Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie

Het algemene doel van dit experiment is om plaatjestransfusie in vitro na te bootsen en dit te testen aan de hand van hemostase op collageen, met hydrodynamische stroming en real-time microscopie. Patiënten met trombocytopenie worden behandeld met bewaard bloedplaatjesconcentraat. Onze methode is bedoeld om te helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van trombose en hemostase, met specifieke nadruk op de kwaliteit en functie van dergelijke bewaarde bloedplaatjesconcentraten.

De toegevoegde waarde van deze techniek is dat deze de bloedstroom nabootst en daarmee rekening houdt met rheologische invloeden op de betrokken cellen en biomoleculen. De huidige methode beoordeelt de binding van bloedplaatjes aan collageen. Deze kan echter ook worden toegepast op andere adhesieve weefsels, waaronder atherosclerotische plaque, endotheelcellen of specifieke matrixeiwitten zoals von Willebrand-factor en fibrinogeen.

Begin met het voorbereiden van de biochip. Vortexeer en verdun een collageenstockoplossing 1 op 20 in de isotone glucose-oplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL. Pipetteer vervolgens 0,8 µL in de banen van een nieuwe wegwerpbiochip.

Vul alle kanalen aan één uiteinde van de chip en markeer dit als de uitlaatzijde. Controleer vervolgens de chip om er zeker van te zijn dat elk kanaal voor 5/6 is gevuld met de oplossing en dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Incubeer de chip vervolgens gedurende vier uur of overnight bij 4 °C in een bevochtigde en gesloten container.

Blokkeer later de gecodeerde kanalen door blokkeringsbuffer in het andere uiteinde van de banen te pipetteren. Snijd vervolgens voor elke baan stukjes slang van 12 centimeter af en bevestig een pin aan elk stuk slang zodat ze aan de biochip kunnen worden bevestigd. Spoel de stukken slang met gedistilleerd water met behulp van een spuit en een connector.

Verzadig ze vervolgens met blokkeringsbuffer en sluit ze voor ten minste één uur af in een bevochtigde container. Bereid daarna de pomp en het verdeelstuk voor. Spoel eerst de pomp en het verdeelstuk met gedestilleerd water om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Bevestig vervolgens de biochip aan de tafel van de automatische microscoop. Plaats één uiteinde van de slangetjes in een buisje van 1,5 milliliter gevuld met HBS en bevestig het andere uiteinde vervolgens aan de inlaatpoorten van de biochip. Plaats de manifoldpinnen in de uitlaatpoorten van de biochip.

Spoel vervolgens het systeem met HBS met behulp van de pomp. Eventuele resterende blokkeringsbuffer of slecht hechtend collageen wordt zo verwijderd. Hiermee zijn de voorbereidingen van de stroomkamer voltooid.

Begin met het samenvoegen van recente bloedafnames van gezonde vrijwilligers in een conische centrifugebuis. Centrifugeer het monster ongeveer 15 minuten bij 250 Gs. Gebruik de rem niet, omdat dit de losjes gepakte onderste fase zou verstoren. Verwijder en gooi het plaatjesrijk plasma en de buffy coat weg.

Bewaar de gepakte rode bloedcellen met zo min mogelijk bloedplaatjes om het gereconstitueerde bloed te maken. Begin nu met het ontdooien van vier milliliter type AB-plasma bij 37 °C gedurende vijf minuten en 20 seconden. Bepaal ondertussen het hematocriet van de voorbereide gepakte rode bloedcellen met behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyzer.

Bepaal vervolgens de plaatjesconcentratie van een door een bloedbank bereid plaatjesconcentraat om te gebruiken voor de reconstitutie van het volbloed. Bereken de benodigde volumes voor één milliliter gereconstitueerd bloed met een hematocriet van 40% en 250.000 plaatjes per microliter. Draag nu, met behulp van een afgeknipte pipetpunt, het benodigde volume rode bloedcellen, plasma en plaatjesconcentraat over tot de gewenste concentratie en een eindvolume van één milliliter.

Meng het gereconstitueerde bloed door voorzichtig te keren en voer een volledig bloedbeeld uit. Neem vervolgens een voorbereide microcentrifugebuis met Calcein AM en voeg hieraan één milliliter gereconstitueerd bloed toe. Meng het bloed met de kleurstof door voorzichtig te keren.

Incubeer vervolgens het gereconstitueerde bloed gedurende vijf minuten bij 37 °C. Selecteer in de software het interessegebied (ROI) in het perfusiekanaal. Focus bij een 100x vergroting op de collageenvezels die aan de bodem van de kanalen kleven.

Gebruik bij voorkeur fasecontrast of differentiële interferentiecontrast. Kies de optie "set current Z for selected tile regions" om de geselecteerde Z-posities digitaal vast te leggen. De optische focus vóór de perfusie moet op het ameloblast-collageen liggen, maar dit kan lastig zijn.

Een alternatief is om de focus van de microscoop in te stellen op de eerste hechtende bloedplaatjes. Meng nu de monsters voorzichtig en plaats ze naast de biochip. Plaats vervolgens de slang die verbonden is met het geobserveerde kanaal in het gereconstitueerde bloed.

Pas vervolgens, met behulp van de software die de pomp aanstuurt, een druk van 50 dyne per vierkante centimeter toe om het bloedmonster in het kanaal te bewegen en start het experiment. Leg tijdens het experiment elke 15 seconden beelden vast gedurende vijf minuten. Bepaal de groeikinetiek van de trombus met behulp van software voor beeldanalyse.

In dit geval wordt Zen 2012 gebruikt. Begin met het openen van de plugin voor beeldanalyse om de oppervlaktebedekking van de bloedplaatjes te bepalen. Stel de fluorescentiedrempel in het interactieve analyse-tabblad in om de pixelintensiteit te definiëren die correleert met een positief signaal, afkomstig van hechtende bloedplaatjes.

Gebruik vervolgens de functie 'tabellen maken' om automatisch een spreadsheet te genereren met een lijst van de oppervlakten van de positieve signalen voor elk tijdstip. Sla deze spreadsheets op in het XML-formaat en open ze in een spreadsheetprogramma voor verdere berekeningen. Bereken voor elk tijdstip de totale oppervlakte van de geselecteerde objecten en druk deze waarde uit als het percentage van het bedekte oppervlak.

Zet vervolgens de gegevens uit als functie van de perfusietijd en bereken de helling via lineaire regressie. Dit modelleert de kinetiek van de trombusgroei voor die specifieke experimentele conditie. Drie identieke gereconstitueerde monsters volbloed werden gelijktijdig geperfundeerd over collageen-gecoate oppervlakken.

Dit resulteerde in een variatiecoëfficiënt van 8,7%, wat wijst op een aanvaardbare intra-assay en intra-laboratorium variatie voor de vergelijking van de tests. Transfusie werd gesimuleerd door het bloed opnieuw samen te stellen met de deficiënte component. Er werden verschillende reconstituties uitgevoerd met afnemende plaatjesconcentraties.

Zoals verwacht resulteerden lagere bloedplaatjestellingen in minder adhesie als functie van de perfusietijd. Vervolgens werd het effect van verlaagde temperaturen na bloedafname en tijdens perfusie onderzocht. Er werd vastgesteld dat trombi langzamer vormden wanneer het bloed werd afgekoeld tot kamertemperatuur.

Vergeleken met een monster dat gedurende de gehele studie op 37 graden Celsius werd gehouden. Tijdens de circulatie binden bloedplaatjes zich aan beschadigde plekken in de vaten onder omstandigheden van verhoogde wandschuifspanning. Zoals verwacht veranderde het variëren van de schuifsnelheid in de microfluidische stroomkamers de totale adhesie van bloedplaatjes.

Deze omstandigheden veranderen ook de kinetiek van de trombusgroei. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe microfluïdische flowkamerexperimenten met gereconstitueerd bloed kunnen worden uitgevoerd om de kwaliteit en functie van bewaarde bloedplaatjesconcentraten te testen. Deze techniek kan in ongeveer zeven uur worden uitgevoerd.

Experimenten met microfluïdische stroomkamers hebben de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van plaatjestransfusies om de impact van variabelen bij donatie, bereiding en bewaring te onderzoeken. Een relevant voorbeeld hiervan is pathogeeninactivering. We hebben een voorbeeld gegeven van slechts één experimenteel subject.

Variaties in calciumconcentratie, schuifspanning en oppervlaktecoatings kunnen echter worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te beantwoorden. Vergelijkbaar met deze procedure kunnen andere metingen in microfluïdische stroomkamers worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Zo kan bijvoorbeeld de prestatie van bewaarde bloedplaatjes bij coagulatie in de stroom worden onderzocht.