Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Het algemene doel van deze procedure is om retrovirale integratieplaatsen uit bulk genoom-DNA te PCR-amplificeren, en de resulterende DNA-bibliotheek te sequencen, zodat precieze integratielocaties kunnen worden gemapd naar een referentiegenoom. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in fundamentele en klinische retrovirologie te beantwoorden door de verdeling van integratieplaatsen door het hele genoom van de gastheer te analyseren. Het grote voordeel van deze techniek is de diepte van de DNA-sequencing, en het feit dat veel monsters kunnen worden gemultiplext in één sequencing-run.

Eén dag voorafgaand aan transfectie, plateer 3,3 maal 10 tot de zesde HEK293T cellen in 10 milliliters gesupplementeerd Dulbecco's Modified Eagle's Medium in elk van de vijf 100 millimeter schalen. De volgende dag, gebruik commercieel verkrijgbare transfectie reagentia of calciumfosfaat om de cellen te transfecteren met 10 microgram plasmide dat volledige retrovirale moleculaire klonen bevat of negen microgram van ingekapselde enkele ronde vectoren plus één microgram van een VSV-G expressieconstruct. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan het celmedium.

Na de transfectie, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde cellencultuur incubator met 5% koolstofdioxide. Na ongeveer 48 uur, verzamel het virus-bevattende celmedium met behulp van een volumetrische pipet, en laat het door een 0,45 micron filter stromen door middel van zwaartekracht. Vervolgens, concentreer het virus door ultracentrifugeren bij 200.000 Gs gedurende één uur bij vier graden Celsius.

Na centrifugatie, verwijder de supernatant tot er ongeveer 500 microliters DMEM FPS overblijft, en suspendeer het virus-pellet. Voeg 20 eenheden DNase toe en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Bepaal de p24-concentratie met behulp van een HIV-1 p24 antigeen captuur kit volgens de instructies van de fabrikant.

De dag voorafgaand aan infectie, plateer 3,0 maal 10 tot de vijfde HEK293T cellen in 2,5 milliliters DMEM FPS per put in een zes-puttenplaat en incubeer een nacht in een weefselkweek incubator. Infecteer de cellen met een uiteindelijke virale p24-concentratie van 500 nanogram per milliliter in 500 microliters verse DMEM FPS. Incubeer gedurende twee uur in een weefselkweek incubator.

Na twee uur, voeg twee milliliters DMEM FPS voorverwarmd tot 37 graden Celsius toe aan elke put en plaats de plaat terug in de incubator. 48 uur na infectie, verwijder het medium en was de cellen met twee milliliters fosfaat-gebufferd zout oplossing. Verzamel de cellen door 0,5 milliliters Trypsin-EDTA voorverwarmd tot 37 graden Celsius toe te voegen, en inspecteer na enkele seconden de putten visueel op cel loslating.

Voeg vervolgens twee milliliters voorverwarmd DMEM FPS toe en suspendeer de cellen door voorzichtig tien keer op en neer te pipetten met een volumetrische pipet. Breng de oplossing over naar een 75 vierkante centimeter weefselkweek flacon bevattend 18 milliliters voorverwarmd DMEM FPS, en plaats terug in de weefselkweek incubator. Een minimum van vijf dagen na infectie, verzamel de cellen zoals eerder en suspendeer in vijf milliliters voorverwarmd DMEM FPS door te pipetten.

Centrifugeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 2.500 Gs, zuig vervolgens op en gooi het supernatant weg. Ten slotte, extraheer genoom-DNA uit het cel pellet met behulp van een commercieel verkrijgbaar kit. Eluteer het DNA van de meegeleverde ionenuitwisselingskolom met 200 microliters van milimolair Tris-HCL bij pH 8,5.

Na sonicatie van het genoom-DNA, zuiver het gesoniceerde DNA met behulp van een PCR zuiveringskit. Vervolgens, repareer het DNA met behulp van een end reparatie kit. Na zuivering van het DNA zoals eerder, A staart het DNA met behulp van Klenow Exo-Minus enzym.

Alternatief, voor fragmentatie door restrictie-endonuclease vertering, snij genoom-DNA met een cocktail van enzymen die 5'TA overhangs genereren, evenals een incompatibel enzym zoals BglII dat stroomafwaarts van de stroomopwaartse virale LTR snijdt. Snijd 10 microgram genoom-DNA in een uiteindelijk volume van 100 microliters. Incubeer een nacht bij 37 graden Celsius.

Zorg ervoor dat het uiteindelijke DNA wordt opgeruimd met behulp van de PCR zuiveringskit. De linker die gebruikt zal worden met gesoniceerd DNA moet een compatibel T 3'overhang bevatten, terwijl de linker voor MseI gedigesteerd DNA een compatibel 5'TA overhang moet bevatten. Begin met het annealen van 10 micromolar van de korte en lange linker strengen in 35 microliters Tris-HCL EDTA buffer door te verwarmen tot 90 graden Celsius en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur in stappen van één graad Celsius per minuut.

Bereid vervolgens ten minste vier parallelle ligatiereacties per genoom-DNA monster voor die 1,5 micromolar geligeerd linker, één microgram gefragmenteerd DNA, en 800 eenheden T4 DNA ligase bevatten in een uiteindelijk volume van 50 microliters. Ligereer een nacht bij 12 graden Celsius. Voor monsters bereid door sonicatie, verteer de gezuiverde ligatiereactie met een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van de stroomopwaartse LTR snijdt.

Gebruik 100 eenheden van het geschikte enzym onder de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden gedurende een nacht. Zorg ervoor dat de uiteindelijke producten worden gezuiverd met behulp van een PCR zuiveringskit. Bereid de eerste ronde PCR's voor met behulp van de hier getoonde reagentia.

Voer de eerste ronde PCR uit met behulp van de volgende parameters: 94 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 graden Celsius gedurende 15 seconden, 55 graden Celsius gedurende 30 seconden, 68 graden Celsius gedurende 45 seconden. Beëindig met 68 graden Celsius gedurende 10 minuten. Pool de eerste ronde reacties en zuiver het DNA zoals eerder.

Bereid vervolgens de tweede ronde PCR's voor die de hier getoonde reagentia bevatten. Gebruik dezelfde cyclusparameters als voor de eerste ronde