Video Imaging en Maps Spatiotemporal om gastro-intestinale motiliteit analyseren in Muizen

Het algemene doel van deze techniek is om veranderingen in de neurale regulatie van de colontransportcapaciteit bij muizen te identificeren met behulp van video-imaging. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de enterische neurowetenschappen, zoals de vraag of subtiele genetische mutaties in neuronale genen invloed hebben op de colontransportcapaciteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het weefsel een cyste vormt bij afwezigheid van input uit het centrale zenuwstelsel, waardoor de methode onderzoek mogelijk maakt naar de betrokkenheid van het enterische zenuwstelsel bij de aansturing van de gastro-intestinale motiliteit.

Deze techniek kan worden uitgebreid naar de therapie van neuro-ontwikkelingsstoornissen zoals autisme, aangezien genmutaties die de synaptische functie in de hersenen beïnvloeden, mogelijk ook de darmmotiliteit kunnen veranderen. Begin met het maken van een incisie door de epidermis boven de onderste abdominale spierlagen met behulp van dissectie-pincetten en een schaar. Open de buikholte langs de middellijn tot aan het sternum.

Bevocht het weefsel met fysiologische zoutoplossing en til het caecum met de pincet voorzichtig vier tot vijf centimeter boven de buikholte. Trim vervolgens het mesenterium met een fijne dissectieschaar, waarbij u er zorg voor draagt het gastro-intestinale weefsel niet aan te raken, uit te rekken of door te snijden. Verwijder de blaas, de testikels en elk ander overtollig weefsel.

Maak vervolgens met grove dissectiescharen twee verticale incisies van ongeveer 0,5 centimeter vanaf de middellijn in het bekkenbot aan weerszijden van de dikke darm, en gebruik de fijne schaar om het rectum te scheiden van het aangrenzende bekkenweefsel. Trim het mesenterium van de dikke darm en spoel het volledige weefsel van de dikke darm in een bekerglas met fysiologische zoutoplossing. Om de fecale pellets en andere darminhoud te verwijderen, trimt u eerst ongeveer één centimeter van het uiteinde van een 200 µL pipette en bevestigt u de pipette aan een spuit van 5 mL gevuld met fysiologische zoutoplossing.

Verwijder vervolgens het caecum en het rectum en plaats een insectennaald in het meest proximale uiteinde van het colon, waar de striaties in de mucosa zichtbaar zijn, om het weefsel te oriënteren. Pak nu het weefsel voorzichtig vast aan het proximale uiteinde, voer de pipetpunt in het lumen in en spoel de fysiologische zoutoplossing door het colon in een afvalbak. Spoel daarna, met dezelfde spuit en pipetpunt, eventueel residu uit de slang die is verbonden met een twee-kamer organenbad met verse fysiologische zoutoplossing.

Stel het organenbad zo in dat de kamers continu worden gesuperfuseerd met fysiologische zoutoplossing waar carbogen doorheen wordt gebubbeld, en gebruik een temperatuurprobe om regelmatig te bevestigen dat de temperatuur van de zoutoplossing tussen 33 en 37 graden Celsius blijft. Gebruik een rubberen stop met een glazen buis met een binnendiameter van vijf millimeter die door het midden is gestoken om de druk in het instroomreservoir te handhaven. Dompel vervolgens een stuk colon van vijf tot zeven centimeter volledig onder in de kamer van het organenbad en gebruik een pincet en standaard katoenen naaigaren om het proximale uiteinde van het colon aan de inlaatbuis en het distale uiteinde van het colon aan de uitlaatbuis te cannuleren.

Nadat de basisafstand tussen de proximale en distale canulaties van het colon is bepaald, laat u het weefsel 30 minuten equilibreren in fysiologische zoutoplossing. Om de darmbewegingen vast te leggen, plaatst u, terwijl het colon acclimatiseert, een videocamera op een standaard laboratoriumstatief 10 tot 15 centimeter boven het organenbad en stelt u de juiste software voor videocapture in. Wanneer de camera gereed is, neemt u vier videosegmenten van 15 minuten op van het colon onder controlecondities.

Superfuse vervolgens het betreffende geneesmiddel in het organenbad gedurende 30 tot 60 minuten, waarbij opnieuw vier videosegmenten van 15 minuten worden opgenomen. Vervang tenslotte de behandelingsoplossing door verse fysiologische zoutoplossing en neem nog vier videosegmenten van 15 minuten op tijdens de uitwasperiode van één uur. Vervolgens kunnen spatiotemporele kaarten van de dikke darm worden gegenereerd als reactie op de verschillende behandelingsperioden.

Om vast te stellen of synaptische mutaties de migrerende motorische complexen van het colon, of CMMC's, beïnvloeden wanneer het enterische zenuwstelsel farmacologisch wordt verstoord, werd in dit experiment de 5-HT3- en 4-receptorantagonist tropisetron toegevoegd aan de organenbadkamer met de colonpreparaat. In aanwezigheid van tropisetron vertoonden NL3R451C-muizen een afname in de CMMC-frequentie vergeleken met hun wildtype nestgenoten. Hoewel er onder gecontroleerde omstandigheden geen significante verschillen in contractiliteit werden waargenomen tussen de wildtype en NL3R451C-muizen, reduceerde tropisetron de CMMC-frequentie significant bij zowel wildtype als NL3R451C-muizen.

Bovendien had tropisetron een groter effect op de frequentie van CMMC's bij NL3R451C-muizen vergeleken met wild-type dieren. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Let er bij het uitvoeren van deze techniek op dat het organenbad op een constante temperatuur wordt gehouden, dat er een continue toevoer van carbogeen is en dat overloop van fysiologische zoutoplossing door middel van een vacuüm wordt voorkomen.

Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals immunocytochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of er veranderingen zijn in de neuronale proporties of celgetallen bij muizen met een veranderde colone motiliteit. Sinds de ontwikkeling heeft deze methode een verscheidenheid aan studies naar intestinale motiliteit mogelijk gemaakt bij cavia's en konijnen, ratten en andere soorten, en in dit specifieke geval met name bij de muis. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe veranderingen in de neuronale regulatie van de colone motiliteit kunnen worden geïdentificeerd met behulp van video-imaging.