Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Het algemene doel van deze methode is om eiwitexpressie en co-lokalisatie objectief te kwantificeren met behulp van multispectrale beeldvorming. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van basisonderzoek en diagnostische pathologie, zoals de wijze waarop eiwitten van expressie en lokalisatie veranderen na een behandeling of tijdens de progressie van een ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de subjectiviteit van de operator, die inherent is aan traditionele kwantificeringsmethoden, wordt geëlimineerd.

Om het kwantificatieproces te starten, opent u de software voor multispectrale beeldvorming om een spectrale bibliotheek op te bouwen aan de hand van eerder geprepareerde controlesdia's die zijn gekleurd met individuele chromogenen en de met hematoxyline gekleurde dia. Open vervolgens een beeldkubus die is verkregen van een controlesdia en selecteer vier tot vijf positief gekleurde gebieden om het chromogeen optisch te definiëren. Herhaal deze stappen met beeldkubussen van andere controlesdia's totdat er een volledige spectrale bibliotheek is gecreëerd die alle chromogenen vertegenwoordigt, en sla de spectrale bibliotheek vervolgens op.

Start een nieuw project in de multispectrale beeldvormingssoftware door Multispectral of im3 te selecteren als optie voor het beeldformaat, en Brightfield voor het monsterformaat. Configureer het project door weefselsegmentatie, kenmerken zoeken, fenotypering, scoren en exporteren te selecteren. Wijzig indien gewenst de beeldresolutie om de analysetijd te verkorten.

Importeer de eerder gecreëerde spectrale bibliotheek en selecteer alle chromogenen die in de analyse moeten worden opgenomen. Open de beeldkubussen die in de trainingsdataset moeten worden opgenomen door de optie Open Image Cube te selecteren. Selecteer ten minste 18% van het totale aantal te analyseren beelden om de nauwkeurigheid van de training te waarborgen.

Kies vervolgens de trainingsset van afbeeldingen. Gebruik afbeeldingen die alle ziektestadia vertegenwoordigen om de segmentatienauwkeurigheid te verhogen. Neem voldoende afbeeldingen met negatieve kleuring op in de trainingsset om bias tijdens deze stap te voorkomen.

Stel de witbalans van de afbeeldingen in de trainingsset in door het pipet-instrument te selecteren en een wit gebied in één afbeelding te kiezen. Selecteer de knop 'volgende' om over te gaan naar de weefselsegmentatie. Gebruik vervolgens het paneel voor weefselcategorieën om de te analyseren weefseltypen te kiezen; voor een nauwkeurigere lokalisatie van eiwitten in het weefsel kunnen de weefselcategorieën worden gebruikt.

Begin met het creëren van het algoritme en het definiëren van weefselcategorieën door de pentool te gebruiken en om groepen cellen in trainingsafbeeldingen te tekenen. Wanneer een weefselcategorie is voltooid, wordt deze stap herhaald voor andere weefselcategorieën. Zorg ervoor dat groepen cellen in de afbeeldingen worden gekozen die kenmerkend zijn voor het type weefselcategorie.

Selecteer de componenten die moeten worden opgenomen in de training voor de weefselsegmenteerder. Kies een passende patroonschaal om de weefselsegmenteerder te trainen. Selecteer vervolgens de knop voor de getrainde weefselsegmenteerder.

Observeer een pop-upvenster waarin de nauwkeurigheid van het aandeel pixels binnen correct geclassificeerde trainingsregio's wordt weergegeven. Segmenteer de volledige trainingsset van afbeeldingen door op segment images te klikken. Controleer na voltooiing de trainingsset om eventueel onjuist geclassificeerd weefsel met het huidige trainingsalgoritme op te sporen.

Wanneer u vertrouwt op de resultaten van het weefselsegmentatie-algoritme, selecteert u de knop 'advance'. Zorg ervoor dat 'nuclei' al is geselecteerd om cytoplasma en/of membraan te kunnen kiezen. Selecteer het tabblad 'nuclei' en kies de juiste instellingen voor de kernsegmentatie.

Kies vervolgens of individuele weefselcategorieën of alle categorieën in de segmentatie worden opgenomen. Selecteer de drempelwaardebenadering op basis van het tegenkleurengestuurd object voor een vereenvoudigde methode om goede resultaten te verkrijgen. Selecteer daarna de drempelwaardebenadering op basis van het object bij een betrouwbare nucleaire tegenkleuring.

Selecteer de parameters voor de vorm van het cytoplasma door het tabblad cytoplasma te kiezen. Selecteer vervolgens de buitenafstand tot de kern. Selecteer daarna de minimale grootte.

Selecteer de volgende optiecomponent met primaire, secundaire en selecteer tertiaire als secundaire opties. Ga naar het membraantabblad. Kies de eerste voor de gebruikte membraanspecifieke marker.

Pas de volledige schaal van de optische dichtheid of OD aan om een minimale drempelwaarde of een positieve waarde voor elke marker op de celmembranen te bepalen. Selecteer vervolgens onder het tabblad 'membrane' de maximale celgrootte. Selecteer na het doorlopen van alle opties 'segment all'.

Pas de instellingen toe op de afbeeldingen en observeer deze. Kies 'advance' om over te gaan naar de stap voor IHC-scoring en selecteer een weefselcategorie om te scoren. Kies het gewenste scoringstype en selecteer het celcompartiment dat voor de scoringanalyse moet worden gebruikt.

Select vervolgens 'view component data' en beweeg de cursor over de trainingsafbeeldingen om de juiste minimale drempelwaarde voor de optische dichtheid van de kleuring voor positieve cellen te bepalen voor de componenten van belang. Exporteer de gegevens voor de trainingsset om het algoritme te testen dat is aangemaakt via weefselsegmentatie, celsegmentatie en scorewaarden; volg de aanwijzingen om een nieuwe map voor de exportmap aan te maken. Selecteer de afbeeldingen en tabellen die moeten worden aangemaakt en in de analyse moeten worden opgenomen.

Voer vervolgens de analyse uit door de optie 'export voor alles' te selecteren. Wanneer de analyse is voltooid, bekijkt u de celsegmentatie en de scoregegevens voor afbeeldingen met zowel een hoge als een lage kleuring om de nauwkeurigheid van de instellingen te evalueren. Zodra u tevreden bent met de instellingen, klikt u op het tabblad voor batchanalyse om het algoritme naar het actieve project te kopiëren.

Kies vervolgens een nieuwe exportmap en selecteer de afbeeldingen en tabellen die in de analyse moeten worden opgenomen. Kies onder de optie voor invoerbestanden alle afbeeldingen die in de batchanalyse moeten worden opgenomen. Selecteer de optie 'run' om de analyse uit te voeren.

Ga na voltooiing naar het tabblad 'review merge'. Selecteer 'include all' en klik op 'merge' om databladen met samengevatte gegevens voor analyse te maken. De training is uitgevoerd op prostaatweefsels om beelden te segmenteren in epitheliale en stromale delen.

Samen met een niet-weefselcompartiment. Een set trainingsbeelden, die representatief waren voor weefseltypen en ziektestadia van de gehele set beelden, werd geïmporteerd in multispectrale imaging-software. Er werden weefselcategorieën aangemaakt, waaronder stroma, epithelia en niet-weefsel, waarbij de categorieën werden gedefinieerd door handmatig markeringen aan te brengen op de trainingsbeelden.

Er werd een algoritme voor weefselsegmentatie ontwikkeld en toegepast op de trainingsset afbeeldingen om de weefsels nauwkeurig te segmenteren. Met behulp van de multiplex immunohistochemie-techniek werden cellen geïdentificeerd die positief waren voor nucleaire expressie van ER-alpha (rood) en AR (bruin), ondanks overlappende kleur- en metrische signalen. De celmembraanspecifieke expressie van CD-147 werd gekwantificeerd door E-catherine (zwart) als markerproteïne te gebruiken.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u de eiwitexpressie en co-lokalisatie in gefixeerde paraffin-ingebedde weefsels kwantificeert.