High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Het algemene doel van deze klonerings- en transformatieprocedure is het efficiënt genereren van CRISPR-vectoren en knockout-mutante tomatenwortels die kunnen worden gebruikt in functionele genomische studies. Deze methode is een nuttig instrument in het veld van de plantgenomica, omdat het een groot aantal knockout-mutanten kan genereren die kunnen worden ingezet bij diverse wortelprocessen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de kloneringsprocedure in één enkele stap kan worden voltooid, waardoor groepsmaterialen in slechts enkele weken kunnen worden verkregen.

Ontwerp eerst guide RNA- of gRNA-oligo's die het GN19-gedeelte van de doelmotieven bevatten, geflankeerd door de 20 nucleotidsequenties aan de 5'- en 3'-uiteinden die nodig zijn voor de DNA-assemblage. Verteer één tot vijf microgram P201N caznine-plasmide met het restrictie-enzym Spe1 bij 37 °C gedurende twee uur. Nadat het digestaat via een kolom is gezuiverd volgens de instructies van de fabrikant, wordt dit opnieuw opgelost in 15 µL 10 mM Tris-HCl.

Kwantificeer de hoeveelheid DNA via UV-spectrofotometrie. Voer een tweede digestie uit met het restrictie-enzym Swa1 bij 25 °C gedurende twee uur. Controleer 100 tot 200 ng op een 0,8% agarosegel om de volledige digestie te bevestigen.

Een correct gedigesteerd plasmide zal één enkele band vertonen bij 14.313 baseparen. Om de medicago truncatula via PCR te amplificeren, worden zes promoter- en scaffold-DNA's van het puck gRNA shuttle-plasmide gebruikt. Gebruik de primers Swa1 en Mtu6F en MTU6R, en scaffold F in Spe1 scaffold R, in een high-fidelity polymerase.

Visualiseer drie microliter aliquots van PCR-producten op een één procent agarosegel om de amplificatie te bevestigen. Het MTU6-amplicon is 377 basenparen en het scaffold-amplicon is 106 basenparen. Purificeer de resterende PCR-producten via een kolom volgens de instructies van de fabrikant.

Kwantificeer via UV-spectrofotometrie zoals voorheen en bewaar bij -20 °C. Resuspendeer vervolgens de gehele buis met gRNA-oligo's tot 100 µM in water van laboratoriumkwaliteit. Voeg één µL van de oligo's toe aan 500 µL 1x NEB-buffer 2.1 en meng goed.

Programmeer een thermocycler met een verwarmde klep om deze op 50 °C te houden. Meng 100 ng van de gelineariseerde vector, 50 ng MtU6-promotor, 12 ng Scaffold en één µL verdunde gRNA-oligo in water tot een eindvolume van vijf µL. Voeg vijf µL 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix toe.

Meng goed en centrifugeer kort. Incubeer de reactie gedurende 60 minuten in de thermocycler op 50 °C. Plaats de reactie na het uur op 50 °C op ijs en gebruik vervolgens twee µL om competente E.coli cellen te transformeren middels standaardtechnieken.

Plateer de transformatie op LB-agar aangevuld met 50 mg/mL kanamycine en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C. Screen de kolonies middels PCR met de primers StUb3p 218R en 1Sce1R. Verdun een aliquot van de resterende DNA-assemblagereactie met water in een verhouding van 1:5 en gebruik 1 µL als positieve controle voor de koloniescreening.

Voeg daarnaast één nanogram circulair P201N casnine-plasmide toe als controle zonder insert. Na PCR-amplificatie met de parameters die in het geschreven gedeelte van het protocol staan, wordt het PCR-product gevisualiseerd op een één procent agarosegel. Correcte inserties vertonen een band van 725 baseparen en vectoren zonder inserten vertonen een band van 310 baseparen.

Kweek positieve kolonies in LB Can50 vloeibare culturen gedurende de nacht bij 37 °C. Zuiver de volgende dag de plasmiden met een plasmidpurificatiekit volgens de instructies van de fabrikant. Na Sanger-sequencing van de gezuiverde plasmiden met de StuB3P218R-primer, worden de chromatogrammen uitgelijnd met de MtU6-promotor, Target- en scaffold-sequenties om te controleren of er geen fouten zijn geïntroduceerd tijdens het kloneren.

Voer een diagnostische digestie uit door één microgram plasmide te digesteren met EcoR5 en Sti1. Wanneer dit op een 0,8% agarosegel wordt gevisualiseerd, moet dit bandenpatroon zichtbaar zijn. Transformeer tot slot de plasmiden in Agrobacterium rhizogenes stam ARqua1 door één microliter van de plasmidepreparatie toe te voegen aan 50 microliter electrocompetente cellen en deze te electroporeren in een cuvette van 1 millimeter.

Voeg ongeveer 500 µL SOC-medium toe en schud gedurende twee uur bij 28 °C. Plaats ze vervolgens op LB Can50-platen en laat ze twee dagen groeien bij 28 °C. Begin dit deel van de procedure door tomatenzaden 15 minuten te steriliseren in 20% huishoudbleekmiddel onder voortdurend mengen.

Breng de zaden vervolgens over naar een laminaire flowkast. Verwijder het bleekmiddel en was de zaden drie keer met steriel laboratoriumwater. Plaats 30 zaden in een GA7-doos met een half-sterkte MS-medium.

Laat de zaden ongeveer twee dagen in het donker kiemen. Zodra de zaden zijn gekiemd, worden de GA7-dozen in het licht geplaatst. De dag vóór de transformatie worden A.rhizogenes-culturen uitgestreken op vaste LB bevattende Can50 en gedurende één nacht gekweekt bij 28 °C. Op de dag van de transformatie wordt in de laminaire flowkast 25 µL Acetosyringone toegevoegd aan 50 mL halve sterkte MS-medium, waarvan 6 mL in elke cultuurbuis wordt gegoten.

Gebruik een gebogen 200 µL tip om A.rhizogenes-cellen van de plaat te schrapen en resuspendeer deze in de 6 mL halve sterk MS-medium. Vortex de buis om de cellen volledig te resuspenderen. Neem na het resuspenderen van de cellen van elke vector 1 mL cellen en meet de optische dichtheid bij een vaste golflengte van 600 nm.

Voeg twee milliliters van een halve sterkte MS-vloeistof toe aan een petrischaal met een steriel filterpapier. Snijd de cotylodonen uit de zaailingen en plaats deze op het bevochtigde filterpapier. Zodra alle cotylodonen zijn verzameld, wordt de meest distale centimeter van de cotylodonen afgesneden, resulterend in cotyledonstukjes met twee gesneden uiteinden.

Voeg de explantaten toe aan de A.rhizogenes-oplossingen en meng deze. Incubeer gedurende 20 minuten met af en toe omkeren. Voeg tijdens de incubatie met A.rhizogenes voor elke construct-transformatie een stukje filterpapier toe aan een petrischaal.

Zet daarnaast een half MS-vast medium zonder antibiotica in de laminaire flowkast om te drogen. Gebruik steriele pincetten om de cotylodonen uit de A.rhizogenes-oplossing te scheppen en plaats deze op droog filterpapier. Dek ze af met een petrischaaldeksel om te voorkomen dat de weefsels uitdrogen terwijl u doorgaat naar de volgende transformatie.

Dep vervolgens de cotylodonen op het filterpapier en breng ze met de abaxiale zijde naar boven over naar een half MS-medium. Omwikkel de platen met chirurgische tape en co-cultiveer deze gedurende twee dagen in het donker bij kamertemperatuur. Breng de cotylodonen na de co-cultivatie met de abaxiale zijde naar boven over naar aangevuld half MS-medium.

Omwikkel met chirurgische tape. Houd de culturen onder fluorescentielampen bij kamertemperatuur met een fotoperiode van 16 uur. Na anderhalf tot twee weken worden met een steriele pincet en een scalpel wortels van ten minste twee centimeter lengte uit de cotylodonen gesneden en overgebracht naar een half MS-medium aangevuld met Ticarcillon/Clavulanate Acid en Kanamycine.

Breng tien tot 15 wortels over naar één enkele plaat. Markeer de positie van de wortelpunten met een markeerstift. Wikkel deze in chirurgische tape en bewaar ze in de kweekkamer.

Na één week is te zien dat de getransformeerde wortels groeien op het selectieve medium. Oogst een submonster van de getransformeerde wortels voor DNA-extractie met de voorkeursmethode voor DNA-extractie. Hairy roots zijn zichtbaar vanuit de cotylodonen 11 dagen na transformatie.

De wortels worden gedurende ongeveer één week geselecteerd op een half MS-medium aangevuld met Ticarcillon/Clavulanate Acid en Kanamycine. Grijze balken geven de positie van de wortelpunten aan op het moment van uitplaten. Dit is een voorbeeld van het kloneren en sequensen van PCR-producten om DNA-mutaties te bepalen met twee verschillende gentargets in vier verschillende hairy root-events.

Het grijze vak geeft de GN20 GG-doelsequentie aan en delta geeft het type mutatie aan. Het aantal klonen met de aangegeven mutatie wordt rechts weergegeven. Dit is een voorbeeld van een polyacrylamidegel om DNA-mutaties te bepalen.

Grote deleties en heteroduplexbanden duiden op de aanwezigheid van DNA-mutaties in de doelsequenties. Zes van de 12 onafhankelijke gebeurtenissen werden gescoord als mutanten, zoals aangegeven door het delta-symbool. WT staat voor de wild-type controle en NT voor de controle zonder template.

Zodra de methode onder de knie is, kunnen er in één week tijd tientallen tot honderden CRISPR-vectoren worden geproduceerd en kunnen trendulate-groepmaterialen binnen enkele weken worden verkregen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle resterende Agrobacterium te verwijderen en de groei ervan te remmen. Overgroei van Agrobacterium zal het wortelmateriaal remmen en doden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe CRISPR-vectoren kunnen worden gegenereerd met behulp van DNA-assemblage, en hoe deze vectoren kunnen worden getest met behulp van een hairy root-model-systeem en tomaat.