Name: Glaucoom-inducerende Procedure in een In Vivo Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer een glaucoom-inducerende procedure voor onderzoek naar netvliesganglioncellen in ratten. Deze methode maakt geleidelijk RGC-verlies mogelijk voor studies naar neurale bescherming en oogaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. Linn wordt ondersteund door een NIH-subsidie (NIH NEI EY022795).

Alle procedures met behulp van proefdieren zijn in overeenstemming met de normen van het Institute for Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan Western Michigan University geweest. 1. Dieren <ol><li> Gebruik mannelijke en vrouwelijke ratten leeftijd van 3 maanden in deze studie. </li><li> Houd dieren in een 12 uur licht / donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water. </li></ol> 2. Voorbereiding van de KAX Cocktail for Animal Anesthesie <ol><li> Los 50 mg xylazine (20 mg / ml) in 5 ml ketamine (100 mg / ml) met 1 ml acepromazine (10 mg / ml) en 3 ml gedestilleerd water. Meng goed. </li><li> Steriliseren met een spuitfilter en bewaar deze oplossing in een 10 ml serum flessen. </li></ol> 3. KAX Injection <ol><li> Weeg dier (g) en opnieuw kooi tot klaar voor injectie. </li><li> Injecteer 0,1 ml KAX / 100 g lichaamsgewicht van het dier intraperitoneaal, onder toepassing van een 1 ml insulinespuit met een 28 G naald. </li><li> Toestaanvoor dier bewusteloos raken. Controleer reflexen door knijpen de voeten en staart. </li><li> Houd alle dieren veilig lab voor de duur van de operatie. </li><li> Na de operatie, dieren te vervangen in hun kooien en in RT houden comfortabele tot bewustzijn herwonnen. Alleen dieren terug te keren naar het dier faciliteit wanneer de dieren ontwaken en weer normaal gedrag. </li></ol> 4. voorbereiding op een operatie en Microneedle Assembly <ol><li> Maak een steriele 2 M NaCl-oplossing. </li><li> Gebruik een micro-elektrode trekker (figuur 1C) trekken een 0,86 mm binnendiameter zware gepolijste standaard en dunwandige borosilicaat buis in twee fijn taps toelopende glazen micronaalden (figuur 1D, figuur 1E). </li><li> Backfill een micronaald van de voorgaande stap met 2 M zoutoplossing met een opvullen injectienaald en een 1 ml injectiespuit (Figuur 1B). Kraan uit luchtbellen vanaf de punt van de elektrode. </li><li> Vul een tweede 1 ml spuit met 2 MNaCl. Sluit een 18 G naald en sluit vervolgens een lengte (ongeveer 10 inch) van polyethyleen buis (figuur 1A). Gebruik de zuiger om de polyethyleen buis met een zoutoplossing te vullen door de naald. </li><li> Wanneer zowel de micronaald leidingen zijn gevuld met zoutoplossing zorgvuldig de twee verbinden. Verwijder eventuele lucht in hun samenhang (figuur 2). </li><li> Fijn bevel het topje van de microneedle door schrapen het erg licht tegen de nerf van een cursus papieren handdoek. </li><li> Weerstand van de micronaald diept de zuiger van de spuit totdat een fijne vloeistofstroom te zien op de papieren handdoek. De stroom vloeistof mag niet breder dan 0,5 mm. </li></ol> 5. Voorbereiding van de Animal <ol><li> Toepassen 1-2 druppels topisch verdovingsmiddel hoornvlies (proparacaïne hydrochloride oogdruppels, USP, 0,5%). Wacht tot er geen oculaire reflex optreedt. </li><li> Trim snorharen met een schaar. </li><li> Saturate een katoenen tip applicator met betadine oplossing en swab gebied rond de experimentele oog. </li><li> Met behulp van een microscoop, voeg een hemostaat naar de bodem ooglid klem voor het oog uitpuilen, bloot de ader episclerale en oogbeweging te beperken. (Figuur 3, pijlpunt) </li></ol> 6.-Glaucoom inducerende Saline Injection <ol><li> Wanneer de micronaald montage en de dieren worden bereid, beginnen injecties. </li><li> Wanneer het dier wordt bevestigd reageert voeten / staartknijptest worden voorzichtig doorboren ader de episclerale de micronaald door te komen onder een kleine hoek tussen 10 en 20 graden om de ader (figuur 3, witte pijl). Een succesvolle punctie in de ader is duidelijk wanneer bloed in de punt van de micronaald (figuur 3, zwarte pijl). </li><li> Langzaam en handmatig injecteren ongeveer 50 pi zoutoplossing in de ader. Dit duurt ongeveer 10 seconden duren. De aderen zal blancheer wit als het zout circuleert through het vaatstelsel (Figuur 4, pijlpunt). Sommige regio&#39;s kunnen een bloedrode uiterlijk (figuur 4, pijl) te handhaven. <ol><li> Voer een tweede injectie in de ader, tegenover de plaats van de eerste, grondig retinale schade aan totale retinale ganglion cellaag waarborgen. Opmerking: Binnen minuten, moet men een duidelijk troebel uiterlijk door de iris van het oog te zien als het zout circuleert door het vasculaire systeem. </li></ol></li><li> Laat het tegenovergestelde oog onbehandeld voor gebruik als een interne controle. </li></ol> 7. Animal Recovery <ol><li> Verwijder de hemostaat. </li><li> Gebruik een katoenen applicator triple antibiotische zalf (Zinkbacitracine, neomycine sulfaat, polymysin B sulfaat) van toepassing zijn op de plaats geklemd door de hemostaat en injectieplaatsen. Weefselbeschadiging rond de ogen niet optreedt met de hemostaat. </li><li> &gt; Plaats verdoofde dieren in hun kooien op een circulerende warm water deken om prevent onderkoeling. Houd dieren onder observatie tot het bewustzijn en normaal gedrag worden herwonnen. Vervoeren wakker dieren terug naar het dier kolonie. Dierlijke oorsprong in de kolonie tot het moment van opoffering. </li></ol> 8. Animal Sacrifice en Retina Removal <ol><li> Een maand na de procedure om glaucoom te induceren, worden de dieren gedood door CO 2 stikken en secundaire thoracale punctie. <ol><li> Plaats het dier in de kamer en doe de deksel op stevig. </li><li> Open de CO 2 en gas regelkleppen tot 20% volume / min CO 2 verplaatsing van toelaten zuurstof in de kamer. </li><li> Laat vier tot 5 min voor het dier te vervallen. </li><li> Schakel beide kleppen. </li><li> Verwijder dier uit de kamer en het uitvoeren van een secundaire thoracale punctie met een steriele scalpel. </li></ol></li><li> Na euthanasie Gebruik een scalpel om het bindweefsel in de orbitale holte rond het oog, bei gesnedenng voorzichtig niet te snijden in de oogbol zelf. </li><li> Gebruik gebogen rand schaar voorzichtig naar de oogzenuw en het resterende weefsel gesneden om de intacte oogbol extraheren. Plaats gewonnen oogbol in een steriele 60 mm x 15 mm wegwerp petrischaal met vers PBS. </li><li> Maak een oogdop van de oogbol. Om dit te doen, maak een kleine incisie met de scalpel juist achter bij de grens tussen de iris en de sclera. Volg de insnijding rond de omtrek van het oog met spring schaar om het hoornvlies van de oogbol hemisfeer verwijderen. De halve bol verbonden met de oogzenuw blijft. </li><li> Vind de zeer dunne roze / beige retina in de oogschelp van de geëuthanaseerd dier. Houd de gepigmenteerde laag van het netvlies met stompe tang om de oogschelp stabiliseren. Met een paar gesloten tang om zachtjes plagen de gehele intacte retina weg van de achterkant van het oog. Vermijd knijpen, trekken, of direct trekken het netvlies. </li><li> Gebruik maken van kleine lente schaar om de knippenwaar de oogzenuw nog aan het netvlies. </li><li> Zorg ervoor dat u weg te snijden eventueel resterende pigment epitheel of sclerale weefsel van het netvlies. </li><li> Met behulp van een overdracht pipet zachtjes de geïsoleerde retina brengen naar een schone Sylgard beklede 35 mm x 10 mm petrischaaltje met vers PBS. </li></ol> 9. Whole-Mount Retina Voorbereiding <ol><li> Eenmaal in de Sylgard schotel, een tang en een cactus naald aan het netvlies pin op zijn plaats. Houd de retinale ganglion cellaag naar boven en de oogzenuw naar beneden. halfronde vorm van het netvlies is opmerkelijk, zelfs na fixatie. De kromming van het netvlies zal krullen naar het plafond bij de retinale ganglion cellaag in de gewenste oriëntatie. </li><li> Gebruik maken van kleine schaar om het netvlies te snijden in vier kwadranten, waardoor de vorm van een klavertje vier uitlopen van de oogzenuw hoofd. </li><li> Speld de kwadranten van het netvlies met extra cactusnaalden de retina zo plat mogelijk maken without strekken (figuur 5). </li><li> Bevestig de gespelde netvlies in de Sylgard schotel met 3 ml 4% paraformaldehyde O / N bij kamertemperatuur. </li></ol> 10. Antilichaam kleuring van de Retina Opmerking: Stain vaste netvlies met primaire en secundaire antilichamen voor het bekijken van neuronen in de retina (Figuur 6). <ol><li> Spoel vast, een flatscreen-gemonteerde netvliezen drie keer gedurende 2 minuten elk in PBS. </li><li> Permeabilize het netvlies met 1% Triton X-100 met 1% foetaal bovien serum in PBS gedurende 60 min. </li><li> Spoel netvlies driemaal 2 minuten elk met PBS. </li><li> Spoel tweemaal met 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 minuten per wasbeurt. </li><li> Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt. </li><li> Incuberen met 1% Triton X-100 en 1% foetaal runderserum in PBS bij kamertemperatuur gedurende 45 min. </li><li> Spoel tweemaal met 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 minuten per wasbeurt. </li><li> Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt. </li><li> Incubeer elke retina in 3 ml 1% foetaal runderserum in PBSmet gezuiverd muis-anti-rat CD90 / muis CD90.1 (1: 300 verdunning) O / N bij RT. </li><li> Spoel netvlies eenmaal met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt. </li><li> Incubeer elke retina in 3 ml PBS (zonder FBS) met secundaire Alexa Fluor 594 geit anti-muis IgG (1: 300) O / N bij kamertemperatuur. </li><li> Was netvliezen met PBS royaal. </li><li> Met behulp van een microscoop ontleden, verwijder voorzichtig cactus naalden van het netvlies. </li><li> Voorzichtig overdracht netvliezen op microscoopglaasjes met een transfer pipet. Zorg ervoor dat u oriëntatie retinale ganglion cellaag gericht naar het plafond te behouden. halfronde vorm van het netvlies is opmerkelijk, zelfs na fixatie. De kromming van het netvlies zal krullen naar het plafond bij de retinale ganglion cellaag in de gewenste oriëntatie. </li><li> Absorberen overtollige PBS met KimWipe of andere dergelijke absorberend materiaal. Wees voorzichtig het netvlies niet te absorberen. </li><li> Voeg 5 druppels ½ glycerol en ½ PBS per gewicht als ochtendtijdounting media. </li><li> Bedek retina met dekglaasje, het vermijden van luchtbellen. </li><li> Secure dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak, lijm of andere lijm. </li></ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige of concurrerende belangen te melden.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het induceren glaucoom-achtige omstandigheden in een in vivo rattenmodel. In deze procedure wordt een injectie van hypertone zoutoplossing om littekenvorming te induceren in het trabeculaire netwerk 29, 32. Ontwikkeling littekenweefsel afsluit de uitstroom van waterige humor waardoor de druk in de voorste kamer toeneemt. Met een verminderde uitstroom en drukopbouw, de lens opgehangen aan elastische ligamenten duwt terug in het glasvocht kamer. Glasvocht geld...

Glaucoom is een groep van oogziekten invloed neuronen in het netvlies, in het bijzonder, de retinale ganglioncellen 1-2. De axonen van deze cellen convergeren naar de oogzenuw uitvoering visuele informatie naar de hersenen waar het zicht wordt waargenomen worden. Schade aan RGC en hun axonen veroorzaakt daarom visuele gebreken. De belangrijkste kenmerken die geassocieerd worden met glaucoom aandoeningen zijn RGC degeneratie en dood, verhoogde intra-oculaire druk (IOP) en optische schijf cupping en atrofie. Deze kenmerken leiden tot gezichtsveld verlies of volledige, onomkeerbare blindheid. Op dit moment, glaucoom heeft blindheid veroorzaakt in 70 miljoen mensen wereldwijd 3. Als zodanig is het &#39;s werelds derde grootste oorzaak van blindheid 4. Het exacte mechanisme van RGC dood in glaucoom blijft onbekend. Er is veel onderzoek gedaan om het mysterie te ontgrendelen. Het is echter bekend dat de primaire risicofactor glaucoom verhoging in intraoculaire druk door onregelmatige circulatie van waterig lichaamsvocht (AH) in de voorste kamer van het oog. AH fungeert als een transparante en kleurloze vervanging voor bloed in de avasculaire voorste kamer van het oog. Het voedt de omringende cellen, verwijdert uitgescheiden afvalproducten uit metabolische processen, transporten neurotransmitters, en maakt de verspreiding van drugs en ​​inflammatoire cellen in het oog tijdens pathologische toestanden 1. Het onderhoud van waterige humor omloop betreft het ciliaire lichaam en het trabeculaire netwerk. Kamerwater wordt geproduceerd door het corpus ciliare. Vervolgens stroomt in de voorste kamer naar de algehele gezondheid van het oogweefsel handhaven. 75-80% van de waterige humor uitstroom actief uitgescheiden via niet-pigment ciliaire epitheel wanneer het fluïdum wordt gefiltreerd door drie lagen sponsachtige weefsel in de ciliaire spier. De vloeistof verlaat via de trabeculaire netwerk en via het kanaal van Schlemm die emptven in het bloedsysteem 5 .De resterende 20-25% van uitstroom omzeilt het trabeculaire netwerk en passief uitgescheiden door ultrafiltratie en diffusie door de uveo-sclerale route. Deze route lijkt relatief onafhankelijk van de intraoculaire druk 1 zijn. Wanneer waterige humor productie en uitstroom uit balans zijn, druk opbouwt in het oog. Zoals gezegd, deze toename van de intraoculaire druk is de belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van glaucoom. Dergelijke druk veroorzaakt schade aan de ingewikkelde lagen van neuronen in het netvlies aan de achterkant van het oog. Beschadiging van de retinale ganglioncellen axonen van de oogzenuw veroorzaakt de hersenen om nauwkeurige visuele informatie niet meer ontvangen. Hierdoor wordt de perceptie van het gezichtsvermogen verloren en volledige blindheid kan optreden. Tot op heden is er geen behandeling voor glaucoom. Verschillende behandelmethoden bestaan ​​die in de eerste plaats gericht zijn op de intra-oculaire druk te verminderen. Deze omvatten actueelmedicatie klassen zoals beta1-adrenerge receptorblokkers of topische prostaglandinederivaten. Bèta blokkers verlagen de intraoculaire druk door het verlagen van de productie van kamerwater 7. Prostaglandinen functie om IOP te verminderen door de afvoer van kamerwater 8-14. Alfa- adrenergische agonisten en koolzuuranhydraseremmers worden ook gebruikt als secundaire behandelingsmethoden. Alpha adrenerge agonisten verhogen uitstroom door de uveosclerale route 15-17. Koolzuuranhydraseremmers vermindering van de productie van AH door enzymatische remming 18. Veel meer invasieve procedures worden ook gebruikt voor de behandeling van glaucoom. Lasertrabeculoplastie wordt gebruikt om de uitstroom van waterige humor 19 verhogen. Andere chirurgische therapie, genaamd trabeculectomie, creëert een alternatieve drainage site AH filteren wanneer de traditionele trabeculaire route geblokkeerd 20-21. Deze behandelingen zijn bekend om effectief verminderen IOP. Echter, tot 40% van glaucoom patiënten vertonen normale IOP niveaus en de noodzaak van vollediger therapeutische werkwijzen. 22,23 Bovendien retinale ganglion celdood waargenomen bij glaucoom is onomkeerbaar wanneer het begint en de huidige behandelingen niet de progressie van de ziekte te stoppen 24-28. Dit heeft gewezen op de noodzaak van effectieve neuroprotectieve therapieën die het overleven van de neuronen zelf richten. Ontwikkeling van glaucoom modellen is cruciaal voor deze ontwikkeling. In deze studie demonstreren een werkwijze voor het induceren glaucoom-achtige effecten in volwassen Long Evans ratten onder toepassing van een gemodificeerde werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Morrison 29. In deze procedure injecties van 2 M hypertone zoutoplossing in de episclerale veneuze plexus induceert glaucoom-achtige omstandigheden door littekens weefsel waterige humor uitstroom verlagen in het trabeculaire netwerk leidt tot een toename van intraoculaire druk en een aanzienlijk verlies van RGC within een maand na de procedure 30-31. Glaucoom inducerende procedures, zoals hier beschreven, kan de sleutel tot nieuwe ontwikkelingen in glaucoom behandelingen.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml fles</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml fles</td></tr><tr><td>Serum fles, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>1 ml insulinspuiten&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G naald&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Zwaar gepolijste standaard en dunne wand borosilicaatbuis&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>zonder filament, 0,86 mm</td></tr><tr><td>Microfil spuitnaald voor het vullen van micropipetten</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock naald 18 gauge</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Spuitnaald</td></tr><tr><td>Flexibele polyethyleen buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0,034 inch diameter, ongeveer 10 inch&nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0,5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; steriele fles&nbsp;</td></tr><tr><td>Gekromde schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostaatklem&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>gebogen rand</td></tr><tr><td>Drievoudig antibioticumzalf&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpatuurhandvat</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpatuurblad #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Wegwerp Petri-schaal</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing 10x Concentraat</td><td>Sigma, Life Science&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x verdunning&nbsp;</td></tr><tr><td>Veer schaar</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipetten, polyethyleen, niet sterieel</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 of 52947-948</td><td>1 en 2 ml graduaties</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri-schaal&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactusnaalden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 of 818715.0100</td><td>Gemaakt tot een 4% oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Gemaakt tot zowel een 1% als 0,1% oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Gezuiverde muis Anti-rat CD90/muis CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 verdunning&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 geit anti-muis&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 verdunning&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>50% glycerol tot 50% PBS, naar gewicht&nbsp;</td></tr><tr><td>Dekglaasje&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Dikt 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoom-inducerende procedure in een<em&gt; in vivo</em&gt; rat model en whole-mount retina voorbereiding

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoom is een ziekte van het centrale zenuwstelsel die retinale ganglioncellen (RGC&#39;s). RGC axonen die deel uitmaken van de oogzenuw te voeren visuele input naar de hersenen voor visuele waarneming. Schade aan RGC en hun axonen leidt tot verlies van het gezichtsvermogen en / of blindheid. Hoewel de specifieke oorzaak van glaucoom is niet bekend, de belangrijkste risicofactor voor de ziekte een verhoogde intraoculaire druk. Glaucoom inducerende procedures in diermodellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers bestuderen van het mechanisme van RGC dood. Dergelijke informatie kan leiden tot de ontwikkeling van effectieve neuroprotectieve behandelingen die kunnen helpen bij het voorkomen van gezichtsverlies. Het protocol in dit document beschrijft een werkwijze voor het induceren glaucoom - achtige omstandigheden in een in vivo rattenmodel wanneer 50 gl 2 M hypertone zoutoplossing wordt geïnjecteerd in de episclerale veneuze plexus. Blancheren van de schepen geeft succesvolle injectie. Deze procedure veroorzaakt verlies van RGCs glaucoom simuleren. Een maand nainjectie worden de dieren opgeofferd en ogen verwijderd. Next, het hoornvlies, lens en glasvocht worden verwijderd om een ​​oogschelp te maken. Het netvlies wordt dan afgepeld van de achterzijde van het oog en vastgemaakt op Sylgard gerechten met cactusnaalden. Op dit punt kunnen neuronen in het netvlies worden gekleurd voor analyse. De resultaten van dit lab blijkt dat ongeveer 25% van RGC verloren binnen een maand na de procedure in vergelijking met interne controles. Deze procedure maakt de kwantitatieve analyse van retinale ganglion celdood in een in vivo rat model glaucoom.

In dit gedeelte van de inrichting onderdelen en procedure voor glaucoom-achtige omstandigheden in een in vivo ratten glaucoom te induceren. We tonen de afzonderlijke gereedschappen en apparatuur die een hypertone zoutoplossing of een stijging van de intraoculaire druk veroorzaakt voeren. We tonen de injectie in de episclerale veneuze plexus met zijn karakteristieke blancheren effect en de vertroebeling van de voorste kamer dat resulteert. We beschrijven ook het proces van het ne...

Glaucoom wordt gekenmerkt door schade aan retinale ganglioncellen. Het induceren van glaucoom in diermodellen kan inzicht geven in de studie van deze ziekte. Hier schetsen we een procedure die verlies van RGC's induceert in een in vivo rattenmodel en de voorbereiding van gehele netvliezen voor analyse demonstreert.

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Het algemene doel van deze procedure is om een aanzienlijk verlies van retinale ganglioncellen in de retina van de rat te veroorzaken door het induceren van glaucoom-achtige condities. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van glaucoom en neurale protectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een geleidelijk verlies van retinale ganglioncellen veroorzaakt, vergelijkbaar met wat wordt gezien bij menselijk glaucoom.Om deze procedure te starten, worden twee fijn taps toelopende glazen micronaalden getrokken uit een zware, gepolijste standaard dunwandige borosilicaatbuis met een micro-elektrodetrekker. Vul vervolgens één micronaald via de achterzijde met 2 M saline met behulp van een syringe van 1 ml. Tik de luchtbellen uit de punt van de elektrode.Vul vervolgens een tweede spuit van één milliliter met twee molair NaCl. Verbind deze met een naald van 18 gauge en bevestig de naald vervolgens aan een polyethyleenslang van 10 inch. Gebruik de zuiger van de spuit om de polyethyleenslang via de naald te vullen met zoutoplossing.Wanneer zowel de micronaald als de slang zijn gevuld met zoutoplossing, worden deze zorgvuldig met elkaar verbonden. Verwijder alle lucht in de verbinding door de luchtbellen weg te tikken. Schraap vervolgens de punt van de micronaald lichtjes tegen een papieren handdoek om deze fijn af te schuinen.Controleer de weerstand van de micronaal door de zuiger van de spuit voorzichtig in te drukken totdat er een fijne stroom vloeistof op het keukenpapier zichtbaar is. De vloeistofstroom mag niet breder zijn dan 0,5 millimeters om de juiste integriteit van de naaldpunt te waarborgen. Controleer bij deze procedure, na het anesthetiseren van het dier met KAX-cocktail, de reflexen door in de poten of de staart te knijpen om er zeker van te zijn dat het dier bewusteloos is.Trim vervolgens de snorharen met een schaar. Verzadig daarna een wattenstaafje met betadine-oplossing en reinig het gebied rond het experimentele oog. Gebruik onder de microscoop een hemostat om het onderste ooglid vast te klemmen, zodat het oog uitpuilt, de episclerale vene bloot komt te liggen en de oogbeweging wordt beperkt.Doorboor vervolgens voorzichtig de episclerale vene met de micronaald onder een hoek van 10 tot 20 graden ten opzichte van de vene. Een punctie van de vene is succesvol wanneer er bloed in de punt van de micronaald wordt waargenomen. Injecteer langzaam 50 µL saline in de vene.De aderen kleuren wit terwijl het zout door de vaten circuleert, hoewel sommige regio's een bloedrode kleur kunnen behouden. De meest kritische stap in deze procedure vindt plaats tijdens de injectie van de twee molaire zoutoplossing. Het is essentieel dat er witverkleuring in de vaten optreedt om een succesvol resultaat te garanderen.Het behouden van een stabiele naald en een hoek van 20 graden is cruciaal voor deze procedure. Voer daarna een tweede injectie in de vene uit om volledige beschadiging van de retinale ganglioncellaag te waarborgen. Binnen enkele minuten moet er een duidelijk troebel uiterlijk door de iris van het oog zichtbaar worden, naarmate het zout door het vaatstelsel circuleert.Gebruik nu een scalpel om het bindweefsel in de oogkas rondom het oog door te snijden, waarbij u er zorg voor draagt dat u niet in de oogbol zelf snijdt. Snijd vervolgens voorzichtig de oogzenuw en het resterende weefsel door om de intacte oogbol met de gebogen schaar te verwijderen. Plaats de verwijderde oogbol in een steriele petrischaal met verse PBS.Maak vervolgens een oogcup van de oogbol door met het scalpel een kleine incisie te maken net posterior van de grens tussen de iris en het sclera. Zet de incisie voort rondom de omtrek van het oog om de cornea-hemisfeer uit de oogbol te verwijderen. Houd de gepigmenteerde laag van het retina met een pincet vast om de oogcup te stabiliseren en gebruik een tweede pincet om het roze-beige, intacte retina voorzichtig los te scheuren van de achterzijde van het oog.Snijd vervolgens het gebied waar de oogzenuw aan het netvlies is bevestigd door of knijp dit af. Zorg ervoor dat al het resterende pigmentepitheel of scleraal weefsel van het netvlies wordt verwijderd. Breng daarna het geïsoleerde netvlies voorzichtig over naar een schone, met Sylgard gecoate petrischaal met verse PBS.Zodra het netvlies in de Sylgard-schaal ligt, wordt het met pinnen op zijn plaats vastgezet. Zorg dat de laag met ganglioncellen naar boven is gericht en de oogzenuw naar beneden. Snijd het netvlies vervolgens in vier kwadranten, in de vorm van een klaverblad, uitwaaierend vanaf de papil van de oogzenuw.Zet vervolgens de kwadranten van het netvlies vast met extra cactnaalden om het netvlies zo vlak mogelijk te maken zonder het uit te rekken. Fixeer daarna het vastgezette netvlies in de Sylgard-schaal met drie milliliter 4%paraformaldehyde gedurende de nacht bij kamertemperatuur voordat de standaard kleuringsprocedures worden uitgevoerd. Hier is een vergelijking tussen het onbehandelde controle-oog en het experimentele oog, één maand na de zoutoplossinginjectie ter inductie van glaucoom.De retinale ganglioncellen zijn gelabeld met een antilichaam tegen Thy 1.1. De procedure leidt tot een vermindering van het aantal RGC's, defasciculatie van de axonen van de belangrijkste axonbundels en een vervorming van de circulariteit van de resterende RGC's. Dit zijn de karakteristieke defasciculerende axonen als gevolg van de zoutoplossingsinjectie.Een bloedvat is zichtbaar in het netvlies, en dit zijn de axonbundels. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er altijd een nieuwe, scherpe, schuine micronaal moet worden gebruikt.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals immunocytochemie, Western Blots, in situ hybridisatie, mRNA-sequencing of gedragsanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen over glaucoom te beantwoorden, zoals de manier waarop het verlies van retinale ganglioncellen de visuele scherpte van dieren beïnvloedt. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van glaucoom om neuroprotectieve strategieën bij ratten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een significant verlies van retinale ganglioncellen bij de rat kan worden geïnduceerd met behulp van een hypertone zoutoplossing-injectie in de episclerale vene.

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Hier presenteren we een protocol om intraoculaire drukverhoging te induceren in het muizen oog dat resulteert in het verlies van retinale ganglioncellen zoals waargenomen in glaucoom. Magnetische microkralen worden geïnjecteerd in de voorste kamer en aangetrokken door de iridocorneale hoek met een magneet om de uitstroom van waterige humor te blokkeren.

Een Magnetic Microbead occlusie Model voor het induceren van oculaire hypertensie-Dependent Glaucoom in Muizen

Het volgende rapport beschrijft hoe je het knaagdiermodel van nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION) kunt repliceren, met behulp van de juiste kleurstof, contactlens en laserparameters. We onthullen ook de juiste stappen voor het evalueren van de rNAION-laesie in vivo.

Het knaagdier Model van nonarteritic anterior ischemische optische neuropathie (rNAION)

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor het onderzoeken van een vorm van chemische neurostimulatie van wholemount rat netvlies in vitro met de neurotransmitter glutamaat. Chemische neurostimulatie is een veelbelovend alternatief voor de conventionele elektrische neurostimulatie van retinale neuronen voor de behandeling van onomkeerbare blindheid veroorzaakt door fotoreceptor degeneratieve ziekten.

Methodologie voor biomimetische chemische neuromodulatie van Rat netvlies met de Neurotransmitter glutamaat In Vitro

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Chronische oculaire hypertensie wordt geïnduceerd door het toepassen van een circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen, wat leidt tot functionele en structurele verslechtering van de retinale peesknoopcellen overeenstemming met glaucoom.

Een Model van glaucoom veroorzaakt door Circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen

Zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) kan worden gebruikt om ischemische netvliesaandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit en proliferatieve diabetische retinopathie te modelleren en om te dienen als model voor proof-of-concept studies bij het evalueren van antiangiogene geneesmiddelen voor neovasculaire ziekten. OIR induceert robuuste en reproduceerbare neovascularisatie in het netvlies die kan worden gekwantificeerd.

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Leer een glaucoom-inducerende procedure voor onderzoek naar netvliesganglioncellen in ratten. Deze methode maakt geleidelijk RGC-verlies mogelijk voor studies naar neurale bescherming en oogaandoeningen.

Glaucoom-inducerende Procedure in een

Meer video's verkennen