stap in calciumfosfaat transfectie, en het is een goed idee om de optimale pH voor 2X BBS buffer te kalibreren tussen 6.90 tot 7.15 voor nieuwe DNA constructies of bereidingen.

Voeg vervolgens onmiddellijk 30 microliter van de transfectieoplossing toe aan elk dekglas van de neuronale cultuur. Wieg de cultuurschaal een paar keer om de oplossing te mengen, en incubeer deze bij 35 graden Celsius gedurende 45 minuten tot een uur. Na ongeveer een uur zou een laag fijn calciumfosfaat precipitaat moeten worden waargenomen die de neuronen bedekt.

Vervolgens, vervang het transfectiemedium door 500 microliter voorverwarmd wasbuffer, en incubeer het bij 35 graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten. De calciumfosfaat precipitaat zou na het wassen moeten verdwijnen. Vervang nu de wasbuffer door 500 microliter vers groeimedium.

Vervolgens, vervang het groeimedium door het opgeslagen originele medium. Voeg vervolgens voorgemengd, onnatuurlijk aminozuur Cmn toe in 50 microliter warm groeimedium aan de cultuur, wat resulteert in een eindconcentratie van één millimolar. Incubeer de getransfecteerde cultuur bij 35 graden Celsius gedurende 12 tot 48 uur voordat u opneemt.

Bereid in deze procedure de extra- en intracellulaire oplossingen. In onze opstelling is de LED met emissie van 385 nanometer geïnstalleerd naast de microscoop om licht te leveren op een centimeter afstand van het brandpunt onder een hoek van 45 graden. Trek vervolgens enkele patch pipetten met een glazen elektrode aan de hand van een micro pipet trekker.

Neem vervolgens een neuroncultuurdekglas uit de incubator en spoel het eenmaal in de extracellulaire oplossing. Spuit de rig door met extracellulaire oplossing. Plaats vervolgens het dekglas op het platform van de elektrofysiologie microscoop, met behulp van standaard patch clamp technieken.

Patch een neuron dat getransfecteerd is met M-citrine fluorescenten. Neem vervolgens de neuronale activiteit op met behulp van de stroomklem methode. Stel eerst het rustpotentiaal in op ongeveer negatief 72 millivolt.

Injecteer vervolgens een stroomimpuls om continue vuren van actiepotentialen bij vijf tot vijftien Hertz te induceren. Tijdens het opnemen, lever enkele LED pulsen aan de neuron, en monitor de veranderingen van zijn actiepotentialen. Voeg vervolgens 0.5 millimolar bariumchloride toe aan het bad, om de actiepotentialen te herstellen.

In de setting van een acute hersensnede, patch een neuron met M-cherry GFP fluorescenten van de neocorticale regio. Neem vervolgens de PIRK activiteit op met behulp van de voltage ramp methode. Specifiek, monitor de Kir2.1 specifieke inwaartse stromen bij negatief 100 millivolt.

Lever vervolgens enkele LED pulsen aan de neuron terwijl u opneemt, en controleer of PIRK eiwitten geactiveerd zijn. Zodra PIRK geactiveerd is, zouden de inwaartse stromen bij negatief 100 millivolt significant toenemen. Voeg aan het einde 0.5 millimolar bariumchloride toe aan het bad, en verifieer of PIRK geïnactiveerd is.

Hier getoond zijn voorbeeldfoto's van gezonde hippocampale neuronale culturen van ratten. En twee gezonde neuronen die volledige cellichamen en uitgesproken dendrieten en axonen vertonen. Dit zijn de DIC en fluorescentie beelden van hippocampale neuronen culturen van ratten in vitro, en getransfecteerd voor PIRK expressie zonder CMN.

In de aanwezigheid van één millimolar CMN, zijn getransfecteerde neuronen in staat om full-length PIRK M-citrine eiwitten te expresseren, waardoor groene fluorescentie zichtbaar is. En hier is een voorbeeld van een enkele lichtpuls, die de activiteit van een getransfecteerd hippocampale neuron onderdrukt. Deze fluorescentie beelden van embryonale corticale neuronen van muizen tonen de succesvolle incorporatie van CMN in GFP en Kir2.1 eiwitten in vivo.

In deze grafiek wordt de lichtafhankelijke activering van PIRK aangegeven in de stromen opgenomen van de neocorticale neuronen van muizen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hersenziekten veroorzaakt door het defect van specifieke neuronaal eiwitten, bijvoorbeeld, gemuteerde Kir2.1 in het syndroom van Andersen, omdat deze techniek helpt bij het onthullen welke hersencircuits worden beïnvloed door Kir2.1 tekorten. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt om de functie van neuronale eiwitten te controleren met licht in hoge specificiteit in levende neuronen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u onnatuurlijke aminozuren in eiwitt