Name: Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer hoe je retrovirale integratielocaties uit genomisch DNA amplificeert en sequencet voor nauwkeurige mapping naar een referentiegenoom. Deze methode maakt diepgaande analyse van virale gedragingen in het gastheergenoom mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar dat onze collega Stephen Hughes en Henry Levin voor het advies dat van cruciaal belang voor de NGS protocol voor retrovirale integratie ter sequencing te vestigen in de Engelman lab was. Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies AI039394 en AI052014 (tot ANE) en AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een protocol voor de analyse van retrovirale integratieplaatsen, de initiële virusinfectie stap door de omschrijving van genomische verspreidingspatronen wordt beschreven. Dit protocol is toepasbaar op elk retrovirus geïnfecteerd en elk celtype. Bovendien is de assay pijpleiding is zeer gevoelig, met de potentie om een bevredigend aantal unieke integratieplaatsen van seriële verdunningen van genomisch DNA overeenkomt herstellen tot die van een infectie gestart met een MOI van 6,4 x 10 -5. Deze gevoeligheid ma...

Integratie van viraal DNA (vDNA) in het gastheergenoom is een essentiële stap in de virale levenscyclus. Integratie wordt bereikt door het virale enzym integrase (IN), die zich bezighoudt met twee verschillende katalytische processen die leiden tot de oprichting van een stabiel ingebracht provirus 1. IN subeenheden aangrijpen op de uiteinden van de lineaire vDNA dat wordt gegenereerd door middel van reverse transcriptie, die de hogere orde intasome met vDNA uiteinden samengehouden door een IN multimeer 2-4. IN splitst de 3 &#39;einden van het vDNA stroomafwaarts van invariante 5&#39;-CA-3&#39; sequenties in een proces dat 3&#39;-verwerking, het verlaten verzonken 3&#39;-uiteinden met reactieve hydroxylgroepen op elk uiteinde vDNA 5-8. De intasome wordt vervolgens in de kern ingevoerd als deel van een grote verzameling van gastheer en virale proteïnen bekend als de preintegration complex (PIC) 9-11. Na het ontmoeten van cellulaire doelwit DNA (TDNA), IN gebruikt de vDNA 3&#39;-hydroxyl groups om de TDNA boven- en onderkant strengen in een versprongen wijze aanhangen en tegelijkertijd voegt zich bij de vDNA om TDNA 5 &#39;fosfaatgroepen door het proces van het strand transfer 12,13. Retrovirussen vertonen integratie voorkeuren voor websites op de lokale en wereldwijde schaal. Lokaal, consensus integratie plaatsen bestaan ​​uit zwak geconserveerde palindroom TDNA sequenties die variëren van ongeveer 5-10 bp stroomopwaarts als stroomafwaarts van de vDNA insertieplaatsen 14,15. Wereldwijd retrovirussen richten zich op specifieke chromatine annotaties 16. Er zijn zeven verschillende retrovirale genera - alfa door middel van epsilon, Lenti, en spuma. De lentivirussen, die HIV-1 omvatten, gunst integratie binnen de lichamen van actief getranscribeerd genen 17, terwijl de gammaretrovirussen voorkeur te integreren in de transcriptie start sites (Tsss) en actieve versterker regio&#39;s 18-20. In scherp contrast, is spumavirus sterk neigt in de richting heterochromATIC regio&#39;s, zoals gen-arme-lamina bijbehorende domeinen 21. Lokale TDNA base voorkeuren zijn voor een groot deel bepaald door de specifieke netwerken van nucleoproteïne contacten tussen IN en TDNA 13,22,23. Voor de lentivirussen en gammaretrovirussen, integratie ten opzichte van genomische annotaties is voor een groot deel bepaald door de interactie tussen IN en verwante cellulaire factoren 24-27. Het veranderen van de specifieke kenmerken van de IN-TDNA interactie netwerk 13,22,23,28 en verstoren of re-engineering IN-host-factor interacties 25-27,29-32 zijn bewezen strategieën om de integratie retarget op lokaal en mondiaal niveau, respectievelijk. De kracht van DNA sequencing procedures gebruikt aan catalogus retrovirale integratieplaatsen is enorm in de afgelopen decennia. Integratie sites werden teruggevonden in baanbrekende werk met behulp van bewerkelijke zuivering en handmatige kloontechnieken tot slechts een handvol unieke locaties per studie 33,34 opleveren.De combinatie van LM-PCR amplificatie van LTR-gastheer-DNA kruispunten met de mogelijkheid om afzonderlijke integratieplaatsen voor mens en muis ontwerp genomen veranderde het gebied in kaart met het aantal sites gewonnen uit exogene weefselkweek cellen infecties verhogen tot enkele honderden tot duizenden 17 , 18. De meer recente combinatie van LM-PCR met NGS methodologie bibliotheek diepte rijzen de pan uit gestuurd. Specifiek, pyrosequencing leverde in de orde van tienduizenden unieke integratieplaatsen 30,35-38, terwijl bibliotheken gesequentieerd met behulp van DNA clustervorming miljoenen unieke sequenties 19-21,39 verkregen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde LM-PCR-protocol voor het versterken en het sequencen van retrovirale integratie sites met behulp van DNA-clustering NGS. De werkwijze omvat benodigde adapter sequenties in de PCR primers en dus rechtstreeks in de geamplificeerde DNA-moleculen, waardoor de vereiste weg staat tegen adapter ligatie stap vóór sequencing 40. De bio-informatica-analyse pijpleiding van het parseren van ruwe sequentiegegevens voor LTR-gastheer-DNA junctions het in kaart brengen van unieke integratieplaatsen genomisch features relevant, wordt ook algemeen beschreven. Overeenkomstig de vastgestelde stand van methodologische voorschriften dit gebied 36,38,41-43 voorrang, kunnen aangepaste scripts worden ontwikkeld om de voltooiing van de specifieke stappen in de bioinformatica pijplijn helpen. Het nut en de gevoeligheid van het protocol wordt geïllustreerd met representatieve gegevens door amplificatie, sequencing, en afbeelden van HIV-1 integratieplaatsen van weefselkweek cellen geïnfecteerd met de multipliciteit van infectie (MOI) van 1,0, en een titratiereeks van dit DNA verdund met ongeïnfecteerde cellulair DNA in 5-voudige stappen hoogste verdunning van 1: 15.625 tot bij benadering equivalente MOI opbrengst van 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standaard celkweekmedium, compatibel met HEK293T cellen</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Verschillende partijnummers van serum moeten mogelijk vooraf worden gescreend voor optimale virale productie</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotica die aan DMEM moeten worden toegevoegd</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered saline</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Gebruikt om cellen te wassen</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Gebruikt om aderente cellen los te maken van weefselkweekplaten</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA-transfectie reagens</td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Gebruikt om virusdeeltjes bevattende celkweekmedia te filteren</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Gebruikt om plasmide-DNA over te brengen van virusvoorraden</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Gebruikt om de opbrengst van virusproductie te kwantificeren</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Gebruikt om genomisch DNA uit cellen te zuiveren</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Met dit model van sonicator voer twee rondes uit van werkcyclus, 5%; intensiteit, 3; cycli per uitbarsting, 200; tijd, 80 sec</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Commercieel verkrijgbaar water wordt aanbevolen om de mogelijkheid van kruisbesmetting van monsters te verminderen</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Gebruikt om DNA te zuiveren tijdens bibliotheekconstructie</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Gebruikt om DNA-uiteinden van gesoniceerde DNA-monsters te repareren</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Gebruikt met dATP voor A-staart van gerepareerde DNA-fragmenten</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoxyadenosine trifosfaat</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Restrictieneuklease voor genomisch DNA-splitsing</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Restrictieneuklease om de amplificatie van de stroomafwaartse HIV-1 U5-sequentie te onderdrukken</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzym voor covalente verbinding van compatibele DNA-uiteinden</td></tr><tr><td>DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Laat het bedrijf de oligo's zuiveren. HPLC-zuivering is voldoende voor DNA's &lt;30 nucleotiden; PAGE zuiver langere DNA's&nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Commercieel mengsel dat DNA-polymerase bevat voor PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM oplossingen)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Verdun de vier chemicaliën op ijs met steriele water tot de tussenliggende werkconcentraties van 2,5 mM per dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrofotometer voor bepaling van DNA-concentratie</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>Fluorometer gebruikt om de concentratie van integratieplaatsbibliotheek-DNA te bevestigen</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Tape-based test om de grootteverdeling van integratieplaatsbibliotheek-DNA te bevestigen</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Gebruikt voor NGS</td></tr></tbody></table>

versterking, next-generation sequencing en genomic dna in kaart brengen van retrovirale integratie sites

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retrovirussen vertonen handtekening integratie voorkeuren op zowel de lokale en wereldwijde schaal. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor (1) genereren van diverse bibliotheken van retrovirale integratieplaatsen middels ligatie-gemedieerde PCR (LM-PCR) amplificatie en de volgende generatie sequencing (NGS), (2) kaart brengen van de genomische locatie van elk virus gastheer junction behulp BEDTools, en (3) het analyseren van de gegevens voor statistische relevantie. Genomisch DNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde cellen is gefragmenteerd door digestie met restrictie-enzymen of door sonicatie. Na geschikte DNA end-reparatie, zijn double-stranded linkers geligeerd op de DNA-uiteinden en semi-nested PCR wordt uitgevoerd met primers die complementair zijn aan zowel de lange terminale herhaling (LTR) uiteinde van het virus en de geligeerde linker DNA. De PCR primers dragen sequenties die vereist zijn voor DNA-clustering in NGS, teniet de behoefte aan apart adapter ligatie. Kwaliteitscontrole (QC) is uitgevoerd om DNA-fragment grootteverdeling evalueren en aanpassener DNA opname voorafgaand aan de NGS. Sequence output bestanden worden gefilterd voor LTR-bevattende leest, en de sequenties definiëren van de LTR en de linker zijn weg afgesneden. Bijgesneden gastheercel sequenties worden toegewezen aan een referentie genoom behulp BLAT en gefilterd voor minimaal 97% identiteit met een unieke plaats in de referentie genoom. Unieke integratieplaatsen worden onderzocht voor aangrenzende nucleotide (nt) sequentie en distributie ten opzichte van verschillende genomische functies. Met dit protocol, kan integratieplaats bibliotheken met hoge complexiteit worden geconstrueerd uit genomisch DNA in drie dagen. De gehele protocol dat exogene virale infectie van gevoelige weefselkweek cellen integratieplaats analyse omvat kan derhalve worden uitgevoerd bij ongeveer 1-2 weken. Recente toepassingen van deze technologie hebben betrekking op longitudinale analyse van de integratie sites uit HIV-geïnfecteerde patiënten.

Tabel 4 vermeldt de resultaten van een representatief experiment om de gevoeligheid van NGS illustreren voor het terugwinnen integratieplaatsen uit een kweek van geïnfecteerde cellen. Geïnfecteerde cellulaire DNA werd gebruikt om serieel verdunde genomisch DNA van een infectie waarin elke cel gemiddeld staand een integratie 40. Verdunningen werden bereid in stappen van vijf tot een maximale verdunning van 1: 15.625. Genomisch DNA in het titratiereeks Vervolgen...

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Het algemene doel van deze procedure is om retrovirale integratieplaatsen uit bulk genomisch DNA via PCR te amplificeren en de resulterende DNA-bibliotheek te sequensen, zodat precieze integratielocaties in kaart kunnen worden gebracht ten opzichte van een referentiegenoom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de basis- en klinische retrovirologie door de distributie van integratieplaatsen over een gastheergenoom te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de sequencingdiepte van het DNA en het feit dat veel monsters in één sequencing-run gemultiplext kunnen worden.Plate één dag vóór de transfectie 3,3 × 10⁶ HEK293T-cellen in 10 ml aangevuld Dulbecco's Modified Eagle's Medium in elk van vijf 100 mm petrischalen. Gebruik de volgende dag commercieel verkrijgbare transfectiereagentia of calciumfosfaat om de cellen te transfecteren met 10 µg plasmide dat full-length retrovirale moleculaire klonen bevat, of 9 µg omhulselde elided single round vectors plus 1 µg van een VSV-G expressieconstruct. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan het celmedium.Incubeer de cellen na transfectie bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% koolstofd

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen...

Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Gepoolde DNA-sequencing is een snelle en kosteneffectieve strategie voor zeldzame varianten geassocieerd met complexe fenotypes in grote cohorten op te sporen. Hier beschrijven we de computationele analyse van gecombineerde, next-generation sequencing van 32 kanker-gerelateerde genen met behulp van de SPLINTER softwarepakket. Deze methode is schaalbaar, en van toepassing op alle fenotype van belang.

Detectie van zogenaamde Rare Genomic Varianten uit gepoold Sequencing gebruiken SPLINTER

Leer hoe je retrovirale integratielocaties uit genomisch DNA amplificeert en sequencet voor nauwkeurige mapping naar een referentiegenoom. Deze methode maakt diepgaande analyse van virale gedragingen in het gastheergenoom mogelijk.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Meer video's verkennen