Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie In Vitro
19 maart 2016
Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.
Het algemene doel van dit experiment is om plaatjestransfusie in vitro te imiteren en deze te testen met behulp van hemostase op collageen, met hydrodynamische stroming en realtime microscopie. Patiënten met trombocytopenie worden behandeld met opgeslagen plaatjesconcentraten. Onze methode is bedoeld om sleutelvragen op het gebied van trombose en hemostase te helpen beantwoorden, met specifieke nadruk op de kwaliteit en functie van dergelijke opgeslagen plaatjesconcentraten.
De toegevoegde waarde van deze techniek is dat het de bloedstroom nabootst en dus rekening houdt met reologische invloeden op deelnemende cellen en biomoleculen. De huidige methode beoordeelt de binding van bloedplaatjes aan collageen. Het kan echter ook worden toegepast op ander bindweefsel, inclusief atherosclerotische plaque, endotheelcellen of specifieke matrixeiwitten zoals Von Willebrand factor en fibrinogeen.
Begin met het voorbereiden van de biochip. Vortex en verdun een collageenstock een op twintig in de isotone glucoseoplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter. Pipetteer vervolgens 0,8 microliter in de banen van een nieuwe wegwerpbare biochip.
Vul alle banen aan één uiteinde van de chip en markeer dit als de uitlaatzijde. Inspecteer vervolgens de chip om ervoor te zorgen dat elke baan voor 5/6 gevuld is met de oplossing en geen luchtbellen bevat. Incubeer vervolgens de chip gedurende vier uur of een nacht bij vier graden Celsius in een bevochtigde en gesloten container.
Blokkeer later de gecodeerde kanalen door blokkeringsbuffer in het andere uiteinde van de banen te pipetten. Snijd vervolgens voor elke baan 12 centimeter lange slangen en bevestig een pin aan elke lengte slang om ze aan de biochip te kunnen bevestigen. Spoel de slanglengtes af met gedistilleerd water vanuit een spuit en een connector.
Verzadig ze vervolgens met blokkeringsbuffer en verzegel ze in een bevochtigde container gedurende ten minste een uur. Bereid vervolgens de pomp en de verdeler voor. Spoel eerst de pomp en de verdeler af met gedistilleerd water om eventuele luchtbellen te verwijderen.
Bevestig vervolgens de biochip aan de geautomatiseerde microscoopstandaard. Plaats één uiteinde van de lengtes in een buis van 1,5 milliliter gevuld met HBS en bevestig ze met het andere uiteinde aan de inlaten van de biochip. Plaats de verdelerpins in de uitlaten van de biochip.
Spoel vervolgens het systeem met HBS af met behulp van de pomp. Eventuele resterende blokkeringsbuffer of slecht hechtend collageen wordt hierdoor verwijderd. Dit voltooit de voorbereidingen van de stroomkamer.
Begin met het poolen van recente bloedafnames van gezonde vrijwilligers in een conische centrifugeerbuis. Draai het monster ongeveer 15 minuten bij 250 Gs. Gebruik geen rem, omdat dit de losjes verpakte onderste fase zal verstoren. Verwijder en gooi het trombocytenrijke plasma en de buffycoat weg.
Bewaar de verpakte rode bloedcellen met zoveel mogelijk zo weinig bloedplaatjes om het gereconstitueerde bloed te maken. Begin nu met het ontdooien van vier milliliter type AB-plasma bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en twintig seconden. Bepaal ondertussen de hematocriet van de bereide verpakte rode bloedcellen met behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyzer.
Bepaal vervolgens de bloedplaatjesconcentratie van een bloedbankbereide bloedplaatjesconcentraat om te gebruiken voor reconstitutie van het volbloed. Bereken de vereiste volumes voor één milliliter gereconstitueerd bloed met 40% hematocriet en 250.000 bloedplaatjes per microliter. Gebruik vervolgens een geklemde pipettentip om het vereiste volume rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjesconcentraat over te brengen naar de gewenste concentratie en een eindvolume van één milliliter.
Meng het gereconstitueerde bloed met zachte inversies en voer een volledige bloedtelling uit. Neem vervolgens een voorbereide microcentrifugebuis met Calcein AM en voeg hieraan één milliliter gereconstitueerd bloed toe. Meng het bloed met kleurstof met zachte inversies.
Incubeer vervolgens het gereconstitueerde bloed gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Selecteer in de software het gebied van belang in de perfusie-baan. Richt u op de collageenvezels die zich op de bodem van de banen bevinden met een vergroting van 100x.
Gebruik idealiter fasecontrast of differentiële interferentiecontrast. Kies de optie set current Z voor geselecteerde tegelregio's om de geselecteerde Z-posities digitaal te fixeren. De optische focus voorafgaand aan perfusie moet op ameloblastcollageen zijn, maar dit kan lastig zijn.
Een alternatief is om de microscoopfocus op de aanvankelijk hechtende bloedplaatjes te zetten. Meng vervolgens voorzichtig de monsters en plaats ze naast de biochip. Plaats vervolgens de slang die is verbonden met de waargenomen baan in het gereconstitueerde bloed.
Gebruik vervolgens de software die de pomp bestuurt om een druk van 50 dyne per vierkante centimeter toe te passen om het bloedmonster in de baan te bewegen en het experiment te starten. Tijdens het experiment worden elke 15 seconden gedurende vijf minuten afbeeldingen vastgelegd. Bepaal de groeikinetiek van de trombus met behulp van software voor beeldanalyse.
In dit geval wordt Zen 2012 gebruikt. Begin met het openen van de plug-in beeldanalyse om het oppervlaktedekking van de bloedplaatjes te bepalen. Stel de fluorescentiedrempel in het interactieve tabblad analyse in om de pixelintensiteit te definiëren die correleert met een positief signaal, dat afkomstig zou zijn van hechtende bloedplaatjes.
Gebruik vervolgens tabellen maken om automatisch een spreadsheet te genereren met een lijst van de oppervlaktegebieden van de positieve signalen voor elk tijdstip. Sla deze spreadsheets op in het XML-formaat en open ze in een spreadsheetprogramma voor verdere berekeningen. Bereken bij elk tijdstip de totale oppervlakte van de geselecteerde objecten en druk deze waarde uit als het percentage van het oppervlak dat is bedekt.
Plot vervolgens de gegevens als functie van de perfusietijd en bereken de helling door lineaire regressie. Dit modelleert de groeikinetiek van de trombus van die specifieke experimentele conditie. Drie identieke gereconstitueerde volbloedmonsters werden gelijktijdig over met collageen gecoat
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt trombocytentransfusie en hemostase met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers. Het benadrukt de impact van trombocytenopslagoplossingen op de hemostatische functie in vitro.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hematologie
- Trombose
- Hemostase
Achtergrond
- Trombocytopeniepatiënten ontvangen opgeslagen trombocytenconcentraten.
- Trombocytopeenopslagoplossingen kunnen de hemostatische functie beïnvloeden.
- Inzicht in trombocytenfunctie is cruciaal voor het verbeteren van transfusieresultaten.
- Huidige methoden beoordelen trombocyteninteracties met collageen en andere adhesieve weefsels.
Doel van het Onderzoek
- Om trombocytentransfusie in vitro na te bootsen.
- Om de hemostatische functie op collageen onder hydrodynamische stroming te evalueren.
- Om de kwaliteit en functionaliteit van opgeslagen trombocytenconcentraten te onderzoeken.
Gebruikte Methoden
- Bloordreconstitutietechnieken.
- Microfluïdische stroomkamers voor real-time microscopie.
- Beoordeling van trombocytenbinding aan collageen.
- Toepassing op andere adhesieve weefsels zoals atherosclerotische plaque.
Belangrijkste Resultaten
- Demonstreerde de effecten van opslagoplossingen op trombocytenfunctie.
- Gaf inzichten in de hemostatische capaciteiten van opgeslagen trombocyten.
- Toonde de relevantie van hydrodynamische stroming bij het beoordelen van trombocyteninteracties.
- Benadrukte potentiële toepassingen op verschillende adhesieve weefsels.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe methode voor het evalueren van de efficiëntie van trombocytentransfusie.
- De bevindingen kunnen klinische praktijken informeren over trombocytenopslag en transfusie.
- Toekomstig onderzoek kan de implicaties voor trombose en hemostase verder uitbreiden.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to evaluate platelet transfusion efficacy under physiologically relevant flow conditions, addressing a critical gap in preclinical assessment of blood product quality. By simulating hemostasis in microfluidic chambers using reconstituted blood, the method provides quantitative, real-time readouts of platelet function that support go/no-go decisions in transfusion medicine development. The approach de-risks translational advancement by linking storage variables to functional outcomes, thereby improving predictive confidence in platelet product performance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding platelet function and storage lesion impact on hemostasis.
- Operational Value: Enables functional target validation of platelet concentrates under controlled shear stress and temperature conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating platelet concentration, storage duration, and temperature cycling with thrombus growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of platelet-modulating compounds or storage interventions.
- Reproducibility: Delivers quantitative surface coverage measurements with low intra-assay variation (8.7% CV), enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports multiplexed testing of three identical reconstituted blood samples simultaneously over collagen-coated surfaces.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thrombocytopenia treatment scenarios using reconstituted blood to mimic clinical platelet transfusion.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by measuring hemostatic function on collagen under hydrodynamic flow.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement decisions by quantifying the impact of blood donation, transport, component separation, storage, and pathogen inactivation on platelet function.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment, enabling continuous evaluation of platelet product quality across the processing chain.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of platelet storage lesions and pathway clarification of hemostasis under flow.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating platelet adhesion and thrombus growth kinetics.
- Analytics: Generates quantitative thrombus growth kinetics via image analysis and linear regression, enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by simulating transfusion and measuring functional outcomes in disease-relevant shear conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for assessing platelet product quality across multiple storage variables and processing steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in platelet function by reducing mechanistic ambiguity in storage lesion effects.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled perfusion, blocking, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking storage duration, temperature, and shear rate to functional platelet outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of platelet processing optimizations based on empirical hemostasis data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, blood reconstitution, and real-time microscopy.
- Dependent on automated microscope stage, pump-manifold system, and biocompatible biochips.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit, platelet concentration, and perfusion pressure settings.
- Involves adaptation considerations for varying shear rates, temperature profiles, and surface coatings (e.g., collagen, VWF, fibrinogen).
- Practical limitations include the need for air bubble-free channel filling and precise Z-focus maintenance during perfusion.
