Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Het algemene doel van deze procedure is om retrovirale integratieplaatsen uit bulk genomisch DNA via PCR te amplificeren en de resulterende DNA-bibliotheek te sequensen, zodat precieze integratielocaties in kaart kunnen worden gebracht ten opzichte van een referentiegenoom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de basis- en klinische retrovirologie door de distributie van integratieplaatsen over een gastheergenoom te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de sequencingdiepte van het DNA en het feit dat veel monsters in één sequencing-run gemultiplext kunnen worden.

Plate één dag vóór de transfectie 3,3 × 10⁶ HEK293T-cellen in 10 ml aangevuld Dulbecco's Modified Eagle's Medium in elk van vijf 100 mm petrischalen. Gebruik de volgende dag commercieel verkrijgbare transfectiereagentia of calciumfosfaat om de cellen te transfecteren met 10 µg plasmide dat full-length retrovirale moleculaire klonen bevat, of 9 µg omhulselde elided single round vectors plus 1 µg van een VSV-G expressieconstruct. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan het celmedium.

Incubeer de cellen na transfectie bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% koolstofdioxide. Oogst na ongeveer 48 uur het virushoudende celmedium met een volumetrische pipette en laat dit door zwaartekracht door een 0,45 micron filter vloeien. Concentreer vervolgens het virus door ultracentrifugatie bij 200.000 G gedurende één uur bij vier °C.

Verwijder na centrifugatie het supernatant totdat er ongeveer 500 µL DMEM FPS overblijft, en resuspendeer de viruspellet. Voeg 20 units DNase toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Bepaal de p24-concentratie met een HIV-1 p24-antigeen capture kit volgens de instructies van de fabrikant.

Zaai de dag vóór de infectie 3,0 × 10⁵ HEK293T-cellen uit in 2,5 milliliter DMEM FPS per putje in een six-well plaat en incubeer deze gedurende de nacht in een weefselkweekincubator. Infecteer de cellen met een uiteindelijke virale p24-concentratie van 500 nanogram per milliliter in 500 microliter vers DMEM FPS. Incubeer gedurende twee uur in een weefselkweekincubator.

Voeg na twee uur twee milliliter DMEM FPS, voorverwarmd tot 37 °C, toe aan elke put en plaats de plaat terug in de incubator. Verwijder 48 uur na infectie het medium en was de cellen met twee milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing. Oogst de cellen door 0,5 milliliter Trypsin-EDTA, voorverwarmd tot 37 °C, toe te voegen en controleer de putten na enkele seconden visueel op het loslaten van de cellen.

Voeg vervolgens twee milliliters voorverwarmd DMEM FPS toe en resuspendeer de cellen door 10 keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een maalpipet. Breng de oplossing over naar een weefkweekfles van 75 vierkante centimeter die 18 milliliters voorverwarmd DMEM FPS bevat, en plaats deze terug in de weefkweekincubator. Oogst de cellen minimaal vijf dagen na infectie op dezelfde wijze als voorheen en resuspendeer deze door middel van pipetteren in vijf milliliters voorverwarmd DMEM FPS.

Centrifugeer de oplossing vijf minuten bij kamertemperatuur bij 2 500 Gs, aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Extraheer tot slot het genomisch DNA uit de celpellet met behulp van een commercieel verkrijgbare kit. Elueer het DNA uit de meegeleverde ionenuitwisselingskolom met 200 µL millimolair Tris-HCL bij pH 8,5.

Na sonicatie van het genomisch DNA wordt het gesoniceerde DNA gezuiverd met een PCR-zuiveringskit. Repareren vervolgens het DNA met een end repair-kit. Na opnieuw zuiveren van het DNA, wordt het DNA voorzien van een A-overhang met behulp van het Klenow Exo-Minus-enzym.

Als alternatief, voor fragmentatie door restrictie-endonuclease-digestie, wordt genomisch DNA geknipt met een cocktail van enzymen die 5'TA-overhangen genereren, evenals een incompatibel enzym zoals BglII dat stroomafwaarts van de stroomopwaartse virale LTR knipt. Knip 10 µg genomisch DNA in een eindvolume van 100 µL. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C.

Zorg ervoor dat het uiteindelijke DNA wordt gezuiverd met de PCR-zuiveringskit. De linker die wordt gebruikt bij gesoniceerd DNA moet een compatitieve T 3'-overhang bevatten, terwijl de linker voor MseI-verteerd DNA een compatitieve 5'TA-overhang moet bevatten. Begin met het annealen van 10 µM van de korte en lange linkerstrengen in 35 µL Tris-HCL EDTA-buffer door te verhitten tot 90 °C en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur in stappen van één °C per minuut.

Bereid vervolgens ten minste vier parallelle ligatiereacties voor per genomisch DNA-monster, bestaande uit 1,5 µM geligatteerde linker, 1 µg gefragmenteerd DNA en 800 units T4 DNA-ligase in een eindvolume van 50 µL. Ligate overnight bij 12 °C. Voor monsters die via sonicatie zijn bereid, dient de gezuiverde ligatiereactie te worden gedigesteerd met een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van de upstream LTR knipt.

Gebruik 100 units van het juiste enzym gedurende de nacht onder de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden. Zorg ervoor dat de eindproducten worden gezuiverd met een PCR-zuiveringskit. Bereid de eerste ronde PCR's voor met de hier getoonde reagentia.

Voer de eerste ronde PCR uit met de volgende parameters: 94 °C gedurende twee minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 15 seconden, 55 °C gedurende 30 seconden en 68 °C gedurende 45 seconden. Sluit af met 68 °C gedurende 10 minuten. Voeg de reacties van de eerste ronde samen en zuiver het DNA zoals voorheen.

Bereid vervolgens de tweede ronde PCR's voor met de hier getoonde reagentia. Gebruik dezelfde cyclusparameters als voor de eerste ronde PCR. Nadat het DNA uit de tweede rondereactie is samengevoegd en gezuiverd, voert u kwaliteitscontrole en next-generation sequencing uit, en analyseert u de integratieplaatsen aan de hand van de gedetailleerde instructies in het geschreven gedeelte van het protocol.

Integratieplaatsen van bibliotheken die zijn voorbereid door digestie met restrictie-enzymen, zoals links getoond, of sonicatie, zoals rechts getoond, zijn uitgelijnd met behulp van web logo-software. Elke verdunning in de titratieserie is afgebeeld, van onverdund DNA bovenaan de figuur tot de maximale verdunning van 1 op 15.625 onderaan. De mate van zekerheid neemt af bij een toenemende verdunning van het DNA uit geïnfecteerde cellen.

Deze afbeelding toont het sequentielogo voor de gekoppelde random controle van 50.000 unieke genomische locaties. Merk op dat de random locaties die zijn uitgelijnd vanuit de MRC-dataset, in tegenstelling hiertoe, geen significante niveaus van basevoorkeuren vertoonden. Zodra de methode onder de knie is, kunnen integratielocatie-bibliotheken in drie dagen worden geprepareerd uit genomisch DNA.

De mapping van integratieplaatsen, van de initiële infectie tot de voltooide bio-informatica, kan dus in ongeveer twee weken worden voltooid. Na deze procedure kunnen duizenden of zelfs miljoenen unieke retrovirale integratieplaatsen worden gecatalogiseerd, en kunnen diverse analyses worden uitgevoerd om associaties tussen insertieplaatsen en genomische annotaties te kwantificeren.