Name: Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer de isolatie en canulatie van cerebrale parenchymale arteriolen uit muizen voor vaatbiologisch onderzoek met drukmyografie. Deze reproduceerbare methode maakt gedetailleerde studies van vaatfunctie en -structuur mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door NHLBI R01HL091905 (SE), de United Leukodystrophy Foundation CADASIL onderzoekssubsidie (FD) en AHA 15POST247200 (PWP). De auteurs willen Samantha P. Ahchay bedanken voor het verstrekken van de afbeelding op Figuur 1, en Dr. Gerry Herrera, Ph.D., voor het verstrekken van kritische opmerkingen over het manuscript.

1. canule en de Kamer Voorbereiding <ol><li> Plaats schoon borosilicaatglas capillairen (buitendiameter: 1,2 mm, binnendiameter: 0,69 mm, 10 mm lang) in de groeven van een pipet trekker met een platina draad (diameter: 100 pm). </li><li> Met behulp van de juiste instellingen, trek de capillaire om een canule met een lange en dunne tip (figuur 2) met behulp van een micropipet trekker te genereren. De gebruikte instellingen zijn: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10. </li><li> Steek canule in de houder van de druk myograaf kamer. Lijn de canules gepast. </li><li> breken voorzichtig de uiteinden van de canules door een tang onder de dissectiemicroscoop om de gewenste diameter. Hier laten we een canule met een 10 urn tip (figuur 2). </li><li> Vul beide canules met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met 1,8 mM Ca2 +; Vul de kamer met Ca 2 + -vrij aCSF aangevuld met 1% bovine serumalbumine (BSA) + 10 uM Diltiazem (alle oplossingen moet vers worden bereid voor het begin van het experiment). Afhankelijk van de grootte van de kamer, varieert het volume van aCSF 5 tot 20 ml. Bewaar de kamer bij 4 ᵒ C tot klaar om te beginnen met infusen. LET OP: Diltiazem is een reversibele L-type voltage-gated calcium remmer die verwijding van de kleine slagaders zal veroorzaken, die infusen vergemakkelijkt </li></ol> 2. Isolatie van Parenchymale Arteriolen <ol><li> Euthanaseren het dier onmiddellijk voorafgaand aan dissectie met behulp van standaard protocollen in het laboratorium dat door het dier zorg commissie van de instelling worden goedgekeurd. Het gebruik van barbituraten of kooldioxide de voorkeur, aangezien andere veelgebruikte anesthetica vaatverwijdende effecten in de cerebrale circulatie 15 kan hebben. Alle dierlijke procedures hier getoonde zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Nevada School of Medicine, en zijn in agreement met de National Institutes of Health &#39;Guiding Principles in de zorg en het gebruik van dieren &quot;. </li><li> Euthanaseren het dier met behulp van kooldioxide. Voordat onthoofding, ervoor te zorgen dat het dier de ademhaling is gestopt en reageert niet wanneer knijpen zijn poten. </li><li> Onthoofden het dier met behulp van een scherpe schaar (muis) of guillotine (rat). Verwijder het vel van hoofd van het dier en snijd over de middellijn craniale hechtdraad met een fijne tip schaar. Met behulp van een stompe pincet (muis) of een bot tang verwijder voorzichtig de schedelbeenderen en bloot de hersenen. Verwijder de hersenen langzaam en voorzichtig over het oppervlak pial bloedvaten beschadigen. Plaats de hersenen in een container gevuld met 20 ml Ca2 + -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA op ijs. </li><li> Vul een dissectie schotel met een pad met ijskoude Ca2 + -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA en breng de hersenen met de ventrale zijde naar boven op deze schaal (figuur 2A). Plaats de schotel onder een dissecting microscoop (Figuur 3A). Speld de hersenen om de pad met behulp van 27-gauge naalden. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het plaatsen van pinnen in de buurt van de middelste cerebrale slagader (MCA). </li><li> Lokaliseren van de cirkel van Willis en de MCA vertakking van. Met behulp van scherpe en uitgelijnd Vannas lente schaar, knipte een kleine rechthoek rond het MCA. Controleer of rechthoek dicht bij 5 mm over de hele lengte van het MCA. Het bovenste deel van de rechthoek moet voorbij het ​​vertakkingspunt van de cirkel van Willis (proximaal van de Cirkel van Willis, Figuur 2B, pijl). </li><li> Met de Vannas veer schaar Voer een ondersneden in de diepte van het weefsel ongeveer 2-3 mm. NB: Dit deel is van cruciaal belang voor een goede isolatie van parenchymale arteriolen, en het kan een paar proeven te nemen om het goed te krijgen. Als de cut is briefje diep genoeg is, zal het geïsoleerde parenchymale arteriolen kort zijn; Als de cut te diep is, zal de arteriolen breken op hun aftakpunt wanneer de ontleedweefsel verwijderd. </li><li> Vastpinnen het meest distale einde van de hersenen slice in het ontleden schotel met de MCA naar boven (distale van de Cirkel van Willis) met behulp van insect pinnen. Maak een ondiepe incisie aan de pia snijden in de buurt van de pin, en let niet te diep in de onderliggende cerebrale cortex (anders de pennen zal niet vasthouden) te snijden. </li><li> pak zorgvuldig elke zijde van de pia met kleine pincet en beginnen afpellen van de pia cortex. Indien nodig, vast te houden aan de MCA, ervoor te zorgen dat de omringende pial membraan niet wordt beschadigd. </li><li> Blijf pellen tot de pia met de MCA vrij is van de cortex. Merk op dat het verzet tegen peeling dicht bij de Circle de Willis zal toenemen. Wees extra voorzichtig op dit punt, omdat de langere parenchymale arteriolen zal in deze regio. </li><li> Zodra de pia vrij, plaats deze voorzichtig op het pad op de ontleden schaal met de oppervlak tegenover arteriolen naar beneden (figuur 2B) parenchymale. </li> &lt;li&gt; Het gebruik van Vannas voorjaar een schaar, knip de ontleed arteriolen vrij van de MCA, zorg ervoor dat de uiteinden van het schip worden botweg gesneden. </li><li> Verzameld arteriolen kan voor druk myography, moleculaire analyse of isolering van natief gladde spiercellen of endotheelcellen. </li></ol> 3. Druk myography <ol><li> Bereid de hechting van tevoren. Snijd de donkergroene nylon draad in 5 mm stukken en leg op de kleverige kant van een dubbelzijdige tape op een petrischaal. Onder de dissectiemicroscoop scheiden elk stuk in de filamenten met behulp van fijne pincet en losjes bereiden een eenvoudige halve hitch knoop door het passeren van een uiteinde van het filament in de andere. </li><li> Met behulp van een tang, kies een knoop van de dubbelzijdige tape, zorg ervoor dat niet om het te grijpen met te veel druk. Trek de hechtdraad in bad oplossing, glijbaan knoop op canule en draai hem op een afstand vanaf de punt van de canule. Herhaal dit proces tot 2 hechtingen voor elke canule hebben. </li><li> Coat een glasmicropipet met een 10% BSA-oplossing en spoel het overtollige met Ca 2 + -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA. </li><li> Trek 50 pi van de oplossing in het glas micropipet, trek een parenchymale arteriole en over te dragen aan de druk myography kamer. Duw de zuiger in één vloeiende beweging aan de parenchymale arteriole afzien in de kamer om te voorkomen dat het vasthouden aan de inwendige kamer van het glas micropipet. </li><li> Met behulp van twee super fijne tang, opent het lumen van de PA, voorzichtig om alleen het einde van het schip te raken. </li><li> Met de tang om de randen van de parenchymale arteriole houden, trek het vaartuig op de canule. Trek ver genoeg op de canule, zodat het schip niet aan het tapse uiteinde van de canule (figuur 3A). </li><li> Draai de 2 hechtingen op de canule en draai ze op het vat (Figuur 3B). Space de hechtingen uit elkaar een beetje aan het schip, en trek in de richting van de bestuurder, terwijl tightien is. Zorg ervoor dat alle takken worden afgebonden voor het sluiten van de andere kant van de parenchymale arteriole. </li><li> Draai kamer rond en sluit het andere uiteinde van de parenchymale arteriole als blinde weg. Om dat te bereiken, opent u de banden aan de andere canule en doorgeven naar de arteriole. Sluit langzaam de knoop zodanig dat de parenchymale arteriole worden gekoppeld aan de zijde van de canule. Vermijd longitudinale stuk van de arteriole. (Figuur 3C). Opmerking: Als het doel van de studie is om drugs perfuseren door het lumen canule het andere uiteinde in plaats van binden van de parenchymale arteriole aan de zijde van de canule. Zorg ervoor dat de canule geen zoutkristallen of interne build-ups die intraluminale stroom te blokkeren. Regulering van de stroomsnelheid op de juiste wijze om shear stress binnen fysiologische peil te houden. Een studie van Shih et al. Toont debieten binnen indringende arteriolen bij ratten 8, en kan als een eerste gids voor pi dienenveel studies. </li><li> Breng voorzichtig de kamer naar het stadium van de microscoop worden gehanteerd om vaatdiameter. Bevestig de kamer op de microscoop podium, het aansluiten van temperatuursensor en de inlaat en de afzetmogelijkheden voor perfusie naar de juiste buizen. Breng het arteriole tot 40 mmHg intraluminale druk muis parenchymale arteriolen of 50 mmHg rat arteriolen, met behulp van een druksysteem in het laboratorium (waterkolom, peristaltische pomp gekoppeld aan een drukomzetter, enz.). Figuur 4D toont een voorbeeld van een peristaltische pomp gekoppeld aan een drukomzetter de canule arteriole druk. </li><li> Schakel de gebruikt om wijzigingen in diameter (figuur 3E) detecteren systeem. Instellingen op de microscoop, zoals de verlichting en contrast, teneinde de best mogelijke detectie te verkrijgen. Idealiter de wanden van de arteriole dient donker en het lumen doorschijnend. Zodra de detectie geschikt is, beginnen met het opnemen thij te experimenteren. </li><li> Start het superfusie systeem. Was de canule, stromend parenchymale arteriole met warm (37 ᵒ C) aCSF met 1,8 mM Ca2 + gedurende 15 tot 20 minuten bij een debiet tussen 3-5 ml / min. Dit aCSF dient Diltiazem of BSA bevatten. </li><li> Vervang regelmatig aCSF met 60 mM KCl aCSF de levensvatbaarheid van het preparaat te evalueren. 20% vernauwing tot 60 mM KCl - Op dit moment moet PA 10 vertonen. Als de arteriole niet vernauwen in die mate, te verwijderen en canule andere arteriole. </li><li> Spoel de 60 mM KCl met regelmatig aCSF. Wacht tot de generatie van de spontane myogene toon, die kan duren tot een uur. Als arteriole myogene toon niet over die tijd, vervangen door een ander arteriole. OPMERKING: Myogene toon wordt waargenomen als een geleidelijk en soms traag, vermindering van het lumen diameter van het vat zonder stimulering door contractiele agonisten of hoge KCl oplossing. Myogene toon wordt berekend met de volgende formula: (1 - (actief lumen diameter / passief lumen diameter)) x 100 5 Een geschikte hoeveelheid myogene tonus kan variëren afhankelijk behandelingen, stammen, species, transgenics, enz.. In het algemeen fysiologische myogene toonbereiken 15-30% 5. </li></ol> 4. Voorbeeld Pressure myography Experimenten: Agonist-geïnduceerde Vernauwing en Myogene reactiviteit <ol><li> Bereid een reeks verdunningen van een agonist van keuze in aCSF middels geschikte concentraties. Voor het onderhavige voorbeeld werd de tromboxaan A2-receptor agonist U46619 gebruikt. Een voorraadoplossing van 1 ml U46619 bij een concentratie van 1 mM werd bereid. Breng 100 pi van 1 mM oplossing naar een nieuwe buis met 900 ui van aCSF een 10-voudige verdunning van het geneesmiddel, wat resulteert in een oplossing die 100 pM U46619. Herhaal deze procedure voor 6 verdunningen variërend van 1 mM tot 100 nM tot een concentratie-respons curve constrictor bereiden. </li><li> Voeg detotale volume van de oplossing die de agonist (1 ml voor de eerste dosis, gevolgd door 900 pl alle volgende doses) om 100 ml superfusing aCSF. Dit leidt tot een extra 100-voudige verdunning van de agonist. Het uiteindelijke concentraties van agonist in het bad traject van 10 pM tot 10 pM. Sta arteriolen incuberen ~ 10 min in elke concentratie tot luminale diameter van een steady-state bereikt. </li><li> Spoel de agonist door superfusing PA&#39;s met aCSF zonder drugs totdat de PA diameter is terug naar de oorspronkelijke waarde. Incubeer de parenchymale arteriole Ca 2 + -vrij aCSF (zonder BSA), aangevuld met 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA maximale verwijding induceren en opnemen passieve diameter van de arteriole. </li><li> Verwijder de parenchymale arteriole van de canule door het voorzichtig naar buiten te trekken terwijl u in het uiteinde van de banden. Was het schip kamer met dubbele gedemineraliseerd water om vuil en overmaat van agonist te verwijderen. Vul de kamer met Ca2 + -vrij aCSF + BSA en canule andere arteriole. Het is niet aan te raden om meer dan één experiment per arteriole voeren. </li><li> Een myogene reactiviteit experiment uitgevoerd, zodat de parenchymale arteriole equilibreren bij 40 mmHg intraluminale druk tot spontane myogene toon gegenereerd (hierboven beschreven). Verlaag de intraluminale druk tot 5 mmHg PA en laat equilibreren ~ 5-10 min, totdat luminale diameter stationaire toestand bereikt. Verhoog de intraluminale druk stapsgewijze via het interval van keuze (bijvoorbeeld 5-140 mmHg in stappen 20 mmHg). </li><li> Mis arteriole intraluminale druk van minder dan 5 mmHg niet bloot die kunnen instorten en beschadiging van het endotheel, waardoor de resultaten van het experiment veranderen. </li><li> Aan het einde van de drukcurve, superfuse de parenchymale arteriole met Ca2 + -vrij aCSF (zonder BSA), aangevuld met 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA en herhaal de druktrappen, vanaf de lowest druk. Opmerking:% tone = (1 - (diameter actief / passief diameter)) x 100: Dit zal de passieve diameters van de PA, die noodzakelijk% myogene tonus te berekenen, gedefinieerd door de formule. </li></ol>

<ol><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).</li>
<li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+regulation+in+the+normal+brain+and+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2%2C+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent%2C+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).</li>
<li>Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+myogenic+tone+and+structure+of+parenchymal+arterioles+by+hypertension+and+the+mineralocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).</li>
<li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K%2B+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).</li>
<li>Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+nerves+and+the+regulation+of+cerebrovascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone.</a> Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).</li>
<li>Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+regulate+myogenic+tone+in+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation. 20, 307-316 (2013).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circ Res. 110, 285-294 (2012).</li>
<li>You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+endothelial+P2+purinoceptors+in+the+cerebrovascular+tree+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat.</a> Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).</li>
<li>Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+on+isoflurane-+and+sevoflurane-induced+cerebral+vasodilation+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Anesthesiol%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).</li>
<li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arterial+lesions+underlying+lacunes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).</li>
<li>Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+changes+in+the+white+mater+in+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microvascular changes in the white mater in dementia.</a> J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).</li>
<li>Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+hypertension+on+the+cerebral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of hypertension on the cerebral circulation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).</li>
<li>Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+cortical+astrocytes+and+arterioles+during+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling.</a> Circ Res. 95, e73-e81 (2004).</li>
<li>Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+rat+intracerebral+arterioles%3A+methods%2C+morphology%2C+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity.</a> Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).</li>
<li>Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+characterization+of+intracerebral+arterioles+in+the+C57%2FBL6+wild-type+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse.</a> J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+myogenic+tone%2C+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles%3A+effect+of+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40, 1451-1457 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cerebral parenchymale arteriolen zijn hoge weerstand arteriolen met weinig anastomoses en takken die verschillende neuronale populaties perfuseren. Deze gespecialiseerde bloedvaten centrale spelers in cerebrovasculaire autoregulatie en neurovasculaire koppeling through-astrocyten gemedieerde vaatverwijding 1. Het belang van deze gespecialiseerde bloedvaten in cerebrale vasculaire ziekte is gekend voor ongeveer 50 jaar, toen het pionierswerk van Dr. Miller Fisher beschreven structurele veranderingen in parench...

De cerebrale circulatie is uniek georganiseerd om de metabolische behoeften van centrale neuronen, cellen die energieopslag beperkte en daardoor zeer gevoelig voor veranderingen in de zuurstofspanning en aanvoer van noodzakelijke voedingsstoffen ondersteunen. De bijzondere neuronale subpopulaties actief wordt wanneer specifieke taken worden uitgevoerd, het vaatstelsel bevordert een sterk gelokaliseerde toename van perfusie plaatselijke hypoxie en uitputting van voedingsstoffen 1 voorkomen. Dit is een vorm van functionele hyperemie bekend als neurovasculaire koppeling, en is afhankelijk van de goede werking van de neurovasculaire eenheid, bestaande uit actieve neuronen, astrocyten en cerebrale arteriën 2. Intracerebrale parenchymale arteriolen, een groep van bloedvaten omvat parenchymale doordringende en precapillaire arteriolen, zijn centraal belang voor deze reactie en het is dan cruciaal bij de losse bestuderen om neurovasculaire koppeling 3 onderzoeken. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Parenchymale arteriolen zijn klein (20-70 urn inwendige diameter) hoge weerstand bloedvaten die verschillende neuronale populaties in de hersenen perfuseren. Vertakking van pial slagaders op het oppervlak, parenchymale arteriolen doordringen in de hersenen parenchym in een bijna 90 ᵒ hoek met de ondergrond microcirculatie (figuur 1) te voeden. Deze arteriolen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de juiste perfusiedruk zoals ze zijn de meest distale gladde spier opslagvaten de bescherming van de haarvaten. In tegenstelling tot het oppervlak pial circulatie parenchymale arteriolen gebrek zijtakken en anastomosen, en zijn daarom &quot;knelpunten&quot; van de cerebrale circulatie 4. Hierdoor disfunctie van parenchymale arteriolen bijdraagt ​​tot de ontwikkeling van cerebrovasculaire ziekten zoals vasculaire cognitieve stoornissen en kleine ischemische beroerte (ook bekend als stille of lacunaire beroerte). studies indicate dat parenchymale arteriolen disfunctie kan worden geïnduceerd door 5 essentiële hypertensie, chronische stress 6, en is een vroege gebeurtenis in SVD genetisch muismodel 7. Verder experimenteel geïnduceerde occlusie van één penetrerend arteriolen bij ratten voldoende kleine ischemische beroerte die cilindrisch van vorm, vergelijkbaar die waargenomen bij oudere mensen 8 veroorzaken. Naast deze anatomische verschillen, mechanismen reguleren contractiele functie verschillen pial arteriën en arteriolen parenchym. Myogene vasoconstrictie groter in parenchymale arteriolen 9, mogelijk vanwege het gebrek aan extrinsieke innervatie 10, verschillende modi van mechanotransductie 11, en ​​verschillen in intracellulaire Ca2 + signalering 12,13 in vasculaire gladde spiercellen. Er zijn aanwijzingen dat endotheel-afhankelijke vasodilator mechanismen ook verschillen tussen deze VascuLAR segmenten, met parenchymale slagaders vertonen grotere afhankelijkheid van mechanismen die Ca 2+ geactiveerde K + kanalen en elektrotone communicatie binnen de vaatwand in vergelijking met diffundeerbare factoren zoals stikstofoxide en prostacyclinen 14. Daarom verzamelde gegevens in experimenten met pial slagaders kan niet noodzakelijk van toepassing op arteriolen parenchymale, waardoor er een gat in onze kennis van de lokale controle van de hersendoorbloeding. Ondanks het belang ervan, parenchymale arteriolen zijn enorm onder bestudeerde, voornamelijk als gevolg van de technische uitdagingen met isolatie en bevestiging voor ex vivo studie. In dit manuscript beschrijven we een methode voor het isoleren en canule cerebrale parenchym arteriolen, die kan worden gebruikt voor druk- myography of om weefsel te isoleren voor immunokleuring, elektrofysiologie, moleculaire biologie en biochemische analyse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Kunstmatige hersenvocht</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Isolering/Cannuleplaatsing</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en canulatie van cerebral parenchymale arteriolen

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebrale parenchymale arteriolen (PA&#39;s), die parenchymale arteriolen, indringende arteriolen en pre-capillaire arteriolen omvatten, zijn hoge weerstand bloedvaten vertakking van pial slagaders en arteriolen en duiken in de hersenen parenchym. Individuele PA perfuseren een discrete cilindrische grondgebied van het parenchym en de neuronen in ons systeem. Deze arteriolen zijn een centrale speler in de regulatie van de cerebrale doorbloeding zowel wereldwijd (cerebrovasculaire autoregulatie) en lokaal (functionele hyperemie). PA&#39;s maken deel uit van de neurovasculaire eenheid, een structuur die overeenkomt doorbloeding metabole activiteit in de hersenen en ook neuronen, interneuronen en astrocyten. Perfusie met PA is direct gekoppeld aan de activiteit van neuronen in dat gebied en een toename van neuronale metabolisme leiden tot een verhoging in lokale perfusie veroorzaakt door dilatatie van de voeding PA. Regulatie van PA verschilt van die beter gekarakteriseerdepiale slagaders. -Druk-geïnduceerde vaatvernauwing is groter in de Pas en vaatverwijdende mechanismen variëren. Daarnaast hebben PA niet extrinsieke innervatie ontvangen van perivasculaire zenuwen - innervatie is intrinsieke en indirect in de natuur door contact met astrocytische uiteinde. Dus, gegevens met betrekking tot contractiele regulering opgebouwd door studies met pial slagaders niet direct te vertalen naar het begrijpen van PA-functie. Verder blijft onbepaald hoe pathologische toestanden, zoals hypertensie en diabetes, beïnvloeden PA structuur en reactiviteit. Deze leemte is deels het gevolg van de technische problemen in verband met PA isolatie en canule. In dit manuscript presenteren we een protocol voor isolatie en infusen van knaagdieren PA&#39;s. Verder tonen we voorbeelden van experimenten die zijn uitgevoerd met deze arteriolen, waaronder agonist veroorzaakte vernauwing en myogene reactiviteit. Hoewel de focus van dit manuscript is op de PA infusen en de druk myography, geïsoleerde PAB kan ook worden gebruikt voor biochemische, biofysische, moleculaire en beeldvormende studies.

Figuur 5A toont een representatief vernauwing van muis PA 60 mM KCl aCSF om de integriteit van het preparaat te evalueren. PA moet vernauwen tussen 15-30% in aanwezigheid van 60 mM KCl. Als de vernauwing is dan 15%, gooi de PA canule en andere, zoals wordt gesuggereerd dat de arteriole werd beschadigd tijdens het isoleren en canule proces. Figuur 5B illustreert PA vernauwing aan toenemende con...

Dit manuscript beschrijft een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van intracerebrale arteriolen (een groep bloedvaten die omvat parenchymale arteriolen, penetrerende arteriolen en precapillaire arteriolen) van muizen, te gebruiken in drukmyografafie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en monteren van cerebrale arteriolen voor studies naar vasculaire functie en structuur met behulp van drukmyografie. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen binnen het cerebrovasculaire vakgebied te beantwoorden, zoals de wijze waarop de cerebrale microvasculatuur zich snel aanpast aan veranderingen in de intraluminale druk of de behoefte aan voedingsstoffen, of tijdens pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het drukzetting van de arteriole mogelijk maakt in aanvulling op de intraluminale druk, welke belangrijke fysiologische determinanten zijn van de vasculaire functie.Begin met het trekken van capillairen om canules te genereren met een micropipet-trekker met de juiste instellingen, zoals hier vermeld. Nadat een canule in de houder van een myografiekamer is geplaatst en onder een dissectiemicroscoop is uitgelijnd, wordt de tip met een pincet voorzichtig afgebroken tot de gewenste diameter, zoals 10 micrometers zoals hier getoond. Vul beide canules met cerebrospinale vloeistof of aCSF met 1,8 millimolar calcium, en gebruik vijf tot 20 milliliters calciumvrije aCSF aangevuld met 1

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Rennert, R. C., et al. Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the open surgical resection of a cerebral arteriovenous malformation (AVM) in a human brain. The procedure involves creating a bone flap, accessing the subarachnoid space, identifying and occluding feeding arteries and draining veins, and carefully removing the AVM. Intraoperative angiography confirms complete resection,...

Open Surgical Resection of Cerebral Arteriovenous Malformations

This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Larpthaveesarp, A., et. al. Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the establishment of the Middle Cerebral Artery Occlusion model in a rat pup. The internal carotid artery (ICA) is exposed, and a ligature is secured to restrict blood flood. An occlude is inserted through the ICA to reach the Middle Cerebral Artery. The pup is then allowed to recover before further analysis.

Generating a Middle Cerebral Artery Occlusion in a Rat Pup to Induce Local Brain Ischemia

We beschrijven een zeer reproduceerbare werkwijze voor de permanente occlusie van een knaagdier grote cerebrale bloedvat. Deze techniek kan worden bereikt met zeer weinig perifere schade minimaal bloedverlies, een hoog percentage overleving op lange termijn en consistente infarct volume evenredig met de klinische populatie.

Permanente Cerebrale vatocclusie<em&gt; Via</em&gt; Dubbele Ligatuur en doorsnijding

Chirurgie is de gouden standaard voor toegankelijk arteriovenious misvormingen (AVMs) en embolisatie pre-operatieve kan leiden deze procedure kan vereenvoudigen. Wij beschrijven onze aanpak voor gefaseerde endovasculair embolisatie kan leiden en open resectie van mediadiensten, en bieden een representatief klinische voorbeeld benadrukken van de voordelen van een volledig opgeleide neurovasculaire chirurg leidt een multidisciplinaire klinische team .

Uitgebreide endovasculair en Open chirurgische beheer van cerebrale Arterioveneuze misvorming

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Dit protocol presenteert een stapsgewijze handleiding voor onderzoekers om de occlusieprocedure van de middelste hersenslagader bij muizen uit te voeren met behulp van de gemodificeerde Longa externe halsslagadermethode. Wijzigingen die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn bedoeld om de nauwkeurigheid van de occlusie van de middelste hersenslagader te vergroten en volledige reperfusie te garanderen.

Optimalisatie van de Longa occlusiemethode van de middelste cerebrale slagader voor volledige reperfusie

Leer de isolatie en canulatie van cerebrale parenchymale arteriolen uit muizen voor vaatbiologisch onderzoek met drukmyografie. Deze reproduceerbare methode maakt gedetailleerde studies van vaatfunctie en -structuur mogelijk.

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Meer video's verkennen