High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Het algemene doel van deze klonering- en transformatieprocedure is om op efficiënte wijze CRISPR-vectoren te genereren en mutante tomatenwortels uit te schakelen die kunnen worden gebruikt in functionele genomische studies. Deze methode is een nuttig hulpmiddel op het gebied van plantengenomica omdat het een groot aantal knockout-mutanten kan genereren die in verschillende wortelprocessen kunnen worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de kloneringprocedure in één stap kan worden voltooid, waardoor groepsmaterialen in slechts enkele weken kunnen worden verkregen.

Ontwerp eerst geleidings-RNA of gRNA-oligo's om het GN19-gedeelte van de doelmotiefs op te nemen, geflankeerd door de vijf prime en drie prime 20 nucleotidensequenties die nodig zijn voor DNA-assemblage. Verwerk één tot vijf microgram van het P201N caznine-plasmide met het restrictie-enzym Spe1 bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Na het zuiveren van de vertering volgens de instructies van de fabrikant, opnieuw opgehangen in 15 microliter van 10 millimolair Trs HCL.

Bepaal de hoeveelheid DNA door middel van UV-spectrofotometrie. Voer een tweede vertering uit met een restrictie-enzym Swa1 bij 25 graden Celsius gedurende twee uur. Controleer 100 tot 200 nanogram op een nulpuntachtigste procent agarosegel om volledige vertering te bevestigen.

Een correct verteerd plasmide zal een enkele band hebben bij 14.313 basenparen. Gebruik zes promotor- en scaffold-DNA's van de puck gRNA shuttle plasmide om de medicago truncatula te PCR-versterken. Gebruik de primer Swa1 en Mtu6F en MTU6R, en scaffold F in Spe1 scaffold R, in een hoge-fideliteitspolymerase.

Bekijk drie microliter aliquots van PCR-producten op een een procent agarosegel om de amplificatie te bevestigen. De MTU6 amplicon is 377 basenparen, en de scaffold amplicon is 106 basenparen. Zuiver de resterende PCR-producten volgens de instructies van de fabrikant.

Bepaal de hoeveelheid door middel van UV-spectrofotometrie zoals eerder en bewaar bij min twintig graden Celsius. Vervolgens het gehele buisje gRNA-oligo's opnieuw opgehangen tot 100 micromolair in laboratoriumkwaliteit water. Voeg één microliter van de oligo's toe aan 500 microliters van 1xNEB-buffer twee punt één en meng goed.

Programmeer een thermische cyclus met een verwarmd deksel om op 50 graden Celsius te houden. Combineer 100 nanogram van het gelineariseerde vector, 50 nanogram van MtU6-promotor, 12 nanogram van scaffold, en één microliter van verdunde gRNA-oligo in water tot een eindvolume van vijf microliter. Voeg vijf microliter van 2X hoge-fideliteits DNA-assemblage Mastermix toe.

Meng goed en centrifugeer. Incubeer de reactie gedurende 60 minuten in de 50 graden Celsius thermocycler. Na de uur op 50 graden Celsius, plaats de reactie op ijs en gebruik vervolgens twee microliter om competente E.Coli-cellen te transformeren met behulp van standaardtechnieken.

Plateer de transformatie op LB Agar aangevuld met 50 milligram per milliliter kanamycine en incubeer bij 37 graden Celsius een nacht. Selecteer de kolonies met behulp van PCR met de primer StUb3p 218R en 1Sce1R. Verdun een adequaat van de resterende DNA-assemblagereactie met water een tot vijf, en gebruik één microliter als een positieve controle voor de kolonieselectie.

Voeg ook één nanogram van circulair P201N casnine-plasmide toe als een controle zonder insert. Na PCR-amplificatie met behulp van de parameters in het geschreven deel van het protocol, bekijk het PCR-product op een een procent agarosegel. Correcte inserties hebben een band van 725 basenparen en vectoren zonder insert hebben een band van 310 basenparen.

Laat positieve kolonies overnacht groeien in LB Can50 vloeibare culturen bij 37 graden Celsius. Zuiver de volgende dag de plasmiden met behulp van een plasmide-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Na Sanger-sequencing van de gezuiverde plasmiden met de StuB3P218R-primer, aligneer de chromatogrammen op de MtU6-promotor, doel- en scaffoldsequenties om ervoor te zorgen dat er geen fouten zijn geïntroduceerd tijdens het klonen.

Voer een diagnostische vertering uit door één microgram van het plasmide te verteren met EcoR5 en Sti1. Wanneer bekeken op een nulpuntachtigste agarosegel, zou dit bandpatroon moeten worden gezien. Transformeer ten slotte de plasmiden in Agrobacterium rhizogenes-stam ARqua1 door één microliter van de plasmidevoorbereiding toe te voegen aan 50 microliter van elektrocompetente cellen en elektroporeren in een één millimeter cuvet.

Voeg ongeveer 500 microliter SOC-media toe en schud gedurende twee uur bij 28 graden Celsius. Plateer vervolgens op LB Can50-platen en laat groeien bij 28 graden Celsius gedurende twee dagen. Begin deze sectie van de procedure door tomatenzaden in 20 procent huishoudelijke bleekmiddel gedurende 15 minuten te steriliseren met constant mengen.

Breng vervolgens de zaden over naar een laminaire flowkap. Verwijder het bleekmiddel en was drie keer in steriel laboratoriumkwaliteit water. Plateer 30 zaden in een GA7-doos met een halve MS-media.

Laat gedurende ongeveer twee dagen in het donker ontkiemen. Zodra de zaden zijn ontkiemd, verplaats de GA7-dozen in het licht. De dag voor de transformatie, A.rhizogenes-culturen uitstrijken op vast LB met Can50 en gedurende een nacht laten groeien bij 28 graden Celsius. Op de dag van de transformatie, werk in de laminaire flowkap om 25 microliter Acetosyringone toe te voegen aan 50 milliliter van een halve MS en giet zes milliliter in elke kweekbuis.

Gebruik een gebogen 200 microliter tip om A.rhizogenes-cellen van de plaat te schrapen en op te schorsen in de zes milliliter van een halve MS vloeistof. Vortex de buis om de cellen volledig op te schorsen. Nadat cellen van elk vector zijn opgeschort, neem één milliliter cellen en meet de optische dichtheid op een vaste golflengte van 600 nanometer.

Voeg twee milliliter van een halve MS vloeistof toe aan een petrischaal met een steriele filterpapier