Name: Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van In Vivo Intracellulaire Recordings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer intracellulaire registratie om spectrale gevoeligheid van fotoreceptorcellen in vlinderogen te meten. Deze methode voorspelt kleurzicht en onthult hoe filterpigmenten lichtgevoeligheid beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de late Rudy Limburg voor het vervaardigen van de cardan arm omtrek, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, en Raju Metherate voor het lenen ons apparatuur en Almut Kelber en Kentaro Arikawa, voor bemoediging. Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship om KJM en NSF subsidie ​​IOS-1257627 naar ADB

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Intracellulaire opname kan een moeilijke techniek om te beheersen vanwege de vele technische trappen. Voor een succesvolle experimenten een aantal belangrijke punten moet worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een ​​goed trilling geïsoleerde tafel waarop het experiment werd uitgevoerd hebben. Veel onderzoekers gebruikslucht tabellen, die het tafelblad volledig gescheiden van de basis, waardoor superieure trillingsisolatie. Onze opstelling betreft een dikke marmeren tafel met een zandbak op de top, waarin word...

De elektrische eigenschappen van cellen zoals neuronen worden waargenomen door het meten ionenstroom door celmembranen als een verandering in spanning of stroom. Verschillende elektrofysiologische technieken ontwikkeld om bio-elektrische gebeurtenissen in cellen te meten. Neuronen in de ogen van dieren toegankelijk zijn en de schakeling is vaak minder complex dan in de hersenen, waardoor deze cellen goede kandidaten voor elektrofysiologisch onderzoek. Voorkomende toepassingen van elektrofysiologie in het oog omvatten Electroretinografie (ERG) 1,2 en micro-elektrode intracellulaire opname. ERG betreft het plaatsen van een elektrode in of op het oog van een dier onder lichte stimulus, en meten van de verandering van de spanning als een som van de reacties van alle nabijgelegen cellen 3-6. Als men in het bijzonder geïnteresseerd in het karakteriseren van de spectrale gevoeligheid van de individuele fotoreceptorcellen, vaak meerdere celtypen tegelijk reageren op verschillende sterktes van een bepaalde prikkel; alduskan moeilijk zijn om de gevoeligheden van specifieke celtypen van ERG data bepalen vooral als er verschillende soorten spectraal vergelijkbare fotoreceptorcellen in het oog. Een mogelijke oplossing is het gebruik van transgene Drosophila te maken met de fotoreceptor (opsin) gen van belang tot uitdrukking in de meerderheid R1-6 cellen in het oog en voer ERG 7. Potentiële nadelen van deze methode zijn geen low-expressie van het fotoreceptor eiwit 8, en de lange termijn voor de productie en screening van transgene dieren. Voor de ogen met minder soorten spectraal verschillende fotoreceptoren, kan de aanpassing van het oog met gekleurde filters helpen bij het ​​verlagen van de bijdrage van een aantal celtypen van de ERG, waardoor het toelaat schatting van de spectrale gevoeligheid maxima 9. Intracellulaire opname is een techniek waarbij een fijne elektrode doorboort een cel en een stimulus wordt toegepast. De elektrode platen alleen dat indivrespons idual cel, zodat het opnemen van en het analyseren van meerdere afzonderlijke cellen kunnen specifieke gevoeligheden van fysiologisch verschillende celtypen 10-14 opleveren. Hoewel onze protocol richt zich op de analyse van de spectrale gevoeligheid, de basisprincipes van de intracellulaire opname met scherpe elektroden aanpasbaar voor andere toepassingen. Een andere bereiding van een monster, bijvoorbeeld, en met een scherpe kwarts elektroden kan men opnemen dieper in de optische kwab en andere hersengebieden, afhankelijk van de vraag wordt gesteld. Bijvoorbeeld responsietijden van individuele fotoreceptorcellen 15, celactiviteit in de optische lobben 16 (laminaat, medulla of lobula 17), hersenen 18 of andere ganglia 19 kunnen ook worden opgenomen met soortgelijke technieken of kleurstimuli kunnen worden vervangen door polarisatie 20 -22 of bewegende stimuli 23,24. Fototransductie, het proces waarbij het lichtenergie wordt geabsorbeerd en omgezet in een elektrochemische signaal, is een oude eigenschap gemeen hebben bijna alle heden dier phyla 25. De visuele pigment gevonden in fotoreceptorcellen en verantwoordelijk voor het initiëren visuele fototransductie is rhodopsine. Rodopsine in alle dieren uit een opsin eiwit, een lid van de 7 transmembraan G-proteïne gekoppelde receptorfamilie een corresponderend chromofoor die is afgeleid van het netvlies of een soortgelijk molecuul 26,27. Opsin aminozuursequentie en structuur chromofoor invloed op de absorptie van rhodopsine verschillende golflengten van licht. Wanneer een foton geabsorbeerd wordt door de chromofoor rhodopsine wordt geactiveerd, het initiëren van een G-proteïne in de cel cascade die uiteindelijk leidt tot het openen van membraangebonden ionkanalen 28. In tegenstelling tot de meeste neuronen, fotoreceptorcellen ondergaan graded potentiële veranderingen die kunnen worden gemeten als relatieve verandering responsamplitude met veranderende licht stimulus. Meestal een bepaaldefotoreceptor soort uiting slechts één opsin gen (hoewel uitzonderingen bestaan ​​8,10,29-31). Geavanceerde kleur visie, van de soort te vinden in vele gewervelde dieren en geleedpotigen, wordt bereikt met een complexe oog van honderden of duizenden fotoreceptorcellen elke uiting van één of gelegenheid meer rhodopsine types. Visuele informatie wordt vastgelegd door vergelijking antwoorden via fotoreceptor mozaïek via complexe neurale stroomafwaartse signalering in het oog en de hersenen, wat resulteert in de waarneming van een beeld compleet met kleur en beweging. Na meting van de respons van een ruwe fotoreceptorcel verschillende golflengten van licht via intracellulaire opname, is het mogelijk om de spectrale gevoeligheid berekenen. Deze berekening is gebaseerd op het principe van Univariance, volgens welke reactie een fotoreceptorcel is afhankelijk van het aantal fotonen absorbeert, maar niet op de specifieke eigenschappen van de fotonen absorbeert 32. Elke foton dat is Absorbed door rhodopsine Dezelfde soort reactie induceren. In de praktijk betekent dit dat een cel ruwe responsamplitude zal toenemen als gevolg van hetzij een toename van de lichtintensiteit (meer fotonen te absorberen), of een verschuiving in golflengte naar zijn piekgevoeligheid (hogere waarschijnlijkheid van rhodopsine absorberen die golflengte). We maken gebruik van dit principe in verband cellulaire reacties op bekende intensiteit en dezelfde golflengte om de reacties bij verschillende golflengten en dezelfde intensiteit maar onbekend relatieve gevoeligheid. celtypen worden vaak aangegeven door de golflengte waarbij de gevoeligheid pieken. Hier laten we een methode voor de intracellulaire registratie en analyse van de spectrale gevoeligheid van fotoreceptoren in het oog van een vlinder, met een focus op het maken van deze methode meer toegankelijk voor de bredere onderzoeksgemeenschap. Hoewel intracellulaire opname vaak blijft in de literatuur, met name wat betreft kleurwaarneming bij insecten, hebben we gevonden that beschrijvingen van de materialen en werkwijzen zijn gewoonlijk te kort om voor reproductie van de techniek. Wij stellen deze werkwijze videoformaat met het doel van het toestaan ​​zijn gemakkelijker replicatie. We beschrijven ook de techniek met gemakkelijk verkrijgbare en betaalbare materialen. We pakken voorkomende valkuilen die vaak niet gemeld, waarin onderzoek vertragen wanneer het optimaliseren van een nieuwe en complexe techniek.

<table><tbody><tr><td>Butterfly pupae</td><td></td><td></td><td>Meerdere lokale soorten beschikbaar, USDA-vergunningen nodig voor verzending. Carolina Bio Supply heeft verschillende insectensoorten die binnen de VS kunnen worden besteld zonder aanvullende vergunningen</td></tr><tr><td>Large plastic cylinder</td><td></td><td></td><td>Elke kamer die bevochtigd blijft, zal werken</td></tr><tr><td>Insect pins, size 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe's</td><td></td><td>Elke honing of sucrose-oplossing werkt</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Small (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 &amp; 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Six Position Filter Wheel, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filter Wheel Mount Hub</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Concave silica lens, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Collimator holder</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Collimating beam probe</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Deze adapter laat de glasvezel in de collimatorhouder passen&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu;m diameter UV-vis fiber optic cable</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter with drive unit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td>

bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een insect model van<em&gt; in vivo</em&gt; intracellulaire recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellulaire opname is een krachtige techniek gebruikt om te bepalen hoe een enkele cel kan reageren op een bepaalde prikkel. In de visie van het onderzoek, is de intracellulaire opname van oudsher een veel voorkomende techniek die gebruikt wordt om de gevoeligheden van de individuele fotoreceptorcellen bestuderen om ander licht stimuli die nog vandaag wordt gebruikt geweest. Toch blijft er een gebrek aan gedetailleerde methodologie in de literatuur voor onderzoekers die willen intracellulaire opname experimenten repliceren in het oog. Hier presenteren we de insecten als model voor het onderzoeken oog fysiologie algemeen. Insect fotoreceptorcellen bevinden zich in de buurt van het oppervlak van het oog en zijn dus gemakkelijk te bereiken, en veel van die betrokken zijn bij de visie mechanismen zijn geconserveerd over dierlijke phyla. We beschrijven de basisprocedure voor in vivo intracellulaire opname van fotoreceptorcellen in het oog van een vlinder, met het doel om deze techniek toegankelijker voor onderzoekers maar weinig ervaring in electrophysiology. We introduceren de basisuitrusting die nodig is, hoe je een live-vlinder voor te bereiden voor het opnemen, hoe je een glas micro-elektrode in een enkele cel, en tenslotte de opname procedure zelf in te voegen. Ook de elementaire analyse van ruwe responsgegevens leggen voor het bepalen van de spectrale gevoeligheid van individuele celtypen. Hoewel onze protocol gericht op het vaststellen spectrale gevoeligheid, andere stimuli (bijv gepolariseerd licht) en variaties van de werkwijze van toepassing op deze opstelling.

Voor veel elementen van de opname setup, heeft een beschrijving niet voldoende detail. Figuur 1 is een schema van de bij de volledige opname setup componenten. In figuur 2, worden spectra weergegeven voor wit licht en elk interferentiefilter een gevoel waarom een correctiefactor nodig is en wat nodig is om deze correctie te berekenen geven. Figuur 3 toont foto&#39;s en een schema van de Cardan arm die wordt gebruikt voor deze experimenten. Figuur 4</str...

De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.

Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulaire Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Het algemene doel van deze methode voor intracellulaire registratie is het bepalen van de spectrale gevoeligheid van individuele fotoreceptorcellen in het facetogen van een insect in vivo. Deze methode kan ons vertellen of de golflengten van het licht waar een cel gevoelig voor is, worden beïnvloed door filterpigmenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we, door de spectrale gevoeligheden van individuele fotoreceptoren te kennen, kunnen voorspellen welk bereik aan kleuren een dier kan zien.Ter voorbereiding op de opname dient de xenonlamp ten minste 45 minuten voor het experiment te worden ingeschakeld, en de micro-elektrodepuller ten minste 30 minuten voordat de glazen elektroden worden getrokken. Schakel vervolgens alle opnameapparatuur in. Zorg ervoor dat de sluiter standaard gesloten is, zodat er geen licht door de glasvezelkabel gaat.Trek vervolgens fijne borosilicaatglas micro-elektroden met de micro-elektrodenpuller. Vul de elektroden vervolgens met drie molair kaliumchloride. Om het specimen voor te bereiden, wordt onder de microscoop een individuele vlinder met warme was in een klein plastic buisje bevestigd, zodanig dat de kop onbeweeglijk is en uit één uiteinde van het buisje steekt.Bevestig vervolgens de snuit, antennes en vleugels met was. Houd daarna het achterlijf vast met een droog stukje was. Houd de buis bevochtigd door een nat tissue erin te plaatsen, achter het achterlijf van het specimen.Zorg ervoor dat het specimen volledig immobiel is. Monteer vervolgens de buis met een klein stukje was op een klein platform met een kogelgewricht dat is bevestigd aan een magnetische basis. Voer onder een dissectiemicroscoop een zilverdraad via het mondgedeelte in de kop in, als referentie-elektrode.Bevestig de draad vóór het experiment permanent aan het platform. Maak vervolgens met een scheermesje een klein gaatje in het linkerhoornvlies en dicht dit gaatje af met Vaseline om uitdroging te voorkomen. Zodra het hoornvlies is ingesneden, dient de registratie-elektrode zo snel mogelijk in het oog te worden ingebracht, omdat hemolymfe in het oog snel stolt, waardoor het inbrengen van een elektrode onmogelijk wordt.Voer de dissectie indien mogelijk uit in de opstelling waarin de registratie zal plaatsvinden. Verbind vervolgens de aarddraad van de headstage met de referentie-elektrode op het monsterplatform met behulp van de krokodillenklemmen. Bevestig de elektrode in de elektrodehouder.Plaats vervolgens de zilverdraad in de kaliumchlorideoplossing in de microelektrode. Gebruik een lichtbron met flexibele zwanenhalsbevestigingen om het specimen onder een stereomicroscoop te verlichten terwijl de elektrode in het oog wordt gebracht. Pas de elektrodehouder aan zodat de microelektrode zich direct boven het eerder in het hoornvlies gemaakte gat bevindt.Laat vervolgens de microelektrode met de micromanipulator in het oog zakken totdat het circuit is gesloten. Zodra de elektrode zich in het oog bevindt, zwaait u het stereoscoop buiten de kooi van Faraday. Schakel de lichtbron die het specimen verlicht uit en laat het insect 10 tot 20 minuten in het donker voor donkeradaptatie.Controleer de weerstand van de elektrode door een stroom van 1 nanoamp toe te passen en de verandering in spanning te noteren. De weerstand moet doorgaans liggen in het bereik tussen 100 en 250 megaohm. Activeer vervolgens de pulsgenerator om gedurende het experiment een lichtflits te leveren en richt de glasvezelkabel naar het oog.Controleer de oscilloscoop op spanningsveranderingen bij elke lichtflits. Een negatieve spanningsverandering geeft aan dat de elektrode de cel nog niet is binnengedrongen. Verplaats de glasvezelkabel rond het specimen totdat een maximale spanningsrespons wordt waargenomen.Om een depolariserende lichtrespons op te wekken, roteert u de micromanipulator heen en weer, wat resulteert in kleine verticale bewegingen van de elektrode, terwijl u lichtjes tegen de basis van de elektrodehouders tikt of de buzz-functie op de voorversterker gebruikt. Blijf kleine aanpassingen maken totdat er een depolariserende lichtrespons op de oscilloscoop verschijnt. Pas vervolgens de glasvezelkabel aan om het grootste depolariserende signaal te vinden.Voer kleine aanpassingen uit met een micromanipulator en gebruik indien nodig de buzz-functie op de versterker om er zeker van te zijn dat de elektrode de cel stabiel registreert. Een stabiele registratie moet weinig tot geen verandering in het rustpotentiaal vertonen, een lage achtergrondruis hebben en een consistent sterke depolariserende respons geven. Het is essentieel om een stabiele registratie te hebben waarbij het rustmembraanpotentiaal niet ruisig is en in de loop van de tijd niet verandert.De responsen moeten groot en positief zijn zonder hyperpolarisatie. Zodra de opstelling stabiel is, opent u de software en sluit u het dialoogvenster "Experiments Gallery" om een pop-upvenster met vier kanalen te openen. Pas de voltageschaal in de rechterbovenhoek van het softwarevenster aan naar 500 millivolt.Klik vervolgens op Start in de rechterbenedenhoek om de opname te starten. Minimaliseer kanaal drie en vier en pas de X- en Y-schaal aan. Laat de software daarna draaien voor de duur van het experiment.Registreer voor stimulatie met wit licht tot 10 individuele responsen, waarbij het ND-filterwiel wordt ingesteld op de hoogste OD die nog steeds een respons uitlokt. Hier wordt de verandering in respons getoond bij 3,0 OD en 2,0 OD. Registreer vervolgens hetzelfde aantal responsen van 3,5 tot 0,0 OD, in elke combinatie, om een intensiteitscurve van de responslog te verkrijgen. Bepaal eerst snel de piekgolflengte voordat de respons van de cel op alle golflengten met behulp van de interferentiefilters wordt geregistreerd.Plaats, zonder ND-filter in het lichtpad, een UV-doorlatend filter en observeer kort de responsamplitude. Herhaal de procedure met een blauw doorlatend filter, een groen doorlatend filter en een rood doorlatend filter, wat een indicatie geeft van waar de piekrespons zal liggen. Noteer de filtergolflengte die de maximale respons geeft voordat u overschakelt naar een ander interferentiefilter.Sta tussen opnames met opeenvolgende filters toe dat de cel reageert op één tot twee flitsen wit licht zonder filter in het lichtpad, om te kunnen controleren of de piekrespons in de loop van de tijd afneemt. Neem vervolgens opnames op met andere interferentiefilters, waarbij maximaal 10 responsen per filter worden toegestaan. Dit is een voorbeeld van een grote negatieve spanningsverandering die wordt waargenomen vlak voordat een cel wordt binnengegaan.Hier wordt een schone opname getoond, met weinig achtergrondruis en een grote depolariserende respons, doorgaans van minstens 40 millivolts. En hier is een voorbeeld van een slechte opname, vanwege de negatieve potentiaalverandering na de hoofdpiek. Dit is nog een voorbeeld van een slechte opname.Het rustpotentiaal vertoont grote schommelingen, en de grote hoeveelheid achtergrondruis kan de amplitude van de respons maskeren. Dit is een representatief voorbeeld van spectrale gevoeligheid afgeleid van een enkele opname. De celtypen worden geclassificeerd op basis van de piekgevoeligheid bij een vergelijkbare golflengte en de algemene vorm van het gevoeligheidsspectrum.Vervolgens worden dezelfde celtypen gemiddeld, en wordt de gemiddelde gevoeligheid uitgezet met standaardfoutbalken bij elke golflengte. Deze grafiek toont de spectrale gevoeligheden van drie typische celtypen die in een insect worden aangetroffen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden uitgevoerd.Na deze procedure kunnen gedragsexperimenten worden uitgevoerd om vast te stellen of alle typen fotoreceptorcellen bijdragen aan kleurdiscriminatie of niet.

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila's ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Een protocol voor de studie van desensibilisatie en gevoeligheid herstel van rivierkreeft fotoreceptoren als een functie van de circadiane tijd wordt gepresenteerd.

Desensibilisatie en herstel van de kleurplaatjes bij de afgifte van een licht stimulus

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Leer intracellulaire registratie om spectrale gevoeligheid van fotoreceptorcellen in vlinderogen te meten. Deze methode voorspelt kleurzicht en onthult hoe filterpigmenten lichtgevoeligheid beïnvloeden.

Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van

Meer video's verkennen