Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials
April 10th, 2016
Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.
Het algemene doel van deze experimenten is om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide diffusie en kleurstof-release test zijn nuttig voor de functionele ontdekking van nieuwe antimicrobiële middelen met lytische activiteit tegen specifieke doelen, zoals een pathogeen bacterie van belang. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze eenvoudig uit te voeren zijn, flexibiliteit bieden voor variatie van experimentele parameters en kunnen worden uitgevoerd met laboratoriumapparatuur die vaak wordt aangetroffen in de meeste microbiologie laboratoria.
Voordat u begint met de microslide diffusie test, moet de concentratie van het te evalueren antimicrobiële enzym worden bepaald met behulp van een BCA eiwit testkit, volgens het protocol van de fabrikant. Voer een seriële verdunning van het antimicrobiële enzym uit, met PBS als reactiebuffer. Verdeel het eiwit in afzonderlijke microfuge buisjes en pas de volumes aan tot 20 milliliter met PBS.
Bereidt vervolgens een 0,5% agarose oplossing voor door 0,25 gram agarose op te lossen in 50 milliliter PBS. Verhit deze oplossing tot een kookpunt tot de agarose volledig is opgelost. Bepaal het water dat verloren is gegaan tijdens het smeltproces door gewicht en voeg dit terug toe aan de oplossing.
Om besmetting door bacteriële groei tijdens het incuberen van de test te remmen, voeg 15 microliters van 10% natriumazid in water toe aan de agarose oplossing, en pas de temperatuur van de oplossing aan tot 50 graden Celsius in een waterbad. Als er levensvatbare cellen als substraat worden gebruikt, laat het natriumazid weg in de agarose oplossing. Ontdooi het hittedodende bacteriële substraat op ijs.
Hendel het bacteriële substraat in 12 milliliter van de agarose oplossing om de turgiditeit ongeveer overeen te komen met de turgiditeit van een 2,0 McFarland equivalentheid standaard. Vergelijk de turgiditeiten van de oplossingen door een zwarte lijn op een witte achtergrond door de oplossingen te visualiseren, en voeg bacteriële substraat toe aan de agarose totdat de geschatte turgiditeit wordt bereikt. Pipet onmiddellijk maar voorzichtig drie milliliter van de agarose substraatoplossing in elke microslide, en zorg ervoor dat de oplossing de microslide niet overstroomt.
Nadat de slides zijn gestold, gebruik een kurkboorder met een diameter van 4,8 millimeter om drie gaten in de agarose substraatlaag van elke microslide te maken. Voeg 20 microliter van elke aangepaste eiwit seriële verdunning toe aan de respectieve gaten. Gebruik bovien serum albumine in een negatieve controleput.
Gebruik als positieve controle bekende bacteriolytische enzymen die geschikt zijn voor het substraat, zoals lysozyme. Incubeer de slides in een vochtigheidskamer bij 37 graden Celsius, of de optimale activiteitstemperatuur van het enzym. De incubatietijd hangt af van de concentratie en specifieke activiteit van het antimicrobiële enzym.
Een typische reactietijd is ongeveer 16 uur. Wanneer de incubatie voltooid is, observeer de slides onder indirect licht en neem foto's van de zich ontwikkelende test. Gebruik een digitale spiegelreflexcamera met een 60 millimeter lens op een brandpuntsafstand van ongeveer 30 centimeter.
In de kleurstof-release test die in het volgende segment wordt gedemonstreerd, is het substraat covalent gekoppeld aan Remazol Briljant Blauw R kleurstof of RBB. Begin dit protocol door een 200 milliMolar RBB oplossing te maken. Los 1,25 gram RBB op in een vers bereide natriumhydroxide oplossing.
Hendel vervolgens hittedodende bacteriecellen op een concentratie van 0,5 gram nat gewicht in 30 milliliter RBB oplossing. Voor gezuiverd peptidoglycaan, hendelt u het peptidoglycaan op een concentratie van 0,3 gram nat gewicht in 30 milliliter RBB oplossing. Omdat de volgende stappen hetzelfde zijn, ongeacht het gebruikte substraat, zal de labelprocedure alleen voor de bacteriecellen worden gedemonstreerd.
Incubeer de reactiemengsel op een roterend platform gedurende zes uur bij 37 graden Celsius met zacht mengen. Na zes uur, breng de reactiemengsel over naar een vier graden Celsius incubator en incubeer voor een extra 12 uur met zacht mengen. Wanneer de incubatie voltooid is, oogst het gekleurde substraat door centrifugatie bij 3000 x g gedurende 30 minuten.
Giet de kleurstoffoplossing af van het substraat pellet. Hendelt het pellet grondig op in Type I water gevolgd door centrifugatie. Was de kleurstoff-gelabelde cellen driemaal tot vijfmaal op deze manier om niet-covalent gebonden oplosbare kleurstof uit de substraten te verwijderen.
Voor de laatste wasbeurten, brengt u het pelletgedeelte dat in de kleurstof-release test zal worden gebruikt over naar 1,5 milliliter microfuge buisjes. Het supernatant van de laatste wasbeurt moet helder zijn terwijl het substraat blauw blijft. Bewaar het gekleurde substraat gesuspendeerd in een minimale hoeveelheid water bij 20 graden Celsius tot het klaar is voor gebruik.
Om voor te bereiden voor de kleurstof-release test, laat het bevroren gekleurde substraat terugkeren naar kamertemperatuur, en was tweemaal met de testbuffer die empirisch werd bepaald voor het enzym. PBS wordt in dit geval gebruikt. Bereken het volume van de substraatsuspensie dat nodig is door de 200 microliter reactievolume te vermenigvuldigen met het aantal kleurstof-release tests dat zal worden uitgevoerd.
Om de substraatsuspensie voor te bereiden, voegt u eerst het gekleurde substraat toe aan het juiste volume PBS. Maak een een op een verdunning, en neem een initiële meting van de optische dichtheid bij 595 nanometer, met PBS als blank. Voeg incrementele hoeveelheden van het gekleurde substraat toe aan de suspensie totdat een optische dichtheid van 2,0 bij 595 nanometer is bereikt.
In deze demonstratie zal de kleurstof-release test worden gebruikt om de optimale incubatiecondities voor een eiwitantimicrobieel te bepalen. Bereid eerst een voorraad eiwitantimicrobieel suspensie voor door de concentratie aan te passen tot een milligram per milliliter met PBS zoals beschreven in de protocoltekst. Verdun vervolgens de voorraad eiwitantimicrobieel suspensie tot een concentratie van 100 nanogram per microliter.
Deze concentratie
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het snel screenen en karakteriseren van enzymen voor antimicrobiële activiteit met behulp van microslide diffusie en kleurstof-release assays. Deze methoden maken een kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie mogelijk van enzymatische activiteit tegen specifieke bacteriële doelen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Enzymologie
- Antimicrobieel onderzoek
Achtergrond
- Antimicrobiële resistentie is een groeiende zorg in de gezondheidszorg.
- Snelle screenmethoden zijn essentieel voor het ontdekken van nieuwe antimicrobiële middelen.
- Enzymatische assays kunnen inzicht geven in de lytische activiteit van potentiële antimicrobiële middelen.
- Gebruikelijke laboratoriumapparatuur kan voor deze assays worden gebruikt.
Doel van het onderzoek
- Protocollen ontwikkelen voor het screenen van enzymen met antimicrobiële eigenschappen.
- De effectiviteit van deze enzymen tegen specifieke pathogene bacteriën evalueren.
- Een flexibele en eenvoudige methodologie voor onderzoekers bieden.
Gebruikte methoden
- Microslide diffusie assay voor kwalitatieve beoordeling.
- Kleurstof-release assay voor kwantitatieve meting van enzymatische activiteit.
- Bereiding van bacteriële substraten en enzymdilutieën.
- Gebruik van controles om de assayresultaten te valideren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle karakterisering van enzymactiviteit tegen doelbacteriën.
- Demonstratie van de effectiviteit van de kleurstof-release assay.
- Vaststellen van optimale omstandigheden voor enzymactiviteit.
- Visuele documentatie van assayresultaten door middel van beeldvorming.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen zijn effectief voor het screenen van antimicrobiële enzymen.
- Deze methoden kunnen worden aangepast voor verschillende laboratoriumomgevingen.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om nieuwe antimicrobiële middelen te ontdekken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid screening of microbial libraries for novel antimicrobial proteins requires complementary qualitative and quantitative assays to efficiently prioritize targets for downstream development. The microslide diffusion assay enables fast, visual detection of proteolytic activity, while the dye-release assay provides reproducible, quantitative data to assess environmental influences on enzyme function. Together, these methods support early target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables qualitative assessment of antimicrobial enzyme activity against diverse bacterial substrates to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Supports rapid screening of large microbial libraries using minimal reagent volumes and standard microbiology equipment.
- Predictive Value: Provides initial activity readouts that help triage candidates before investing in resource-intensive characterization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The dye-release assay generates quantitative, absorbance-based measurements that enable comparison of enzymatic activity across conditions.
- Operational Value: Uses covalently labeled substrates (e.g., Remazol brilliant blue R) to increase sensitivity and reduce variability in activity readouts.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening of enzyme variants or environmental modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterizes enzyme activity against clinically relevant pathogens (e.g., Salmonella enterica, Bacillus subtilis) to align with disease models.
- Mechanistic De-risking: Determines optimal reaction conditions (e.g., temperature, pH, salinity) to predict in vivo performance and formulation stability.
- Activity Profiling: Enables comparison of unknown antimicrobials to benchmark enzymes (e.g., alpha-chymotrypsin) to assess relative affinity and activity range.
Pipeline & Workflow Integration
The microslide diffusion and dye-release assays function as complementary early-stage tools in the antimicrobial discovery continuum, supporting progression from initial hit identification to lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by rapidly evaluating lytic activity against target pathogens to clarify mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative output generation for hit-to-lead progression.
- Analytics: Provides absorbance-based readouts at 595 nm that allow teams to quantify and compare enzymatic activity under varying conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by defining optimal enzymatic conditions that inform formulation and delivery strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening antimicrobial enzymes across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by delivering both qualitative activity zones and quantitative kinetic data.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized substrate labeling (RBB dye) and controlled incubation parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of enzyme affinity, activity range, and environmental robustness.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on characterized activity profiles and optimal conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques, including substrate preparation, turbidity standardization, and aseptic handling.
- Depends on standard laboratory equipment such as incubators, centrifuges, microplate spectrophotometers, and thermal cyclers.
- Necessitates cross-team standardization of substrate labeling protocols (e.g., RBB conjugation) to ensure assay comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the dye-release assay to different substrates (e.g., purified peptidoglycan vs. whole cells).
- Includes practical limitations such as the need for optimization of incubation times based on enzyme-specific activity and concentration.
