Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale
April 8th, 2016
Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.
Het algemene doel van deze methode is om de eiwitexpressie en co-lokalisatie objectief te kwantificeren met behulp van multispectraal beeldvorming. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van fundamenteel onderzoek en diagnostische pathologie, zoals hoe eiwitten van expressie en lokalisatie veranderen na behandeling, of in de progressie van de ziekte. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de subjectiviteit van de operator verwijdert die inherent is aan traditionele kwantificeringsmethoden.
Om het kwantificeringsproces te starten, opent u de multispectraal beeldvormingssoftware om een spectrale bibliotheek te bouwen op basis van eerder voorbereide controleslides die zijn gekleurd met individuele chromogenen en de met hematoxylinen gekleurde slide. Open vervolgens een beeldkubus die is verkregen van een controleslide en selecteer vier tot vijf positief gekleurde gebieden om de chromogeen optisch te definiëren. Herhaal de stappen met beeldkubussen van andere controleslides totdat een complete spectrale bibliotheek die alle chromogenen vertegenwoordigt, is gemaakt en sla de spectrale bibliotheek vervolgens op.
Begin een nieuw project binnen de multispectraal beeldvormingssoftware door Multispectral of im3 te selecteren voor de beeldformaatoptiek en Brightfield voor het steekproefformaat. Configureer het project door segment weefsel, functies zoeken, fenotypering, scoren en exporteren te kiezen. Wijzig indien gewenst de beeldresolutie om de analysetijd te versnellen.
Importeer de eerder gemaakte spectrale bibliotheek en selecteer alle chromogenen die in de analyse moeten worden opgenomen. Open de beeldkubussen die in de trainingsgegevensset moeten worden opgenomen door de optie Beeldkubus openen te selecteren. Selecteer minstens 18% van het totale aantal te analyseren beelden om de trainingsnauwkeurigheid te garanderen.
Kies vervolgens de trainingsset van beelden. Beelden die alle ziektetoestanden vertegenwoordigen, om de segmentatienauwkeurigheid te verhogen. Neem overvloedige negatieve kleuringsbeelden op in de trainingsset om vooringenomenheid tijdens deze stap te voorkomen.
Stel de witbalans van de beelden in de trainingsset in door het oogdruppelgereedschap te selecteren en een gebied in één afbeelding te kiezen dat wit is. Selecteer de knop Geavanceerd om de weefselsegmentatie te verplaatsen. Gebruik vervolgens het weefselcategorieënpaneel om de weefseltypen te kiezen die worden geanalyseerd voor een nauwkeurigere eiwitweefsel lokalisatie. Selecteer weefselcategorieën kunnen worden gebruikt.
Begin met het maken van het algoritme en het definiëren van weefselcategorieën door het pengereedschap te gebruiken en rond groepen cellen binnen trainingsbeelden te tekenen. Wanneer u klaar bent met een weefselcategorie, herhaalt u de stap voor andere weefselcategorieën. Zorg ervoor dat u groepen cellen binnen beelden kiest die kenmerkend zijn voor het type weefselcategorie.
Selecteer componenten die moeten worden opgenomen in de training voor de weefselsegmenteerder. Kies een geschikte patroonschaal om de weefselsegmenteerder te trainen. Selecteer vervolgens de knop Getrainde weefselsegmenteerder.
Bekijk een pop-upvenster dat de nauwkeurigheid weergeeft van het aandeel pixels binnen correct geclassificeerde trainingsregio's. Segmenteer de volledige trainingsset van beelden door op Segmenteer afbeeldingen te klikken. Wanneer u klaar bent, bekijkt u de trainingsset om eventueel verkeerd geclassificeerd weefsel met een huidige trainingsalgoritme te vinden.
Wanneer u zeker bent van de resultaten van het weefselsegmentatiealgoritme, selecteert u de Geavanceerd-knop. Zorg ervoor dat kern al is geselecteerd om cytoplasma en/of membraan te kiezen. Selecteer het tabblad Kernen en kies de juiste instellingen voor kernsegmentatie.
Kies vervolgens of individuele of alle weefselcategorieën in de segmentatie zullen worden opgenomen. Selecteer de tegenkleuring object gebaseerde drempelbenadering voor een vereenvoudigde methode om goede resultaten te verkrijgen. Selecteer vervolgens de object gebaseerde drempelbenadering op een betrouwbare nucleaire tegenkleuring.
Selecteer cytoplasma gevormde parameters door het cytoplasma-tabblad te kiezen. Selecteer vervolgens de buitenafstand tot nucleair. Selecteer vervolgens minimum grootte.
Selecteer de volgende optie component met primair, secundair en selecteer tertiair als secundaire opties. Ga naar het membraan-tabblad. Kies eerste voor de membraanspecifieke marker die wordt gebruikt.
Pas de volledige schaal optische dichtheid of OD aan om een minimale drempel of een positief voor elke marker op celmembranen te vinden. Onder het membraan-tabblad selecteert u de maximale celgrootte. Nadat u alle opties hebt geselecteerd, selecteert u Alles segmenteren.
Pas de instellingen toe op de afbeeldingen en observeer ze. Kies Geavanceerd om naar de score IHC-stap te gaan en kies een weefselcategorie om te scoren. Kies een gewenste scoreringstype en kies het celafdeling om te worden gebruikt in de scoreringsanalyse.
Selecteer vervolgens componentgegevens bekijken en beweeg de cursor over de trainingsbeelden om de geschikte optische dichtheid minimale drempel van kleuring voor positieve cellen voor de componenten van belang te vinden. Exporteer de gegevens voor de trainingsset om de algoritme die is gemaakt door weefselsegmentatie celsegmentatie en scoreringswaarden te testen, volg de prompts om een nieuwe map voor de exportdirectory te maken. Selecteer afbeeldingen en tabellen die moeten worden gemaakt en opgenomen in de analyse.
Voer vervolgens de analyse uit door Exporteer alles te selecteren. Wanneer de analyse is voltooid, bekijkt u de celsegmentatie en scoreringsgegevens voor afbeeldingen met zowel hoge als lage kleuring om de nauwkeurigheid van de instellingen te evalueren. Zodra u tevreden bent met de instellingen, klikt u op het tabblad Batchanalyse om het algoritme naar het actieve project te kopiëren.
Kies vervolgens een nieuwe exportdirectory en selecteer de afbeeldingen en tabellen die in de analyse moeten worden opgenomen. Kies onder de optie Invoerbestanden alle afbeeldingen die in de batchanalyse moeten worden opgenomen. Selecteer de optie Uitvoeren om de analyse uit te voeren.
Wanneer u klaar bent, gaat u naar het tabblad Review Merge. Selecteer Alles opnemen en selecteer Merge om gegevensbladen met samenvattingsgegevens voor analyse te maken. Training werd uitgevoerd op prostaatweefsels om afb
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor multiplexed immunohistologie die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming om de expressie en co-lokalisatie van eiwitten objectief te kwantificeren. De techniek is bedoeld om de subjectiviteit van de operator die wordt aangetroffen in traditionele kwantificeringsmethoden te elimineren en de reproduceerbaarheid in onderzoek te verbeteren.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Pathologie
- Immunohistochemische analyse
Achtergrond
- Immunohistochemische analyse evalueert eiwitlokalisatie en -expressie.
- Huidige methoden introduceren vaak subjectiviteit en onreproduceerbaarheid.
- Multispectrale beeldvorming biedt een oplossing voor deze uitdagingen.
- Deze methode kan zowel in fundamenteel onderzoek als in diagnostische pathologie worden toegepast.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitexpressie en co-lokalisatie objectief te kwantificeren.
- Om vragen over eiwitveranderingen na behandeling of ziekteprogressie te beantwoorden.
- Om de nauwkeurigheid van kwantificeringsmethoden in onderzoek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Een spectrale bibliotheek bouwen van controlepreparaten geverfd met individuele chromogenen.
- Gebruik van multispectrale beeldvormingssoftware om beeldkubussen van controlepreparaten te analyseren.
- Optisch definiëren van chromogeengebieden om kwantificering te verbeteren.
- Opslaan van de spectrale bibliotheek voor toekomstige analyses.
Belangrijkste resultaten
- De methode verwijdert met succes de subjectiviteit van de operator.
- Het biedt een betrouwbare manier om eiwitlokalisatie en -expressie te beoordelen.
- Resultaten kunnen worden gereproduceerd in verschillende experimenten.
- Deze techniek kan de begrip in verschillende onderzoeksgebieden bevorderen.
Conclusies
- Multiplexed immunohistologie met multispectrale beeldvorming is een waardevol hulpmiddel.
- De methode verbetert de objectiviteit van eiwitkwantificering.
- Het heeft belangrijke implicaties voor zowel onderzoek als klinische diagnostiek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative multiplexed immunohistochemistry with multispectral imaging addresses the critical need for objective, reproducible protein expression and co-localization data in tissue-based discovery. By eliminating operator subjectivity, this workflow enhances predictive confidence at key inflection points in target validation and translational research. The approach supports robust biomarker evaluation, enabling risk-adjusted portfolio decisions in early and preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantitation of protein expression and spatial localization in tissue context.
- Supports functional target validation by distinguishing subcellular and tissue-specific expression patterns.
- Facilitates mechanistic de-risking through co-localization analysis of multiple biomarkers.
- Improves predictive confidence for advancing targets into downstream screening.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput image acquisition and analysis for assay reproducibility.
- Provides quantitative, compartment-specific readouts suitable for screening workflows.
- Enables robust comparison of compound effects on protein localization and expression.
- Supports platform scalability and reuse across diverse tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker quantitation with disease-relevant tissue and subcellular compartments.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting objective, cross-study comparisons.
- Reduces translational risk by enabling double-positive, single-positive, and negative cell population analysis.
- Facilitates data-driven advancement decisions for candidate biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging workflow integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker assessment.
- Discovery Biology: Objectively quantifies protein expression and co-localization to clarify biological pathways and validate targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates compartment-specific, statistically robust measurements for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Aligns biomarker analysis with disease-relevant tissue architecture and cell populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging and analysis platform for multi-project deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker studies.
- Operational Value: Standardizes image acquisition and analysis, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, multispectral imaging, and image analysis software.
- Needs access to automated slide scanners and compatible multispectral imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and analysis algorithms.
- Adaptation may be needed for different tissue types and disease models.
- Training set selection and algorithm validation are critical for robust, unbiased quantitation.
