Name: Systems Biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor Signalering in Borstkanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Verken de metabole regulatie van ER Alpha in borstkanker door transcriptoom-, cistroom- en metaboloomdata te integreren. Deze methode biedt inzicht in transcriptiefactoren en metabole mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw, US Department of Agriculture, award ILLU-698-909 (ZME) en Pfizer, Inc (ZME). De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

1. Bereiding van RNA-Seq Monsters <ol><li> Celkweek en behandeling <ol><li> Cultuur MCF7 cellen Verbeterde MEM (IMEM) plus fenolrood-medium met 10% warmte inactief FBS, 1% penicilline / streptomycine bij 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Let op: Zelfde cellijn en celkweek voorwaarde is gedurende het onderzoek gebruikt. </li><li> Zaad MCF7 100.000 cellen per putje in 6-well platen. Hebben drie exemplaren voor elke behandeling. Op dag 3 Verwijder het medium en voeg 2 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. </li><li> Om de cellen te oogsten, voeg 1 ml RNA-isolatie reagens (zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform) in elk putje en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT). verzamel dan het cellysaat reagentia door pipetteren en storting in 1,5 ml buisjes </li></ol></li><li> RNA Isolation <ol><li> Voeg 200 ul chloroform tot 1 ml cellysaat reagens (1.1.3) en vortex gedurende 10 seconden. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Na centrifugatie Breng de waterige fase (top) naar een nieuwe buis zonder de andere fasen. </li><li> Voeg 500 pi 100% isopropanol naar een nieuwe buis overgebracht met de waterige fase, en meng door. Incuberen bij -20 ° C overnacht. Centrifugeer de monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zich aan een pellet op de bodem van de buis. Verwijder het supernatant en was het pellet met 750 gl RNase-vrij 70% ethanol korte vortex. </li><li> Centrifugeer monsters bij 6000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om alle resterende ethanol te verzamelen. Verwijder het resterende ethanol door pipetteren met een gel-lading-punt en zet de buizen naar beneden aan de lucht drogen gedurende 10 min. Los de pellet in 20-50 pi DEPC behandeld water afhankelijk van de grootte van de pellets. </li></ol></li><li> Zuiver het RNA met behulp van RNA clean-up kit volgens het protocol 4. Meet de RNA-concentratie met een fluorometrie gebaseerde assay kit volgens het protocol 9. OPMERKING: OD bij 260 nm wordt verstaan ​​de RNA-concentratie en de verhouding van OD bepaald bij 260 nm en 280 nm worden gebruikt om de zuiverheid van het monster te bepalen. Het wordt aanbevolen het controleren van de kwaliteit van RNA met behulp van Bio-analyzer test. </li><li> Neem ongeveer 0,5 tot 1 pg gezuiverd RNA voor sequentiebepaling. LET OP: Biotech centrum bereidt de sequencing bibliotheken en voert gepaarde-end sequencing lezen met behulp van methoden die eerder 2 beschreven. </li></ol> 2. Voorbereiding van ChIP-Seq Sample <ol><li> Celkweek en behandeling <ol><li> Seed 500.000 MCF7 cellen per 10 cm plaat in groeimedium. LET OP: Voor elke pull-down werden 16 platen gebruikt. Op dag 3, verwijder het medium en voeg 5 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 aan elkaarbord. Behandel de cellen gedurende 45 min (37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer). </li></ol></li><li> Verknopen en Cell Harvest <ol><li> Voeg 250 ul 37% Formaldehyde in 5 ml medium aan chromatine verknopen, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Stop het verknopen door het wassen cellen met 5 ml ijskoude 1x MEM. </li><li> Oogst de cellen in 250 pi Cell Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCI, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-amine oxide) per plaat. </li></ol></li><li> Fragmentatie van chromatine <ol><li> Sonificeer de cellen gedurende 30 seconden x 8 aan versterker 30 van de vereiste grootte chromatine bereikt. Cool elk monster op het ijs na een ultrasoonapparaat van 30 sec. </li><li> Centrifuge bij 16, 000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en voorzichtig pipet de bovenstaande vloeistof zonder de pellet onderin verstoren. </li><li> Neem een 5 pl monster van de bovenstaande vloeistof en controleer de DNA grootte door elektroforese door 1,5% agarosegel zoals eerder 10 beschreven. De ideale grootteDNA moet tussen 200-500 bp. </li></ol></li><li> chromatine Immunoprecipitatie <ol><li> Bewaar 25 pl cellysaat als invoer. In een 50 ml buisje, meng 4 ml cellysaat met 20 ml IP buffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl en 0,5% Triton X), ERa antilichaam (500 pl F10 en 500 gl HC- 20), en 500 pl ProtA en ProtG eiwitbekleding magnetische korrels. Incubeer het mengsel door rotatie bij 4 ° C geïncubeerd om de vorming van chromatin- antilichaamcomplex mogelijk. </li></ol></li><li> Wast en Reverse-verknoping <ol><li> Gebruik een magnetische staan ​​om de magnetische korrels te verzamelen over de gemagnetiseerde kant aan het wassen buffer te verwijderen. </li><li> Was de magnetische korrels in 25 ml wasbuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI, 01% SDS, 1% Triton X, en 150 mM NaCl). Grondig wassen magnetische beads zonder storende DNA-eiwit complexen, voeg 25 ml wasbuffer langzaam aan de buis langs de zijkant keer dan de buizen tot alle magnetische kralen zijn goed gemengd with het wassen buffer zonder dat het lijkt als een pellet. Als alternatief gebruikt de rotator aan de buis om. Laat de monsters niet vortex. Was de magnetische korrels op dezelfde manier in de volgende stappen. </li><li> Was de magnetische korrels in 25 ml Wash-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI, 01% SDS, 1% Triton X, en 500 mM NaCl). </li><li> Was de magnetische korrels in 25 ml Wash-buffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCI, 1% NP-40, 1% Dexycholate en 250 mM LiCl). </li><li> Was de magnetische korrels in 25 ml 1 x TE-buffer (1 mM EDTA en 10 mM Tris HCl) tweemaal. </li><li> Elueer DNA in 500 ui elutiebuffer (1% SDS en 10 mM NaHCOs 3) en vervolgens verdelen de 500 ul DNA-elutie in 4 buizen. Voor het DNA van ingangen, elueren DNA in 125 ui elutiebuffer. </li><li> Incubeer de buizen bij 65 ° C geïncubeerd op een verwarmingsblok. Bedek de buizen op het verwarmingsblok met aluminiumfolie om de warmte ook over alle buizen te houden. Plaats een gewicht op de buizen te openen houden. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> DNA-isolatie <ol><li> Koel de buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Isoleer DNA uit de pull-down monsters met behulp van ChIP DNA isolatie kit. Volg de aanwijzingen van de fabrikant. <ol><li> Warm de elutiebuffer bij 65 ° C. Voeg 625 ul bindingsbuffer aan elke buis. Als de neerslag vormen, voeg nog eens 250 ul bindingsbuffer totdat de oplossing helder is. </li><li> Plaats het monster op de kolom en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 sec. Was het monster met 250 ui wasbuffer. Probeer ethanol toevoegen wasbuffer wanneer eerst te gebruiken. Herhaal het wassen. </li><li> Elueer het DNA in 15 ui elutiebuffer. Combineer het DNA van dezelfde naar beneden trekken van 4 tubes tot ongeveer 55 pi DNA te bereiken. </li></ol></li><li> Isoleer de Input DNA Met behulp van een DNA Purification Kit. <ol><li> Warm de elutiebuffer bij 65 ° C. Voeg 625 ul bindingsbuffer in elke buis en incubeer gedurende 10 min. Laad het monster op de kolom in een 2 ml collectiop de buis. </li><li> Was het monster met 750 ui wasbuffer, centrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 minuut. Herhaal het centrifugeren om de resterende buffer te verwijderen. Elueer het DNA in 30 ui EB. </li></ol></li><li> Meet de DNA-concentratie met behulp van een commerciële Fluorochrome Assay met Wijziging 11. <ol><li> Verdun de 20x TE buffer in 1x TE als assay buffer voor het verdunnen van het reagens en DNA-monsters. Neem 5 pl DNA geïsoleerd en vul het in 50 ui in 1x TE. </li><li> Van 2 ug / ml DNA stockoplossing maken DNA standaard bereik van blanco 1, 10, 100, 1000 ug / ml. In een plaat met 96, toewijzen 25 pi van elke standaard, evenals DNA verdunning in tweevoud. (Drievoud voor standaard aanbevolen.) </li><li> Bereid het werken reagens door een 200-voudige verdunning van dsDNA reagens in 1x TE-buffer in plastic buis. Bedek de werkende reagens oplossing met aluminiumfolie om licht te vermijden. Voeg 200 ul werken reagens in elk monster. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Bedek de plaat met aluminiumfolie om licht te vermijden. </li><li> Meet de bloei van de monsters met behulp van een fluorescentie plaatlezer (excitatie bij 480 nm, emissie 520 nm). Genereren DNA standaardcurve van fluorescentie versus DNA- concentratie. Bepaal de concentraties van de op basis van de gegenereerde DNA-standaard curve monsters. </li></ol></li></ol></li><li> Verificatie van ChIP experiment met behulp van qPCR <ol><li> Take 2 pl DNA geïsoleerd en verdund in 20 ui in het water. Stel de qPCR reactie in drievoud door het mengen van 2,5 pl DNA verdunning, 5 pi Green I PCR master mix, 1 ui primer, en 1,5 ul nuclease vrij water. </li><li> Voer het qPCR met Fast Real-Time PCR met behulp van de volgende programma: Stap 1: 95 ° C gedurende 60 sec Stap 2: 95 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 60 seconden Herhaal stap 2 39 keer. </li></ol></li><li> Stuur 10 ng DNA-monster te Biotech centrum voor sequencing. LET OP: De Biotech center bereidt de ChIP DNA in bibliotheken volgens instructie en voert enkel-lezen sequentiebepaling onder toepassing van werkwijzen die eerder 2 beschreven. </li></ol> 3. Metabolomics Assay Monstervoorbereidingstesten <ol><li> Celkweek en behandeling <ol><li> Seed 400.000 MCF7 cellen per 10 cm plaat in groeimedium. Voor elke behandeling bereiden drie monsters. Gebruik twee platen in elk monster voldoende cellen te ontvangen voor de detectie. Op dag 3 Verwijder het medium en voeg 5 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 naar de cellen. Behandel de cellen gedurende 24 uur (37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer). </li></ol></li><li> sample Collection <ol><li> Voeg 5 ml ijskoude 1x PBS op de plaat, zuig het PBS na meerdere malen kort het kantelen van de plaat. Herhaal dit twee keer, en verwijder zoveel PBS mogelijk na de laatste wasbeurt. </li><li> Voeg 750 ul van pre-koude aceton om elke plaat en schraap de cellen. Combineer de cellen in aceton uit twee platen ineen 2 ml buisje op ijs. </li><li> Celgetal voor normalisatie <ol><li> Voor elke behandeling, gebruik maken van twee extra borden voor mobiele kwantificering. Om de-hechten van de cellen van de plaat, voeg 2 ml van HE buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3, en 1 mM EDTA) in elke plaat en incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Verzamelen en meng goed de cellen door pipetteren cellen in de HE buffer. Met in totaal 20 pi celoplossing het aantal cellen met een hemocytometer geteld. </li></ol></li></ol></li><li> Bewaar de monsters bij -80 ° C vóór verzending naar het centrum Metabolomics te identificeren en kwantificeren van de metabolieten met behulp van analyse gaschromatografie massaspectrometrie (GC-MS). </li></ol> 4. Integratieve Analyse <ol><li> RNA-Seq data-analyse: <ol><li> Voer Kwaliteit controle van FASTQ bestanden met behulp van FastQC: Lees QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Selecteer FastQC: Lees in het kader van het instrument van NGS: QC en manipulatie. Upload het ruwe data bestand van de huidige History. LET OP: Het is raadzaam om een ​​titel te geven voor de output file om je te herinneren wat het werk was, omdat er mogelijk meerdere uitgangen. </li></ol></li><li> Uit te voeren en de output bestand zal verschijnen onder de Geschiedenis. Herhaal deze procedure voor elke reeks bestanden. Trim adapters met behulp van Clip onder NGS: FastX Toolkit. </li><li> Align leest hg19 behulp Tophat2 met RefSeq genoom verwijzingsannotatie 12 (standaardwaarden). <ol><li> Selecteer Tophat2 onder instrument van NGS: RNA-analyse. Geef de bibliotheek gepaarde type (single-end versus gepaarde-end). </li><li> Upload de input FASTQ bestand van het huidige geschiedenis. Selecteer de referentie-genoom. Kies standaard instellingen. Of gebruik de volledige lijst met parameters te wijzigen. </li><li> Uit te voeren en het zal twee output-bestanden te produceren: de ene is UCSC BED spoor van knooppunten; een ander is een lijst van gelezen optimalisaties in BAM-formaat. </li></ol></li><li> Upload BAM bestanden naar sequencing data analyse-instrument. Bereken expressie waarden met Quantification Tool. </li><li> Identificeer differentieel up-gereguleerde genen met Expression Analysis Tool met behulp van standaardwaarden en vouw verandering&gt; 2 en p-waarde &lt;0,05. Ook identificeren differentieel down-gereguleerde genen met Expression Analysis Tool met behulp van standaardwaarden en vouw verandering &lt;0,5 en p-waarde &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq data-analyse: <ol><li> Lijn FASTQ leest aan hg19 behulp Bowtie2 13 (Default Values) in de Melkweg. <ol><li> Selecteer Bowtie2 onder het instrument van NSC: Mapping. Controleer of de bibliotheek-mate gepaarde (single-end versus gepaarde-end). Upload het FASTQ bestand van de huidige geschiedenis. </li><li> Selecteer de referentie-genoom. Gebruik de standaard parameterinstellingen. Uit te voeren en het zal output file te produceren met in kaart gebrachte sequentie leest als BAM-bestand. Herhaal de procedure voor elke reeks bestanden. </li></ol></li><li> Identificeer pieken MACS met behulp 14 van een p-waarde cut-off van 6.0e-7 en FDR van 0,01, zoals hierboven beschreven 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomics Data Analyse: <ol><li> Omzetten chemische namen van metabolieten te KEGG_IDs. </li><li> Identificeer differentieel gereguleerde metabolieten door vergelijking niveaus gedetecteerd in Vehicle vs. E2 behandelde monsters (een 2 voudige cut-off werd gebruikt in deze studie). </li></ol></li><li> Integrative Analyse: <ol><li> Identificeer genen die ERa bindende plaatsen met behulp van sequencing data-analyse tool. Vertalen Regio&#39;s om genen functie met behulp van 20 kb als afstand cut-off. </li><li> Identificeer differentieel omhoog en omlaag-gereguleerde genen van RNA-Seq analyse met behulp veelvoudverandering&gt; 2 en fold change &lt;0,5, respectievelijk de p-waarde &lt;0,05 als afgesneden. Te vergelijken met de lijst van ERa bindingsplaats die genen bevatten met behulp van Venn diagram vergelijking. </li><li> Gebruik deze lijst om E2 gemoduleerde metabole routes te identificeren met behulp van Metscape 15 module van Cytoscape. <ol><li> Door het selecteren van Metscape module van apps, kies Build netwerk en vervolgens pathway-based optie. </li><li> Selecteer het organisme (Human). Kies een bestand van E2 ongereguleerde samengestelde lijst (KEGG ID) en E2 up-gereguleerd gen lijst. </li><li> Kies Verbinding -Reaction -Enzyme-gen als het type netwerk. Kies verbinding / genen als de query. </li><li> Build-netwerk. Herhaal met de E2 neerwaarts gereguleerd verbinding en genen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+hormone+physiology%3A+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta%2C+and+their+coregulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676(2013).</li>
<li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+%28ERalpha%29+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001(2014).</li>
<li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436(2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription%2C+actin+reorganization%2C+and+invasiveness+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+PicoGreen+%C2%AE+dsDNA+Reagent+and+Kits%22">Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049">http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049</a> (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+Assays+for+high-throughput+quantitation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+oligos%22">Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf</a> (2006).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+%28GCAT%29+benchmarks%5BTitle%5D)+AND+%22BioData+Min%22%5BJournal%5D)">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metscape%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092(2010).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-regulated+transcriptomes%3A+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li>
</ol>

Universiteit van Illinois kreeg een investigator initiated subsidie ​​van Pfizer Inc. ZME en YCZ ontvangen salaris steun van deze subsidie.

In dit artikel beschrijven we genereren en integratieve analyse van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics gegevens van MCF-7-cellen die zijn behandeld met E2. We ontwikkelden een reeks protocollen strategizing om de meest efficiënte methoden en gebruiksvriendelijke zachte waren die biologisch relevante ontdekking te produceren gebruiken. Voor zover wij weten, onze is de eerste studie om -omics data integreren uit drie verschillende analyses en geïdentificeerd nieuwe metabole routes die ERa direct gereguleerd in borstkankerc...

Oestrogenen zijn belangrijke regulatoren van vele fysiologische processen bij zowel vrouwen als mannen, waaronder reproductieve weefsels, metabole weefsels, de hersenen en bot 1. Naast gunstige effecten in deze weefsels, oestrogenen ook kankers die ontstaan ​​uit borstklier en reproductieve weefsels rijden. Oestrogenen voornamelijk werken via ERS om celtype specifieke effecten veroorzaken. Deep sequencing van transcripten gereguleerd door ERa behulp van RNA-Seq en genoom-brede ERa DNA bindingsplaatsen analyse met behulp van ChIP-Seq bleek nuttig te zijn om te begrijpen hoe ERa werkt in verschillende weefsels en kankers die ontstaan ​​uit hen. Wij en anderen hebben genexpressieprofielen in verband met verschillende receptoren (ERa vs ERP) 2,3, verschillende liganden 3-5 en verschillende Coregulatoren 2,4,6,7 gepubliceerd. RNA-Seq is de belangrijkste methode om de transcriptoom onderzoeken met hogere precisie en efficiëntie ten opzichte van microarray based genexpressie analyse 8. RNA verkregen uit cellijnen 2-4,7, weefsels of tumor monsters worden gesequenced, toegewezen aan beschikbare genomische vergaderingen en differentieel gereguleerde genen geïdentificeerd. Chromatine Immunoprecipitatie (chip) wordt gebruikt om de transcriptiefactor en coregulator chromatine binding aan bekende regelgeving bindingsplaatsen ontleden. ChIP-Seq (chip, gevolgd door high throughput sequencing) biedt detectie van de wereldwijde binding sites. Metabolomics is nog steeds gebruikte systeembiologie aanpak, die kwantitatief maatregelen, dynamische Multiparametrische respons van levende systemen op verschillende stimuli, waaronder chemicaliën en genetische storingen. Door het uitvoeren van globale metabool profilering kan een functionele aflezing worden verkregen uit cellen, weefsels en bloed. Daarnaast hebben informatie van transcriptoom experimenten niet altijd overeen met de werkelijke veranderingen in het niveau van enzymen die bijdragen aan de biochemische pathways. gecombineerdeanalyse van transcriptoom en metaboloom gegevens kunnen wij identificeren en correleren veranderingen in genexpressie met werkelijke veranderingen metaboliet. Benutten van de informatie uit deze grootschalige datasets over een mechanistische informatie om de rol van transcriptiefactoren reguleren van complexe biologische systemen, met name degenen die betrekking hebben op menselijke ontwikkeling en ziekten zoals kanker en diabetes begrijpen. De complexe aard van het zoogdier genoom maakt het een uitdaging om te integreren en volledig de resultaten van het transcriptoom, cistrome en metaboloom experimenten gegevens te interpreteren. Identificatie van functionele bindende gebeurtenissen die zouden leiden tot veranderingen in de expressie van genen doelgroep is belangrijk, want zodra functionele bindingsplaatsen worden geïdentificeerd; daaropvolgende analyse, waaronder transcriptie binding (TF) motief analyse kan worden uitgevoerd met hogere nauwkeurigheid. Dit leidt tot de identificatie van biologisch betekenisvolle TF cascades en mechanismen. Ook directe comparisop RNA-Seq en ChIP-Seq experimenten niet altijd mogelijk omdat de data van elk experiment zijn verschillende schalen en geluiden en soms betekenisvolle signalen worden verhuld door ruis bevolking. We zijn niet bewust van enige studie die informatie uit deze drie onafhankelijke maar verwante benaderingen van het directe metabole regulatie van ERa bij borstkanker begrijpen geïntegreerd. Daarom is onze algemene doelstelling in dit document is te relateren productieve binding evenementen om genexpressie en metaboliet verandert. Om dit doel te bereiken, we geïntegreerd gegevens van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en geïdentificeerd die oestrogeen geïnduceerde ERa bindend gebeurtenissen die zouden leiden tot genexpressie veranderingen in de metabole routes. Voor de eerste keer, bieden we een complete set van protocollen (figuur 1) voor het genereren van ChIP-Seq, RNA-Seq en metabolomics profilering en het uitvoeren van integratieve analyse van de gegevens aan nieuwe gen circuits reguleren van het metabolisme van de borst bloot te leggenkanker cellijnen.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Oplosbare poeder&nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA-isolatie van invoermonster&nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&nbsp;</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; PicoGreen&uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA-zuivering</td></tr><tr><td>DEPC Behandeld Water&nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Vrij</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>Met 1/8 sonde&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>Voor geluidsreductie</td></tr><tr><td>&nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 buizen (2 zakken van 100 st.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1,5% agarosegel&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA-kwantificering (100 analyses)&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Elke tablet is voldoende voor 10 ml lysebuffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Fosfatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Elke tablet is voldoende voor 10 ml lysebuffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>Voor 100 analyses</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor signalering in borstkanker

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Met de komst van de -omics zal ons begrip van de chronische ziekten zoals kanker en metabool syndroom is verbeterd. Echter, effectieve winning van de informatie in de grootschalige datasets die worden verkregen van genexpressie microarrays, deep sequencing experimenten of metabool profiel is van essentieel belang om te ontdekken en vervolgens gerichter de kritische regulatoren van zieke cel fenotypes. Oestrogeen Receptor α (ERa) is een van de master transcriptiefactoren reguleren van het gen programma&#39;s die belangrijk zijn voor oestrogeen reagerende borstkanker zijn. Om te begrijpen om de rol van ERa signalering bij borstkanker metabolisme benut we transcriptomische, cistromic en metabolomic gegevens van MCF-7 cellen behandeld met estradiol. In dit rapport beschreven we generatie van monsters voor RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en de integratieve computationele analyse van de verkregen gegevens. Deze benadering is nuttig bij het afbakenen nieuwe molname op mechanismen en genregulerend circuits die worden geregeld door een bepaalde transcriptiefactor die gevolgen metabolisme van normale of zieke cellen.

transcriptomics Om differentieel tot expressie van genen door E2 behandeling te analyseren, hebben we gekozen om een ​​RNA-Seq experiment uit te voeren. Naast het verschaffen informaties mRNA-niveaus kunnen RNA-Seq gegevens ook worden gebruikt om mutaties in niet-coderende RNA (lange niet-coderende RNA&#39;s microRNA) en alternatieve splicing gebeurtenissen bewaken. We hebben geen informatie over de analyse van niet-coderende RNA&#39;s of als alternatief getranscribeerd genen, aan...

Integratie van gegevens uit genoom-breed sequentie-experimenten en metabolomics-experimenten is een uitdaging. In dit artikel rapporteren we, voor het eerst, generatie, analyse en integratie van transcriptoom-, cistrome- en metaboloomgegevens van borstkankercellen behandeld met estradiol.

Systems Biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor Signalering in Borstkanker

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Het algemene doel van dit experiment is om de directe metabole regulatie van ER Alpha bij borstkanker te begrijpen, gebruikmakend van genoombrede transcriptoom-, systroom- en metaboloomgegevens. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van nucleoreceptoren en kankerbiologie, zoals de rol van bepaalde transcriptiefactoren bij het reguleren van het metabolisme om bij te dragen aan de agressiviteit van cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een globaal beeld geeft van de nuances in genregulatie en de resulterende metabole regulatie.De procedure zal worden gedemonstreerd door Yiru Chen, een postdoctoral fellow uit mijn laboratorium. Nadat de MCF7-cellen volgens het tekstprotocol zijn gekweekt, worden de cellen geoogst door één milliliter RNA-isolatiereagens aan elke put toe te voegen en vijf minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Gebruik een pipet om het celluysaat op te vangen en over te brengen naar 1,5 milliliter buisjes.Om het RNA te isoleren, voegt u 200 µL chloroform toe aan één milliliter cellysaat en vortexet u dit gedurende 10 seconden. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten worden de monsters gecen

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video beschrijft een techniek om borstkankercelmonsters voor te bereiden op metabolietprofilering. Borstkankercellen worden behandeld met estradiol, dat zich bindt aan de oestrogeenreceptor alfa en verandering veroorzaakt in de samenstelling van de metaboliet.

Monstervoorbereiding voor metabolomics: een methode om celmonsters voor te bereiden op metabolietprofilering

This video describes a cell-based reporter assay to determine the estrogenic activity of plant-derived compounds. A compound with estrogen-like activity mimics its binding to estrogen receptors and drives downstream reporter enzyme gene transcription. The reporter enzyme generates bioluminescence in a reaction, indicating the estrogenic activity of the compound.

Estrogen Receptor-Reporter Activity Assay to Screen Phytoestrogen Estrogenic Activity

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

Klinisch, oestrogeen deficiëntie bij menopauzale vrouwen kunnen verergeren de incidentie van lipide verstoring en atherosclerose. We vestigden een in vivo oestrogeen deficiëntie model door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen. Het muismodel is van toepassing voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze.

Een in vivo oestrogeen deficiëntie muis model voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze

We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Het huidige protocol beschrijft een alomvattende strategie voor het evalueren van de farmacologische werking en het mechanisme van salidroside bij het remmen van de proliferatie en migratie van MCF-7-cellen.

Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie

In de pathogenese van bot metastase, angiogenese is een cruciaal proces en vormt derhalve een doel voor beeldvorming en therapie. Hier presenteren we een rat model van site-specifieke borstkanker botmetastase en beschrijven strategieën om niet-invasieve beeld...

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Verken de metabole regulatie van ER Alpha in borstkanker door transcriptoom-, cistroom- en metaboloomdata te integreren. Deze methode biedt inzicht in transcriptiefactoren en metabole mechanismen.

Systems Biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor Signalering in Borstkanker

Meer video's verkennen