Name: Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer eiwitexpressie en co-localisatie kwantificeren met multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming. Deze methode elimineert subjectiviteit en verbetert reproduceerbaarheid in neurologisch en pathologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de Universiteit van Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathologie laboratorium, mede ondersteund door de UW afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde en UWCCC subsidie ​​P30 CA014520, voor het gebruik van de faciliteiten en diensten.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
<li>McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarty%2C+KS+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22">Arch Pathol Lab Med</a>. 109 (8), 716-721 (1985).</li>
<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
<li>Jaraj, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interobserver+reproducibility+of+interpretation+of+immunohistochemical+stains+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer.</a> Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).</li>
<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Het gebruik van traditionele immunohistochemie gaan eiwitexpressie wordt beperkt door subjectieve, semi-kwantitatieve analysemethoden 22,23. Advance platforms zijn gemaakt voor high-throughput analyse van biomarker expressie en lokalisatie. Gedetailleerde segmentatie van zowel weefsel en subcellulaire compartimenten kunnen gebruikers biomarker expressie, lokalisatie, en co-lokalisatie te studeren met andere markers van belang. In eerdere studies hebben we het nut van IHC en multispectrale, vooral wanneer gebr...

<html> Immunohistochemie (IHC) is een standaard laboratorium techniek voor detectie van eiwitten in weefsel en IHC nog veel gebruikt in zowel onderzoek als diagnostische pathologie. De evaluatie van IHC kleuring is vaak semi-kwantitatieve, de invoering van mogelijke vertekening in de interpretatie van de resultaten. Veel semikwantitatieve benaderingen ontwikkeld die zowel kleurintensiteit en kleuring mate nemen in einddiagnose 1-4. Andere systemen omvatten scoring intensiteit en subcellulaire locatie om expressie 5 beter te lokaliseren. Opname van de gemiddelde scores van de verschillende kijkers wordt vaak gebruikt om de effecten van één kijker vertekening 6 minimaliseren. Ondanks deze inspanningen subjectiviteit analyse blijft, met name wanneer zij de mate van kleuring 7. Protocol standaardisatie en het minimaliseren van de subjectiviteit van de menselijke inbreng is van cruciaal belang voor het creëren van accurate, reproduceerbare IHC resultaten. content &quot;&gt; Er zijn andere opties naast IHC voor het bepalen van proteïne expressie in weefsels. In het onderzoek instelling is immunohistochemie traditioneel beschouwd als middel om eiwit lokalisatie 8 onderzoeken, terwijl andere technieken zoals immunoblotting worden beschouwd als gouden standaard voor het onderzoeken eiwitexpressie . Bepaling weefsel of cel compartiment-specifieke expressie is moeilijk zonder integratie van geavanceerde technieken zoals mobiele fractionering of laser capture microdissectie 9,10. Het gebruik van fluorescente antilichamen op weefselobjectglaasjes biedt een redelijk compromis, maar achtergrond autofluorescentie door NADPH, lipofuscins, reticulaire vezels, collageen en elastine kunnen accurate kwantificering lastig 11 te maken. Geautomatiseerde computationele pathologie platformen zijn een veelbelovende richting voor meer objectieve kwantificering van pathologie kleuring 12-15. De combinatie van multispectrale beeldvorming met weefsel microarraysfaciliteert high-throughput analyse van eiwitexpressie in grote steekproefomvang. Bij deze technieken analyse van eiwit-co-lokalisatie, kleuring heterogeniteit en weefsel- en subcellulaire lokalisatie mogelijk terwijl zowel inherente vooroordelen en tijd voor analyse aanzienlijk verminderen, terwijl terugkeer data in een continu plaats categorische indeling 16. Daarom was het doel van deze studie naar het nut van en de methodologie voor het uitvoeren van multiplex-immunohistochemie met de analyse, het gebruik van multispectrale imaging software te demonstreren. Dit protocol is geschreven voor handmatige, multiplex immunohistochemische kleuring van een weefselsectie dia met vier geoptimaliseerde monoklonale antilichamen. Als representatief experiment, kern anti-konijn oestrogeen receptor alpha (ERa) en androgeenreceptor (AR) gemultiplext met membraangebonden anti-muis CD147 en membraangebonden anti-muis E-cadherine. Elk antilichaam van keuze kan worden substituted voor de hierin genoemde antilichamen, maar elke combinatie van antilichamen vereist afzonderlijke optimalisatie. Voorbehandeling van alle antilichamen identiek zijn. De AR en CD147 antilichamen moet individueel en vervolgens worden geoptimaliseerd als een cocktail. Elk antilichaam wordt gedetecteerd met een biotine-vrij polymeersysteem en één van 4 unieke chromogenen.

<table><tbody><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 2, Vuur &ndash; 3, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol-200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355223</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 0, Vuur &ndash; 3, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 2, Vuur &ndash; 0, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 2, Vuur &ndash; 0, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 0, Vuur &ndash; 1, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 1, Vuur &ndash; 0, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Vermijd contact met huid en ogen. Kan huidirritatie en oogbeschadiging veroorzaken.</td></tr><tr><td>Oestrogen Receptor alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Androgen Receptor</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare Medical</td><td>PD904</td><td>Speciaal ontworpen voor gebruik met Tris-gebaseerde antilichamen</td></tr><tr><td>DeCloaking Chamber&nbsp;</td><td>Biocare Medical</td><td>Model DC2002</td><td>Neem normale voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van een snelkookpan</td></tr><tr><td>Barrier pen-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturing Kit-Elution step</td><td>Biocare Medical</td><td>DNS001H</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Betazoid DAB Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. DAB staat bekend als een vermoedelijke carcinogeen. 2. Stel DAB-componenten niet bloot aan sterk licht of direct zonlicht. 3. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en kleding. 4. DAB kan huidsensibilisatie veroorzaken. Vermijd contact met huid en ogen. 5. Neem alle federale, staats- en lokale milieuwetgeving met betrekking tot verwijdering in acht</td></tr><tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosief. Zuur dat huidirritatiek of oogbeschadiging kan veroorzaken.&nbsp;</td></tr><tr><td>Vina Green Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Schadelijk indien ingeslikt</td></tr><tr><td>Bajoran Purple Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Ontvlambare vloeistof. Uit de buurt van hitte, vlammen en vonken houden. Schadelijk bij inslikken of absorptie. Vermijd contact met huid of ogen, en vermijd inademing.</td></tr><tr><td>Cat Hematoxylin</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>Paarse &nbsp;oplossing &nbsp;met &nbsp;een &nbsp;milde &nbsp;azijnzuur &nbsp; (azijn) &nbsp;geur. &nbsp;Kan &nbsp;irriterend &nbsp;zijn &nbsp;voor &nbsp;huid &nbsp;of &nbsp;ogen. &nbsp;Vermijd &nbsp;contact &nbsp;met &nbsp;huid &nbsp;en &nbsp;ogen. &nbsp;Vermijd &nbsp;inname.</td></tr><tr><td>XYL Mounting Media</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>NFPA-classificatie: Gezondheid &ndash; 2, Vuur &ndash; 3, Reactiviteit &ndash; 0</td></tr><tr><td>1.5 Coverslips</td><td>Fisher Brand</td><td>22266858</td><td>Scherpe randen</td></tr><tr><td>Incubation (Humidity)Chamber</td><td>obsolete</td><td>obsolete</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar</td></tr><tr><td>Convection Oven</td><td>Stabil- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Background Punisher Blocking Reagent</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Dit product is niet geclassificeerd als gevaarlijk.&nbsp;</td></tr><tr><td>inForm software</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>Primaire multispectrale beeldvormingssoftware gebruikt in manuscript</td></tr><tr><td>Nuance software</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>Software gebruikt voor het maken van spectrale bibliotheken binnen manuscript</td></tr><tr><td>Vectra microscope and slide scanner</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>Geautomatiseerde diascanner en microscoop voor het verkrijgen van IM3 beeldkubussen</td></tr></tbody></table>

kwantificering van eiwitexpressie en co-localisatie behulp multiplexverzending immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemie is een veel gebruikte klinische en onderzoekslaboratoriumdetectietechniek voor het onderzoeken van eiwitexpressie en -lokalisatie in weefsels. Er zijn veel semi-kwantitatieve systemen ontwikkeld voor het scoren van expressie met behulp van immunohistochemie, maar de inherente subjectiviteit beperkt de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de resultaten. Bovendien is de onderzoek naar ruimtelijk overlappende biomarkers, zoals nucleaire transcriptiefactoren, moeilijk met de huidige immunohistochemietechnieken. We hebben een systeem ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gelijktijdig onderzoek van meerdere eiwitten met behulp van hoogdoorvoermethoden van multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming. Multiplex immunohistochemie wordt uitgevoerd door sequentiële toepassing van primaire antilichamen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan paardenradenperoxidase of alkalische fosfatase. Verschillende chromogenen worden gebruikt om elk eiwit van belang te detecteren. Gekleurde dia's worden geladen in een geautomatiseerde diascanner en er wordt een protocol gemaakt voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Een spectrale bibliotheek wordt gemaakt door een reeks dia's te kleuren met een enkele chromogeen op elk. Een subset van representatieve gekleurde afbeeldingen wordt geïmporteerd in multispectrale beeldvormingssoftware en een algoritme voor het onderscheiden van weefseltype wordt gemaakt door weefselcompartimenten op afbeeldingen te definiëren. Subcellulaire compartimenten worden gesegmenteerd door gebruik te maken van hematoxylincoulering en aanpassing van het intrinsieke algoritme. Drempelwaarden worden toegepast om positiviteit en eiwitco-lokalisatie te bepalen. Het uiteindelijke algoritme wordt vervolgens toegepast op de volledige set weefsels. De resulterende gegevens stellen de gebruiker in staat om eiwitexpressie te evalueren op basis van weefseltype (bijv. epitheel versus stroma) en subcellulair compartiment (nucleus versus cytoplasma versus plasmamembraan). Co-lokalisatie-analyse maakt onderzoek mogelijk naar dubbel-positieve, dubbel-negatieve en enkel-positieve celtypen. Het combineren van multispectrale beeldvorming met multiplex immunohistochemie en geautomatiseerde beeldacquisitie is een objectieve, hoogdoorvoermethode voor het onderzoek van biomarkers in weefsels.

In figuur 1 is training uitgevoerd op prostaatweefsel segmenteren afbeeldingen in epitheliale en stromale delen, tezamen met het niet-weefselcompartiment. Via de epitheliale membraan marker E-cadherine werd cel segmentatie uitgevoerd om de kern, cytoplasma en membraan gedeelten, getoond in figuur 2 te scheiden. In één experiment gebruikten we gemultiplexte IHC om de expressie en lokalisatie va...

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Het algemene doel van deze methode is om eiwitexpressie en co-lokalisatie objectief te kwantificeren met behulp van multispectrale beeldvorming. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van basisonderzoek en diagnostische pathologie, zoals de wijze waarop eiwitten van expressie en lokalisatie veranderen na een behandeling of tijdens de progressie van een ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de subjectiviteit van de operator, die inherent is aan traditionele kwantificeringsmethoden, wordt geëlimineerd.Om het kwantificatieproces te starten, opent u de software voor multispectrale beeldvorming om een spectrale bibliotheek op te bouwen aan de hand van eerder geprepareerde controlesdia's die zijn gekleurd met individuele chromogenen en de met hematoxyline gekleurde dia. Open vervolgens een beeldkubus die is verkregen van een controlesdia en selecteer vier tot vijf positief gekleurde gebieden om het chromogeen optisch te definiëren. Herhaal deze stappen met beeldkubussen van andere controlesdia's totdat er een volledige spectrale bibliotheek is gecreëerd die alle chromogenen vertegenwoordigt, en sla de spectrale bibliotheek vervolgens op.Start een nieuw project in de multispectrale beeldvormingssoftware door Multispectral of im3 te selecteren als optie voor het beeldformaat, en Brightfield voor het monsterformaat. Configureer het project door weefselsegmentatie, kenmerken zoeken, fenotypering, scoren en exporteren te selecteren. Wijzig indien gewenst de beeldresolutie om de analysetijd te verkorten.Importeer de eerder gecreëerde spectrale bibliotheek en selecteer alle chromogenen die in de analyse moeten worden opgenomen. Open de beeldkubussen die in de trainingsdataset moeten worden opgenomen door de optie Open Image Cube te selecteren. Selecteer ten minste 18% van het totale aantal te analyseren beelden om de nauwkeurigheid van de training te waarborgen.Kies vervolgens de trainingsset van afbeeldingen. Gebruik afbeeldingen die alle ziektestadia vertegenwoordigen om de segmentatienauwkeurigheid te verhogen. Neem voldoende afbeeldingen met negatieve kleuring op in de trainingsset om bias tijdens deze stap te voorkomen.Stel de witbalans van de afbeeldingen in de trainingsset in door het pipet-instrument te selecteren en een wit gebied in één afbeelding te kiezen. Selecteer de knop 'volgende' om over te gaan naar de weefselsegmentatie. Gebruik vervolgens het paneel voor weefselcategorieën om de te analyseren weefseltypen te kiezen; voor een nauwkeurigere lokalisatie van eiwitten in het weefsel kunnen de weefselcategorieën worden gebruikt.Begin met het creëren van het algoritme en het definiëren van weefselcategorieën door de pentool te gebruiken en om groepen cellen in trainingsafbeeldingen te tekenen. Wanneer een weefselcategorie is voltooid, wordt deze stap herhaald voor andere weefselcategorieën. Zorg ervoor dat groepen cellen in de afbeeldingen worden gekozen die kenmerkend zijn voor het type weefselcategorie.Selecteer de componenten die moeten worden opgenomen in de training voor de weefselsegmenteerder. Kies een passende patroonschaal om de weefselsegmenteerder te trainen. Selecteer vervolgens de knop voor de getrainde weefselsegmenteerder.Observeer een pop-upvenster waarin de nauwkeurigheid van het aandeel pixels binnen correct geclassificeerde trainingsregio's wordt weergegeven. Segmenteer de volledige trainingsset van afbeeldingen door op segment images te klikken. Controleer na voltooiing de trainingsset om eventueel onjuist geclassificeerd weefsel met het huidige trainingsalgoritme op te sporen.Wanneer u vertrouwt op de resultaten van het weefselsegmentatie-algoritme, selecteert u de knop 'advance'. Zorg ervoor dat 'nuclei' al is geselecteerd om cytoplasma en/of membraan te kunnen kiezen. Selecteer het tabblad 'nuclei' en kies de juiste instellingen voor de kernsegmentatie.Kies vervolgens of individuele weefselcategorieën of alle categorieën in de segmentatie worden opgenomen. Selecteer de drempelwaardebenadering op basis van het tegenkleurengestuurd object voor een vereenvoudigde methode om goede resultaten te verkrijgen. Selecteer daarna de drempelwaardebenadering op basis van het object bij een betrouwbare nucleaire tegenkleuring.Selecteer de parameters voor de vorm van het cytoplasma door het tabblad cytoplasma te kiezen. Selecteer vervolgens de buitenafstand tot de kern. Selecteer daarna de minimale grootte.Selecteer de volgende optiecomponent met primaire, secundaire en selecteer tertiaire als secundaire opties. Ga naar het membraantabblad. Kies de eerste voor de gebruikte membraanspecifieke marker.Pas de volledige schaal van de optische dichtheid of OD aan om een minimale drempelwaarde of een positieve waarde voor elke marker op de celmembranen te bepalen. Selecteer vervolgens onder het tabblad 'membrane' de maximale celgrootte. Selecteer na het doorlopen van alle opties 'segment all'.Pas de instellingen toe op de afbeeldingen en observeer deze. Kies 'advance' om over te gaan naar de stap voor IHC-scoring en selecteer een weefselcategorie om te scoren. Kies het gewenste scoringstype en selecteer het celcompartiment dat voor de scoringanalyse moet worden gebruikt.Select vervolgens 'view component data' en beweeg de cursor over de trainingsafbeeldingen om de juiste minimale drempelwaarde voor de optische dichtheid van de kleuring voor positieve cellen te bepalen voor de componenten van belang. Exporteer de gegevens voor de trainingsset om het algoritme te testen dat is aangemaakt via weefselsegmentatie, celsegmentatie en scorewaarden; volg de aanwijzingen om een nieuwe map voor de exportmap aan te maken. Selecteer de afbeeldingen en tabellen die moeten worden aangemaakt en in de analyse moeten worden opgenomen.Voer vervolgens de analyse uit door de optie 'export voor alles' te selecteren. Wanneer de analyse is voltooid, bekijkt u de celsegmentatie en de scoregegevens voor afbeeldingen met zowel een hoge als een lage kleuring om de nauwkeurigheid van de instellingen te evalueren. Zodra u tevreden bent met de instellingen, klikt u op het tabblad voor batchanalyse om het algoritme naar het actieve project te kopiëren.Kies vervolgens een nieuwe exportmap en selecteer de afbeeldingen en tabellen die in de analyse moeten worden opgenomen. Kies onder de optie voor invoerbestanden alle afbeeldingen die in de batchanalyse moeten worden opgenomen. Selecteer de optie 'run' om de analyse uit te voeren.Ga na voltooiing naar het tabblad 'review merge'. Selecteer 'include all' en klik op 'merge' om databladen met samengevatte gegevens voor analyse te maken. De training is uitgevoerd op prostaatweefsels om beelden te segmenteren in epitheliale en stromale delen.Samen met een niet-weefselcompartiment. Een set trainingsbeelden, die representatief waren voor weefseltypen en ziektestadia van de gehele set beelden, werd geïmporteerd in multispectrale imaging-software. Er werden weefselcategorieën aangemaakt, waaronder stroma, epithelia en niet-weefsel, waarbij de categorieën werden gedefinieerd door handmatig markeringen aan te brengen op de trainingsbeelden.Er werd een algoritme voor weefselsegmentatie ontwikkeld en toegepast op de trainingsset afbeeldingen om de weefsels nauwkeurig te segmenteren. Met behulp van de multiplex immunohistochemie-techniek werden cellen geïdentificeerd die positief waren voor nucleaire expressie van ER-alpha (rood) en AR (bruin), ondanks overlappende kleur- en metrische signalen. De celmembraanspecifieke expressie van CD-147 werd gekwantificeerd door E-catherine (zwart) als markerproteïne te gebruiken.Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u de eiwitexpressie en co-lokalisatie in gefixeerde paraffin-ingebedde weefsels kwantificeert.

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.

Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.

Multiplex immunohistochemiekleuring voor in paraffine ingebed longkankerweefsel

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Leer eiwitexpressie en co-localisatie kwantificeren met multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming. Deze methode elimineert subjectiviteit en verbetert reproduceerbaarheid in neurologisch en pathologisch onderzoek.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Meer video's verkennen