Name: Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer microfluïdische flowkamers met gereconstitueerd bloed voor hemostasemodellen. Deze methode evalueert de kwaliteit en functie van opgeslagen bloedplaatjesconcentraten onder hydrodynamische stroming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

Dit protocol volgt de institutionele ethische richtlijnen voor onderzoek naar menselijke monsters en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken donoren. Goedkeuring voor de hier beschreven experimenten werd verkregen van de institutionele review board van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen. Opmerking: De temperatuur indicaties zijn altijd kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. 1. Voorbereiding Flow Kamer Setup <ol><li> Het voorbereiden van Lanes, Tubing and Pins <ol><li> Vortex de collageensuspensie krachtig en verdund 1/20 in de isotonische glucoseoplossing door de leverancier geleverd aan een eindconcentratie van 50 ug / ml. Let op: We maken gebruik van paarden pees collageen, voornamelijk samengesteld uit type I vezels. Paarden collageen type I wordt vaak aangeduid als &quot;Horm&quot; collageen en is de gouden standaard voor dit type assay 9 zowel historische en biologische redenen. Humaan type III collageen kunnen ook worden gebruikt, maar the fibrillen vacht minder goed en de bloedplaatjes respons is niet zo sterk. Andere coatings oppervlakken kunnen ook worden gebruikt, bijvoorbeeld von Willebrand factor (VWF), fibrinogeen, fibronectine, laminine, vitronectine, trombospondine-1 of combinaties van deze 16. </li><li> Neem een ​​nieuwe disposable biochip van container van de provider. De afmetingen van de biochips die hier gebruikt zijn 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3. </li><li> Pipet 0,8 ui in de lane (s) van de microfluïdische biochip aan het ene uiteinde van de chip en merk als outlet. Zorg ervoor dat de baan is gevuld 5/6 met het collageen bevattende coating oplossing bereid in 1.1.1. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen. Noot: Kanalen worden gedeeltelijk bekleed om ophoping van collageen vezels te voorkomen bij de ingang van het kanaal (zie bespreking). </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 4 uur of een nacht in een bevochtigde en gesloten houder. </li><li> Blokkeer de gecoate kanalen pipetteren blokkerende buffer (1,0% (w / v) runderserumalbumine eend 0,1% (w / v) glucose in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde zoutoplossing (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) aan het andere uiteinde en waardering als inlaat. Zorg ervoor dat de baan volledig is gevuld met de blokkerende buffer vermijden luchtbellen. </li><li> Snijd buis op gelijke lengte (12 cm). Gebruik één per rijstrook en verbindt u elke buis met een pin. Zo zal een experiment waarin twee voorwaarden in duplo vereist vier buizen rekt en vier pennen te bereiden. </li><li> Spoel de buis met gedestilleerd water met behulp van een spuit en een 26 G naald of de bijbehorende connectoren. </li><li> Verzadigen van de buis met blokkerende buffer. In gesloten en bevochtigde container gedurende ten minste 1 uur. </li></ol></li><li> Het voorbereiden Pomp en spruitstuk <ol><li> Spoel de pomp en spruitstuk met gedestilleerd water, verwijder luchtbellen. </li><li> Zuig het blokkerende buffer uit de biochip lane (s) met behulp van de vaste 10 ul tip bij de uitlaat. Reinig het oppervlak vande biochip met een precisie stofvrije af te vegen en Gedenatureerde alcohol te prenten en stof te verwijderen. </li><li> Bevestig de biochip op een geautomatiseerde microscoop podium. Als er meer dan één rijstrook gelijktijdig wordt gebruikt in een run, sluit de acht-baans manifold splitter aan de biochip stopcontact. Opmerking: De acht-lane verdeelstuk splitter is een stuk hardware (figuur S1) verbonden met de pomp en de biochip. Het maakt gebruik van alle beschikbare (acht) rijstroken op een biochip of een combinatie van rijbanen-operator gedefinieerd in de bijbehorende software zijn. </li><li> Gebruik de pinnen in de buis om ze op te lossen in de biochip inlaat. Plaats het andere uiteinde van de slang (zonder pen) in een 1,5 ml conische reageerbuis gevuld met HBS. Spoel alle leidingen en daarmee verbonden lanen met 1 ml HBS met de pomp, om verwijderen rest blokkeerbuffer en slecht hechtende collageen. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding bloedmonsters <ol><li> Inzameling en scheiding vanvers volbloed uit een gezonde vrijwilliger. 17 <ol><li> Verzamel de eerste milliliters bloed in een geëvacueerde buis met Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) als antistollingsmiddel en uitsluitend te gebruiken voor dit monster volledige bloedtelling (CBC) met een geautomatiseerde hematologie-analyse. </li><li> Verzamel een hoeveelheid bloed in een geschikt anticoagulans gebruikt vacuümbuizen. Standaard antistollingsmiddelen stromingskamer experimenten heparine of hirudine als fibrine vormen geen deel uitmaakt van het studieprotocol en natriumcitraat als het. Opmerking: Heparine werd gebruikt als antistollingsmiddel voor alle in de resultaten beschreven experimenten. Opmerking: De hoeveelheid bloed is afhankelijk van het aantal experimenten uit te voeren. Ongeveer 1 tube (7 ml) gedurende 3 doorgangen. </li><li> Plaats de buizen op een rotator in afwachting van bloed oplossen. Opmerking: De test moet binnen 3 uur van aderlaten worden afgerond. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 250 g om bloedplaatjes rijk plasma te bereiden (PRP). Laat de centrifuge break niet gebruiken om verstoring van de los gepakt pellet te voorkomen. <ol><li> Wanneer meer dan één buis werd verzameld, verzamel het bloed in één conische centrifugebuis. Opmerking: Centrifugeren kan langzamer of minder lang worden uitgevoerd, afhankelijk van de PRP opbrengst en differentiële celtelling &quot;verontreiniging&quot; preferred. </li></ol></li><li> Verwijder de PRP en buffy coat waardoor rode bloedcellen met weinig bloedplaatjes. Let op: het aantal bloedplaatjes in het verpakte rode cellen fractie 13 ± 5 x 10 3 per il (gemiddelde ± SD, n = 12) gemiddeld in onze handen. </li></ol></li><li> Blood Reconstitutie <ol><li> Dooi bloedgroep AB (Rhesus D-negatief) plasma bij 37 ° C gedurende 5 minuten en 20 seconden per 4 ml. </li><li> Bepaal de hematocriet van de rode bloedcellen bereid in 2.1.5 behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse. </li><li> Bepaal de concentratie van bloedplaatjes in het bloed bank bereid plaatjesconcentraat that wordt gebruikt om reconstitueren boven de rode celfractie. </li><li> Bereken het volume van rode bloedcellen en bloedplaatjes concentraat dat 40% hematocriet en 250 x 10³ bloedplaatjes / ul oplevert in een 1 ml monster. Opmerking: andere doelstelling titers cellen kunnen willekeurig worden ingesteld, afhankelijk van het onderzoeksprotocol. </li><li> Transfer rode bloedcellen en plasma in een nieuwe buis met behulp van een pipet tip geknipt en voeg bloedplaatjesconcentraat tot een monstervolume van 1 ml wordt bereikt. Opmerking: Afhankelijk van de variabelen onderzocht, moet het plasma fractie gelijk in alle opgeloste monsters zijn omdat plasma heeft een significante invloed op trombusvorming tarief. Bijvoorbeeld, herhaalde vries-dooien en plasma van verschillende donoren of andere anticoagulantia kan het resultaat beïnvloeden. </li><li> Meng de bereide bloed voorzichtig door het omkeren en het uitvoeren van een CBC. </li><li> Bereid een &quot;blanco&quot; controlemonster waarin de hoeveelheid bloedplaatjes fractie wordt vervangendoor een gelijk volume van 0,9% (m / v) natriumchloride in water om de concentratie van endogene bloedplaatjes (dan bloedbank bloedplaatjes) in de gereconstitueerde bloed met een CBC bepalen. </li></ol></li><li> labeling <ol><li> Pipet 1 ml gereconstitueerde bloed in een reageerbuis met 1 ul 5 mM calceïne AM (5 uM eindconcentratie). Opmerking: Andere mobiele kleurstoffen kunnen worden gebruikt 14. </li><li> Meng voorzichtig door het omkeren. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C vóór gebruik. </li></ol></li></ol> 3. Perfusie Assay <ol><li> Stel het objectief op de collageenvezels gehecht aan de onderzijde van de banen. Gebruik bij voorkeur fase-contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) instellingen voor deze focus strategie. Selecteer &#39;Set huidige Z voor geselecteerde tegel regio&#39;s in het experiment software om de gekozen Z-posities digitaal op te lossen. </li><li> Selecteer een van belang (ROI) in de baan (xy) in het experiment software van de microscope dat tijdens het experiment wordt opgenomen. Opmerking: De ROI kan elk oppervlak willekeurig gekozen binnen een perfusie lane zijn. Het is raadzaam niet trombusvorming analyseren dichtbij de in- en uitlaat van een rijstrook bijwerkingen van de variabele stromingsprofiel in dat gebied te voorkomen, ook al is relatief klein. De ROI oppervlak moet een groot aantal bloedplaatjes verwezen of trombi te egaliseren van het signaal mogelijk. In dit protocol het ROI is een digitaal aaneengeregen totaal van drie even grote zij-aan-zij beelden waardoor 0,62 mm 2 in het midden van de 2 cm lange laan. </li><li> Meng de monsters voorzichtig door het omkeren en plaats deze naast de biochip de geautomatiseerde podium. </li><li> Plaats de buis die is verbonden met de inlaat van de biochip in de reageerbuizen met het gereconstitueerde bloedmonsters. </li><li> Start de pomp op 50 dyne / cm2 (of andere schuifspanningen zoals gewenst) voor deze kanalen in verband met buizen te testenmet het gereconstitueerde bloedmonsters met behulp van de software van de pomp. Opmerking: Andere schuifspanning kunnen worden gebruikt. </li><li> Neem beelden elke 15 seconden gedurende 5 min in real-time via de verwerving en experiment software van de microscoop. Opmerking: Andere grafieken kan worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele set-up. Opmerking: We gebruiken meestal 100X vergroting (10X objectief en 10X lenzen), maar hoger (of lager) vergroting kan gemakkelijk worden gebruikt als alternatief. </li></ol> 4. Was Out <ol><li> Spoel alle slangen aan de uitlaat en met de meerkanaals verdeelstuk of pomp met gedestilleerd water, gevolgd door natriumhypochloriet (bleek) 0,5% (v / v) en tenslotte 0,1 M NaOH in water. Gooi de buis vastgemaakt aan de biochip inlaat als gevaarlijk afval. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Bepaal trombus groeikinetiek de beeldanalyse software. De volgende opdrachten zijn specifiek voor ZEN2012. <ol&gt; <li> Open de plugin Image Analysis aan de oppervlakte dekking van de bloedplaatjes te bepalen. </li><li> Stel de fluorescentie drempel in het Analyseren Interactive tabblad om de pixel intensiteit die correleert met een positief signaal te definiëren, dat wil zeggen een gehandeld bloedplaatjes of hechtende bloedplaatjes. </li><li> Gebruik Maak de tabellen voor het automatisch genereren van een spreadsheet dat de afzonderlijke oppervlakken (in um 2) van die &quot;objecten&quot; met pixels met een signaal tussen de geselecteerde drempelwaarden zal bevatten. Dit gebeurt voor elk tijdstip. Let op: Als fluorescentie drempels hebben gekozen, de analyse software detecteert automatisch de &#39;objecten&#39; in het veld van mening dat de criteria voldoen. Deze objecten zijn trombi, kleine aggregaten van bloedplaatjes of enkele plaatjes en bestrijken een aantal pixels. Elk object is opgenomen in de spreadsheet afzonderlijk. </li><li> Bewaar deze spreadsheets in xml-formaat en open ze in een spreadsheet-programmavoor verdere berekeningen. </li><li> Totale de oppervlakten van geselecteerde objecten uit de som en deel het resultaat met de totale oppervlakte van het meetveld (2 pm). Dit zal de relatieve bedekkingsgraad (%) werd verkregen. Doe dit voor elk tijdstip. </li><li> Waarnemingspunt oppervlak dekkingen in functie van de perfusie en bereken de helling door lineaire regressie, waarbij de trombus groei van kinetische dit bepaalde situatie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+at+work+in+primary+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelets at work in primary hemostasis.</a> Blood Rev. 25, 155-167 (2011).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121, 1875-1885 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279, 636-638 (1979).</li>
<li>Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84, 289-297 (1996).</li>
<li>Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+vitro+thrombus+formation+with+novel+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices.</a> Platelets. 23, 501-509 (2012).</li>
<li>Varga-Szabo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+sensor+STIM1+is+an+essential+mediator+of+arterial+thrombosis+and+ischemic+brain+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction.</a> J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).</li>
<li>Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hemostasis+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hemostasis in flowing blood.</a> Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).</li>
<li>Heemskerk, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+surfaces+to+measure+thrombus+formation+under+flow%3A+possibilities+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).</li>
<li>Shrivastava, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).</li>
<li>Miyaji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+platelet+aggregation+of+platelet+concentrate+during+storage+recovers+in+the+body+after+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion.</a> Transfusion. 44, 891-899 (2004).</li>
<li>Goodrich, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+in+vitro+platelet+quality+measurements+with+in+vivo+platelet+viability+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects.</a> Vox Sang. 90, 279-285 (2006).</li>
<li>Van Aelst, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+and+amotosalen+photochemical+treatments+of+platelet+concentrates+reduce+thrombus+formation+kinetics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro.</a> Vox Sang. 108, 328-339 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+c+light+pathogen+inactivation+treatment+of+platelet+concentrates+preserves+integrin+activation+but+affects+thrombus+formation+kinetics+on+collagen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro.</a> Transfusion. , (2015).</li>
<li>de Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+platelet+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Dynamics of platelet thrombus formation.</a> J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).</li>
<li>Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+randomized+trial+of+a+prophylactic+platelet+transfusion+trigger+of+10+x+10%289%29+per+L+versus+30+x+10%289%29+per+L+in+allogeneic+hematopoietic+progenitor+cell+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients.</a> Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).</li>
<li>Neeves, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+variability+in+platelet+accumulation+on+type+1+fibrillar+collagen+in+microfluidic+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one+%22%5BJournal%5D)">Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays.</a> PloS one . 8, e54680(2013).</li>
<li>Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+blood+platelets+by+adenosine+diphosphate+and+its+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.</a> Nature. 194, 927-929 (1962).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+quality+control+of+platelets+for+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22ISBT+Sci+Series%22%5BJournal%5D)">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+%28thrombin+inhibitors%29+and+aspirin+synergize+with+P2Y12+receptor+antagonism+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis.</a> Circulation. 108, 2697-2703 (2003).</li>
<li>Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+mutation+promotes+thrombocytopathy+by+inhibiting+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3.</a> J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).</li>
<li>Gitz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+platelet+survival+after+cold+storage+by+prevention+of+Glycoprotein+Ib%CE%B1+clustering+in+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts.</a> Haematologica. , (2012).</li>
<li>Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Quality+Testing+of+Blood+Platelet+Transfusions+with+Dynamic+Light+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Part+Syst+Char%22%5BJournal%5D)">Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering.</a> Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+2%3A+current+methods+and+considerations+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future.</a> J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+1%3A+Biorheologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations.</a> J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microfluïdische flow chamber experimenten zijn een uitstekend hulpmiddel om bloedplaatjesfunctie onderzoeken stromend bloed en worden gebruikt om hemostase in vitro evalueren in verschillende experimentele context. Ondanks de slechte interlaboratoriumproef standaardisatie 9, tonen we aan dat in ons laboratorium de experimentele variatie is aanvaardbaar. Hierdoor kan betrouwbaar vergelijken (gepaard) monsters binnen een gegeven onderzoek. Dit werd gevalideerd met goed gedocumenteerde verschijnsel van ...

Hemostase vereist de gecombineerde en gereguleerde activiteit van cellen, eiwitten, ionen en weefsels in een beperkte spatiotemporele context 1. Ongecontroleerde activiteit kan leiden tot bloedingen of trombose en morbiditeit of mortaliteit in een spectrum van aandoeningen gerelateerd aan bloedstolling. Een microfluïdische stroom kamer experiment is een uitdagende techniek die hemostase nabootst in vitro. Deze aanpak maakt het mogelijk onderzoek naar de complexe samenspel van processen die deelnemen aan hemostase met een hoofdrol voor bloedplaatjes. Na vasculair letsel, bloedplaatjes zich aan het blootgelegde subendotheliale matrix (glyco) proteïnen bloedverlies te voorkomen. Na hechting, bloedplaatjes activeren en aggregaat in reactie op auto- en paracriene signalering die uiteindelijk leidt tot de vorming van een bloedplaatjes netwerk gestabiliseerd door fibrine en resulteert in een stevig gewikkelde afdichtende trombus 2. In tegenstelling tot de meeste andere bloedplaatjes functietesten, experimenten met stroomkamers rekening houden met de fysische parameter van de bloedstroom en derhalve de invloed van reologie de deelnemende cellen en biomoleculen 3,4. Stromingskamer experimenten landmark inzichten in hemostase en trombose gegenereerd door het variëren sleutelparameters die invloed hemostatische (sub) processen inclusief de klevende matrix, reologie en stromingsprofielen, cellulaire samenstelling, aanwezig toxinen of drugs, ionsterkte en veel meer. In de afgelopen twee decennia, lage omzet stroom kamer experimenten die grote steekproef volumes (10-100 ml) hebben zich ontwikkeld tot microfluïdische kamers vaak bestaat uit kleine parallelle plaat kamers en met moderne technologie voor het perfuseren volbloed bij gecontroleerde shear omstandigheden 5. Microscaling is sterk toegenomen test throughput vooral omdat de hardware-installatie is vereenvoudigd en minder (bloed) volume nodig is, waardoor het experiment toegankelijker en Versatile. Bijvoorbeeld kan bloed van kleine proefdieren nu gebruikt worden zonder de noodzaak om dieren te offeren. Bloedmonsters van genetisch gemodificeerde muizen hebben dus geholpen bij de identificatie van de belangrijkste moleculen bevorderen of remmen van hemostase en in de roman van basisinzichten 6. Onderzoekslaboratoria gespecialiseerde vaak nog gebruik maken van custom made ​​stroom kamers bijvoorbeeld uit polydimethylsiloxaan (PDMS) 7, dat polymeriseert op gelithografeerde mallen die kunnen worden blueprinted door software. De resulterende kamer is goedkoop, wegwerpbaar en kan gemakkelijk worden gedemonteerd voor post hoc analyse. Bovendien, in principe elk ontwerp van schepen, waaronder vertakkingen of scherpe bochten kan worden gebouwd op commando. Dit voordeel is ook een nadeel omdat standaardisatie was al de voornaamste probleem met de stroom kamer experimenten en PDMS maat gemaakt kamers hebben dit niet geholpen. Op de top van deze kwestie, coating (omstandigheden), fluorescerende probes, antistollingsmiddel, temperature en de tijd tussen bemonstering en analyse zijn allemaal slecht gestandaardiseerd 8. Standaardisatie van deze variabelen is een uitdaging, maar toch nodig om de vergelijking van de resultaten tussen laboratoria mogelijk te maken. Dit onderwerp is het belangrijkste onderwerp van de International Society op trombose en Haemostase in wetenschappelijke en standaardisatie subcomité biorheology 9,10. Bloedplaatjes concentraten (PC) transfusie bij patiënten die lijden aan verschillende ziekten die trombocytopenie en / of bloeden veroorzaken. Maar bloedplaatjes PC is bekend dat ongevoelig, met name in functie van de opslagtijd 11, een verouderingsproces gekoppeld aan veroudering en aangeduid als bloedplaatjes opslag laesie. Er wordt wel eens beweerd dat dergelijke plaatjes te herstellen in omloop eenmaal transfusie 12, maar bewijs hiervoor is schaars. Bovendien wordt de functionaliteit van bloedplaatjes die een PC niet routinematig getest omdat de relatie tussen deze bepalingen entherapeutische of profylactische werkzaamheid onduidelijk 13. Microfluïdische stroom kamers bieden een middel om de functie van de bloedplaatjes in de PC te onderzoeken om de keten van manipulaties tussen inzameling en afgifte te optimaliseren. Het is een krachtige research tool voor directe (gepaarde) een vergelijking van de pc, zoals we eerder hebben gepubliceerd 14,15 en wordt hier beschreven.

<table><tbody><tr><td>BD vacutainer tube met EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer tube met Heparine</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer tube met Sodium Citraat</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Bloedbuisje</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Bloedopvangnaald met vooraf bevestigde houder</td></tr><tr><td>Pipettips 100-1.000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Pipettips 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Pipettips 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Buis 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spuit</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Precisiedoekjes</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Genoemd in Figuur S1 A als 'Biochip'</td></tr><tr><td>Vena8 Slangen</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Genoemd in Figuur S1 B als 'Wegpuntje'</td></tr><tr><td>Vena8 Naalden</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Genoemd in Figuur S1 B als 'Pin'</td></tr><tr><td>Connectors voor enkelvoudige inlaatkabels van biochips</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Genoemd in Figuur S1 B als 'Herbruikbare slangen' en 'Splitter'</td></tr><tr><td>Bevochtigde doos</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software microfluïdische pomp</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collageen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Natuurlijk paardenpeescollageen (type I) Isotone glucoseoplossing om collageen te verdunnen wordt aangevuld</td></tr><tr><td>HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS)</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) gebufferde zoutoplossing (0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Blocking buffer</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>1,0% (w/v) bovien serumalbumine en 0,1% (w/v) glucose in HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Molecular probes</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel 10%</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td>zelf gemaakt preparaat</td><td></td></tr><tr><td>Gedenatureerde alcohol</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>met Multiflow8. Genoemd in Figuur S1 A als 'Pomp' en 'Manifold'</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>uitgerust met een colibri-LED en hoge resolutie CCD camera</td></tr><tr><td>Software microscoop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Hematologie analyzator</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Trombocyt incubatie apparaat</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Incubatie waterbad</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Brand</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Tubus rolapparatuur</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Steriele docking device</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Slangen sluitmachine</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluïdische flow chambers behulp gereconstitueerde blood voor model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Bloedplaatjes die zijn voorbereid voor transfusie verliezen geleidelijk hun hemostatische functie tijdens opslag. De functie van bloedplaatjes kan worden onderzocht met behulp van verschillende (indirecte) in vitro experimenten, maar geen van deze is zo uitgebreid als microfluïdische stroomkamers. In dit protocol wordt de reconstitutie van trombocytopenisch vers bloed met opgeslagen bloedbankplaatjes gebruikt om bloedplaatjestransfusie te simuleren. Vervolgens wordt het gereconstitueerde monster geperfundeerd in microfluïdische stroomkamers die hemostasis nabootsen op blootgestelde subendotheelmatrixeiwitten. Effecten van bloeddonatie, transport, componentscheiding, opslag en pathogeeninactivatie kunnen worden gemeten in gepaarde experimentele ontwerpen. Dit maakt een betrouwbare vergelijking mogelijk van de impact die elke manipulatie in de bereiding van bloedcomponenten heeft op hemostasis. Onze resultaten tonen de impact van temperatuurcycli, schuifsnelheden, bloedplaatjesconcentratie en opslagduur op de functie van bloedplaatjes aan. Kortom, dit protocol analyseert de functie van bloedbankplaatjes en dit helpt uiteindelijk bij de optimalisatie van de verwerkingsketen, inclusief flebotomie, transport, componentvoorbereiding, opslag en transfusie.

Intra-assay variatie tonen werden drie identieke gereconstitueerd volbloedmonsters tegelijkertijd geperfuseerd via collageen beklede oppervlakken (figuur 1). Dit resulteerde in een variatiecoëfficiënt van 8,7%. Deze statistiek suggereert aanvaardbare intra-assay en intralaboratorium variatie toelaat betrouwbare vergelijking tussen gerelateerde steekproeven. De inlaat van de commerciële stromingskamer hier besc...

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Het algemene doel van dit experiment is om plaatjestransfusie in vitro na te bootsen en dit te testen aan de hand van hemostase op collageen, met hydrodynamische stroming en real-time microscopie. Patiënten met trombocytopenie worden behandeld met bewaard bloedplaatjesconcentraat. Onze methode is bedoeld om te helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van trombose en hemostase, met specifieke nadruk op de kwaliteit en functie van dergelijke bewaarde bloedplaatjesconcentraten.De toegevoegde waarde van deze techniek is dat deze de bloedstroom nabootst en daarmee rekening houdt met rheologische invloeden op de betrokken cellen en biomoleculen. De huidige methode beoordeelt de binding van bloedplaatjes aan collageen. Deze kan echter ook worden toegepast op andere adhesieve weefsels, waaronder atherosclerotische plaque, endotheelcellen of specifieke matrixeiwitten zoals von Willebrand-factor en fibrinogeen.Begin met het voorbereiden van de biochip. Vortexeer en verdun een collageenstockoplossing 1 op 20 in de isotone glucose-oplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL. Pipetteer vervolgens 0,8 µL in de banen van een nieuwe wegwerpbiochip.Vul

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier gepresenteerd is een protocol voor een gestandaardiseerd in vitro hemodynamic loop model. Dit model maakt het mogelijk om de hemocompatibiliteit van perfusiebuizen of vasculaire stents te testen in overeenstemming met ISO (International Organization for Standardization) norm 10993-4.

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Dielectrophoresis (DEP) is een effectieve methode om cellen te manipuleren. Printed circuit boards (PCB's) kan bieden goedkope, herbruikbare en effectief elektroden voor contact-free celmanipulatie binnen microfluïdische apparaten. Door het combineren van PDMS-based microfluïdische kanalen met dekglaasjes op PCB's, tonen we aan kralen en cel-manipulatie en scheiding binnen multichannel microfluïdische apparaten.

Scheiden Kralen en cellen in Multi-channel Microfluïdische apparaten met behulp van Dielectrophoresis en Laminar Flow

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Leer microfluïdische flowkamers met gereconstitueerd bloed voor hemostasemodellen. Deze methode evalueert de kwaliteit en functie van opgeslagen bloedplaatjesconcentraten onder hydrodynamische stroming.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie

Meer video's verkennen