Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten
April 11th, 2016
Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.
Het algemene doel van deze procedure is om een uitgebreid systeem te beschrijven voor het sequencen van uitdagende kankerspecimens dat wet lab reagentia, gestandaardiseerde controles en een stand-alone bio-informatica suite combineert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het kankerveld, zoals hoe je laagwaardige en lage kwaliteit tumorbiopsieën kunt sequencen om nauwkeurige DNA variantanalyses en interpretaties te bereiken. Het grote voordeel van deze methode is dat monsters die moeilijk te sequencen zijn, namelijk die waar simpelweg beperkte DNA hoeveelheden beschikbaar zijn, snel en betrouwbaar kunnen worden geanalyseerd met behulp van reagentia en controles uit één bron en volledig geïntegreerde bio-informatica software.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de complexiteit van gerichte NGS, die deze methode vereenvoudigt. Echter, de procedures voor bibliotheek kwantificering en monster pooling vereisen speciale aandacht om uniforme dekking over alle monsterbibliotheken te bereiken. Dit protocol integreert natte en droge bankprocessen voor het sequencen van uitdagende kankerspecimens.
De eerste stap is kwantificering en kwalificatie van DNA om het aantal DNA sjabloon kopieën te bepalen dat kan worden versterkt door real time PCR. Begin de procedure voor monsterkwantificering en kwaliteitscontrole door een voldoende hoeveelheid van een master mix voor te bereiden in een microcentrifuge buisje. Gebruik de volgende volumes per monster, 5 microliter van 2x master mix, 0,5 microliter van primer sonde mix, 0,5 microliter van inhibitie primer sonde mix, 0,05 microliter van ROX en 2,95 microliter van verdunningsvloeistof.
Voeg negen microliter van de master mix toe aan elke put van een 96-putjes plaat. Voeg een microliter van de DNA standaarden in duplicaat toe en meng door vijf keer op en neer te pipetten. Nadat is vastgesteld dat het nucleïnezuurmonster goed gemengd is, voeg je een microliter van het monster toe aan de master mix en meng door vijf keer op en neer te pipetten.
Plaats de afgesloten plaat in het PCR systeem. Voer PCR cycli uit van 10 minuten bij 95 graden Celsius gevolgd door 40 cycli van 15 seconden bij 95 graden Celsius en een minuut bij 60 graden Celsius. Analyseer de qPCR gegevens door een lineaire regressieplot te genereren voor elk van de dubbele DNA standaarden.
De concentratie van het onbekende DNA in functioneel of versterkbaar aantal kopieën per microliter wordt vervolgens berekend zoals beschreven in de protocoltekst. De volgende stap na monsterkwantificering en kwaliteitscontrole is de verrijking van kanker hotspotsequenties door single tube multiplex PCR. Gen specifiek of gsPCR zal worden uitgevoerd om 46 loci in 21 kankergenen te verrijken.
Bereid een voldoende hoeveelheid gsPCR master mix voor in een microcentrifuge buisje door de volgende volumes per monster te gebruiken, vijf microliter van 2x amplificatie master mix en één microliter van pan-kanker primerpaneel. Pipet zes microliter van de gsPCR master mix in elke put van een 96-putjes plaat. Voeg vier microliter van elk nucleïnezuur monster toe aan individuele putjes.
Meng door vijf keer op en neer te pipetten. Voeg de geschikte controles toe. Plaats de afgesloten plaat in de thermocycler voor de volgende PCR cycli.
Vijf minuten bij 95 graden Celsius. 15 seconden bij 95 graden Celsius gevolgd door vier minuten bij 60 graden Celsius voor twee cycli. 15 seconden bij 95 graden Celsius gevolgd door vier minuten bij 72 graden Celsius voor 23 cycli.
Een laatste extensie van 10 minuten bij 72 graden Celsius, en gevolgd door vasthouden bij vier graden Celsius. Na gen specifiek PCR, voer 10 cycli van tag-PCR uit om platform specifieke adapters te incorporeren voor compatibiliteit met next generation sequencing. Voeg 7,5 microliter van de 2x index master mix en 5,5 microliter van een indexcode toe aan een gespecificeerde put van een 96-putjes plaat en meng door vijf keer op en neer te pipetten.
Open voorzichtig de gsPCR plaat en voeg twee microliter van gsPCR product toe aan de nieuwe plaat met de master mix. Plaats de afgesloten plaat in de thermocycler voor de volgende PCR cycli, vijf minuten bij 95 graden Celsius, 30 seconden bij 95 graden Celsius, 30 seconden bij 55 graden Celsius en één minuut bij 72 graden Celsius gedurende 10 cycli, en een laatste extensie van 10 minuten bij 72 graden Celsius. Gevolgd door vasthouden bij vier graden Celsius.
Na tag-PCR wordt bibliotheekzuivering en grootte selectie uitgevoerd met behulp van magnetische parelkemie. Begin deze procedure door 11 microliter van bibliotheek zuivere prep magnetische kralen toe te voegen aan aparte putjes van een 96-putjes plaat. Open de tag-PCR plaat en voeg 10 microliter van tag-PCR product toe aan de kralen en meng door vijf keer op en neer te pipetten.
Incubeer het mengsel gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Plaats de 96-putjes plaat op een magnetisch statief gedurende vier minuten. Met de 96-putjes plaat nog steeds op het statief, verwijder en gooi het supernatant weg met een pipet.
Na het wassen van de kralen twee keer met ethanol bevattende was buffer zoals beschreven in de protocoltekst, droog de kralen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de plaat van het statief. Resuspendeer de kralen door 20 microliter van elutie buffer toe te voegen aan elk putje en vijf keer op en neer te pipetten. Incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.
Plaats de 96-putjes plaat terug op het magnetisch statief gedurende vier minuten en verwijder en draag voorzichtig 18 microliter van het heldere supernatant over naar een putje in een nieuwe 96-putjes plaat. De volgende stap in dit protocol is de kwantificering van elke gezuiverde monsterbibliotheek door relatieve competitieve real time PCR. Om deze procedure te starten, bereid een voldoende hoeveelheid van de LQ master mix voor in een microcentrifuge buisje door de volgende volumes per monster te gebruiken, vijf microliter van 2x LQ master mix, twee microliter van LQ primer sonde mix, 0,5 microliter van LQ standaard en 0,5 microliter van LQ ROX.
Voeg 8 microliter van de LQ master mix
Overzicht
Dit artikel presenteert een uitgebreid systeem voor gerichte next-generation sequencing (NGS) van uitdagende oncologische specimens, met name tumorbiopsies van lage kwaliteit en in kleine hoeveelheden. De geïntegreerde aanpak combineert wet lab reagentia, gestandaardiseerde controles en een speciale bioinformatica suite om nauwkeurige DNA variant analyses mogelijk te maken.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Genomiek
- Bioinformatica
Achtergrond
- Het sequencen van tumorbiopsies van lage kwaliteit is een belangrijke uitdaging in het kankeronderzoek.
- Traditionele methoden falen vaak vanwege onvoldoende DNA hoeveelheden.
- Deze studie richt zich op de behoefte aan betrouwbare sequencing methoden voor moeilijke monsters.
- De integratie van wet en dry lab processen verbetert de algehele efficiëntie van de sequencing workflow.
Doel van Studie
- Om een systeem te ontwikkelen dat gerichte NGS voor kanker specimens van lage kwaliteit vereenvoudigt.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor nauwkeurige DNA variant analyse.
- Om bioinformatica tools te integreren voor verbeterde data interpretatie.
Gebruikte Methoden
- Sample kwantificering en kwaliteitscontrole met behulp van real-time PCR.
- Gen-specifiek PCR om kanker hotspot sequenties te verrijken.
- Tag-PCR voor het incorporeren van platform-specifieke adapters.
- Bibliotheek zuivering en maat selectie met behulp van magnetische kraalchemie.
Belangrijkste Resultaten
- De methode analyseerde met succes tumorbiopsies in kleine hoeveelheden.
- Accurate DNA variant analyses werden bereikt met het geïntegreerde systeem.
- Gestandaardiseerde controles verbeterden de betrouwbaarheid van de resultaten.
- De bioinformatica suite faciliteerde effectieve data interpretatie.
Conclusies
- Dit geïntegreerde systeem vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in het sequencen van uitdagende kanker specimens.
- Het vereenvoudigt de workflow voor onderzoekers die nieuw zijn in gerichte NGS.
- De aanpak verbetert het potentieel voor nauwkeurige genomische inzichten in de oncologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This integrated NGS system addresses a critical bottleneck in oncology drug development: the reliable sequencing of low-quality, low-quantity tumor biopsies that are common in clinical and preclinical samples. By linking wet bench sample qualification with dry bench variant calling, the method improves predictive confidence in target validation and reduces false-negative calls in heterogeneous cancer specimens. This enables more accurate molecular profiling for target identification and biomarker-driven trial design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional DNA quantification to determine amplifiable copy number, supporting hypothesis testing in low-input tumor models.
- Operational Value: Uses single-source reagents and analytically-defined controls to reduce variability in early-stage target de-risking.
- Predictive Value: Links pre-analytical QC data to variant calling algorithms, improving accuracy in distinguishing true mutations from artifacts in heterogeneous samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative library normalization and pooling based on measured concentration, enabling uniform coverage across multiplexed amplicons.
- Operational Value: Streamlines workflow to produce 24 sequence-ready libraries in a single day, increasing throughput for assay validation campaigns.
- Platform Compatibility: Uses tag-PCR to embed platform-specific adaptors, ensuring compatibility with common benchtop NGS instruments for scalable screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports sequencing of FFPE and FNA tumor biopsies, which are clinically relevant models for preclinical-to-clinical translation.
- Biomarker Alignment: Enables sensitive detection of variants at low allele frequency (e.g., 5% BRAF V600E) using as few as 400 amplifiable DNA copies.
- Risk-Adjusted Advancement: Two-tiered control system (positive and inhibition controls) safeguards call accuracy, reducing false negatives in low-quality samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where accurate genotyping of preclinical models informs compound selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Quantifies functional DNA and enriches cancer hotspot sequences, enabling reliable genotyping of genetically complex tumor models.
- Screening: Delivers normalized, pooled libraries with uniform coverage, supporting reliable compound sensitivity and resistance profiling.
- Analytics: Integrates pre-analytical QC metrics into bioinformatics variant calling, improving measurement accuracy and reproducibility.
- Translational Research: Uses clinically relevant sample types (FFPE, FNA) to bridge discovery and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Modular design allows incorporation of new gene content, supporting long-term reuse across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves variant call accuracy in low-quality samples by linking wet bench QC to dry bench analysis.
- Operational Value: Reduces hands-on time to ~3.5 hours per 24-sample batch through streamlined, integrated workflow.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on reliable molecular data from challenging specimens, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by increasing confidence in preclinical genotype-phenotype correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR-based DNA quantification and qualification for accurate input normalization.
- Needs access to thermocycler, magnetic bead purification system, and benchtop NGS instrument with compatible optics.
- Demands standardization of library quantification and pooling procedures across users to maintain coverage uniformity.
- Must adapt input volume and cycling conditions based on sample quality, as indicated by pre-analytical QC flags (e.g., PCR inhibition).
- Dependent on consistent use of analytically-verified controls to distinguish true variants from false positives or negatives.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
DNA Functional Quantification and Quality Control
2:55
Library Preparation
5:22
Library Purification and Size Selection
6:50
Library Quantification
8:21
Library Normalization and Sample Pooling
9:23
Sequencing
11:09
Results: High-depth, Multiplexed Sequencing and Sensitive Analysis of Challenging Cancer Specimens by Targeted NGS
13:01
Conclusion
