Name: De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in E. coli Voor röntgenkristallografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer de productie en zuivering van het norovirus P-domein in E. coli voor röntgenkristallografie. Dit protocol levert hoogzuiver eiwit geschikt voor structurele en functionele studies van norovirus antigeniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor deze studie werd verstrekt door de CHS-stichting. Wij danken het platform voor eiwitkristallisatie binnen het uitmundigheidscluster CellNetworks van de Universiteit van Heidelberg voor het screenen van kristallen en de Europese Synchrotronstralingsfaciliteit voor het ter beschikking stellen van synchrotronstralingsfaciliteiten.

1. P Domain Klonen <ol><li> Bepaal de P-domein coderende gebied door middel van sequentie uitlijning van norovirus stammen (bijv GII.10 stam, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Bovendien verwijdert het flexibele gebied aan het C-uiteinde van het P-domein (Figuur 2A). Codon-geoptimaliseerd DNA voor E. coli expressie en omvatten BamHI (N-terminal) en Notl (C-terminal) restrictie sites om sub-kloon van de P-domein coderende gebied in de pMalc2x expressievector 6,7. Opmerking: De P-domein coderende gebied wordt geoptimaliseerd en gesynthetiseerd door een commerciële dienst. De P-domein coderende sequentie (insert) ongeveer 1 kb lang en geleverd met normale transfervector. </li><li> Digest 2 pg van de overdrachtsvector met elke 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C met fabrikant buffers. </li><li> Scheid de gedigereerde inzetstuk op een 1% agarosegelgedurende 20 minuten bij 135 V en zuivert het insert-DNA uit de gel met behulp van een commerciële kit. </li><li> Bereid de pMalc2x expressie vector door digestie 2 pg van deze vector met elk 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zuiver de vector uit een agarosegel zoals hierboven (1.3) beschreven. Opmerking: Beide monsters (1,2 en 1,4) kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Ligeren het gezuiverde insert in de gedigereerde vector pMalc2x de BamHI en NotI restrictieplaatsen met 1 pi T4-DNA-ligase (400.000 U / ml) gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) (figuur 2B en 2C). Gebruik minimaal 20 ng van de pMalc2x vector en een vector: insert verhouding 1: 3 (moleculair gewicht). Het ligatiemengsel is gewoonlijk ~ 20 pi. </li><li> Transformatie 2 ui van het ligatiemengsel in 50 ui chemisch competente E. coli DH5a bacteriecellen gebruik van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de getransformeerde cellen gedurende 3 min bij 1000 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 gl SOC medium. <ol><li> Plaat het transformatiemengsel op LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline voor selectie en gedurende de nacht groeien bij 37 ° C. Kies ten minste vijf kolonies. </li></ol></li><li> Voor elk van de vijf kolonies enten 2-3 ml kweek van LB-medium aangevuld met 50 ug / ml ampicilline (LB-Amp) en groeien door schudden gedurende de nacht bij 160 rpm bij 37 ° C. </li><li> Pak de plasmiden uit de kweek van een nacht met behulp van een commerciële kit. Controleer de aanwezigheid van de P-domein insert door sequentiebepaling met pMalc2x voorwaartse primer (5&#39;- TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) en omgekeerde primer (5&#39;- GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P Domain Expression <ol><li> Transformatie 1 pl (150 ng / ul - 400 ng / pl) van de pMalc2x vector codeert voor de MBP-His-P domeinfusie-eiwit in 50 pi competente E. coli BL21 cellen onder toepassing van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600 gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Subcultuur in 120 ml LB-amp nacht bij 160 rpm en 37 ° C. </li><li> Inoculeer negen liter (bijvoorbeeld 6 x 5 liter flessen met 1,5 liter medium elk) van LB-amp met de subcultuur (1: 100). Kweek de cellen onder schudden bij 160 rpm en 37 ° C totdat de OD600 0,4 bereikt - 0,6. Vervolgens laat de temperatuur tot 22 ° C gedurende ~ 1 uur en vervolgens het induceren van eiwitexpressie met 0,66 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. Groeien de cellen overnacht bij 22 ° C (~ 18 uur). Opmerking: De temperatuur kan worden gevarieerd, maar we raden aan 22 ° C of lager te gebruiken. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie (10.543 x g, 15 min, 4 ° C). Verwijder het supernatant en vries de celpellet bij -20 ° C. </li></ol>ste zuiveringsstap en Protease Cleavage <ol><li> Bereid buffers die worden gebruikt tijdens de eiwitzuivering stappen van voorraadoplossingen reproduceerbaarheid en stabiliteit van de experimenten te garanderen. Neem vier verschillende buffers voor de geïmmobiliseerde metaalion affiniteitschromatografie (IMAC), die elk een andere concentratie imidazool (10 mM, 20 mM, 50 mM en 250 mM). Voor de SEC, stelt een gelfiltratie buffer (GFB) met een hogere zoutconcentratie, maar zonder imidazool. Gebruik gedeïoniseerd water en filter alle buffers voor gebruik met een poriegrootte van 0,45 urn. Opmerking: Voor een gedetailleerde buffer voorbereiding regeling, zie tabel 1. </li><li> Ontdooi de celpellet van negen liter kweek en los op in 150 ml PBS bij 4 ° C. Ultrasone trillingen de celsuspensie drie keer gedurende 2 min (vermogen 130 W, 20% amplitude, pulsfrequentie 50%) om de cellen te verstoren. Houd de celsuspensie op ijs tijdens ultrasoonapparaat. </li><li> centrifugalege de gesoniceerde celsuspensie (43.667 x g, 30 min, 4 ° C) om celafval te scheiden van het supernatans dat tot expressie gebracht eiwit. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet. </li><li> Wassen en equilibreer 10 ml (= 1 kolomvolume [CV]) suspensie van Nikkel (Ni) NTA-agarose kralen met 10 mM imidazool buffer in een chromatografiekolom. Voeg de geëquilibreerde Ni kralen om de supernatant van stap 3,3 bevattende expressie MBP-His-P-domein fusie-eiwit en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder langzame rotatie. </li><li> Na incubatie toepassen gehele Ni-bead-eiwitmengsel een chromatografiekolom. Was de kolom langzaam bij elke 5 CVs 10 mM, 20 mM en 50 mM imidazool buffers, te beginnen met 10 mM, 20 mM en vervolgens laatste 50 mM (Figuur 3A). </li><li> Elueer het MBP-His-P domein fusieproteïne behulp 250 mM imidazool buffer (Figuur 3A). Tijdens elutie Controleer de OD 280 nm om de elutie van het fusie-eiwit (de toename van OD 28 verifiëren0nm). Ga door elutie totdat de OD 280 nm daalt tot ~ 0.1. Was de kralen met een gehalte van 250 mM imidazool buffer (minimaal 10 cv), gevolgd door ten minste 10 CV van 10 mM imidazool buffer. Sla de kralen voor de tweede zuiveringsstap (deel 4). </li><li> Controleer de aanwezigheid van MBP-His-P-domein fusie-eiwit met SDS-PAGE onder toepassing van een 12% SDS-polyacrylamide gel (10 x 8 cm) 9 (Figuur 3A). Voer gelelektroforese op 45 A en 200 V gedurende 45 minuten. </li><li> Concentraat (bijvoorbeeld met behulp van een commercieel concentrator) het geëlueerde MBP-His-P-domein fusie-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van ~ 3 mg / ml. Klieven MBP-His-P domein fusie met HRV-3C protease tijdens dialyse tegen 2 liter 10 mM imidazool buffer (~ 1: 100) gedurende de nacht bij 4 ° C (Figuur 3A). Afhankelijk van het eindvolume van geconcentreerde proteïneoplossing Voer dialyse in een dialyse cassette of dialyse tubing. Opmerking: De hoeveelheid HRV-3C protease voor eiwittensplitsing wordt berekend volgens de specifieke proteaseactiviteit (2 U / pl, 1 U volstaat aanhangende 100 ug eiwit) en de hoeveelheid geëlueerd fusie-eiwit dat varieert het expressieniveau en kan geschat worden uit de SDS-PAGE resultaat (3,7 ). </li></ol> 4. 2 nd zuiveringsstap <ol><li> Equilibreren de Ni-korrels uit stap 3.6 in 10 mM imidazool buffer. </li><li> Incubeer de gedialyseerde eiwit van stap 3,7 (bevattende gesplitst P-domein, MBP eiwit, en HRV-protease) met de geëquilibreerde Ni-parels (4,1) gedurende 30 min bij 4 ° C onder langzame rotatie. </li><li> Breng de Ni-kraal mengsel naar een kolom en verzamel het doorstroomkanaal (gesplitst P-domein) (figuur 3B). Meet de eiwitconcentratie zoals het komt uit de kolom totdat de OD 280nm ~ 0,1 bereikt. Opmerking: De MBP-His moet gebonden blijven aan de Ni-korrels (Figuur 3B). </li><li> Controleer de aanwezigheid van gesplitst P domein met behulp van SDS-PAGE met een 12% gel zoals hierboven (figuur 3B) beschreven. Concentreer het geëlueerde P domein ~ 3 mg / ml en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C tegen GFB voor daaropvolgende SEC zuivering. </li></ol> 5. 3 rd zuiveringsstap <ol><li> Was de pompen en leidingen van de HPLC zuivering systeem en pre-evenwicht van de SEC-kolom (zie Materials List) met GFB. </li><li> Injecteer de P-domein aan de kolom bij een debiet van 1 ml / min met behulp van een superloop (tot 12 ml) of lus (tot 3 ml), afhankelijk van het volume van de geconcentreerde monster. Nadat de injectie is voltooid, verhoging van de stroomsnelheid 2,5 ml / min. </li><li> Aangezien de OD toeneemt en de P domein loskomt van de kolom laat fracties van 1,5 ml. Raadpleeg fracties middels SDS-PAGE met 12% gel (figuur 4A en 4B). Pool alleen de zuiverste fracties en concentreer tot ~ 3 mg / ml en ~ 8 mg / ml. Let op: Na ~ 110 ml (void volume) de meeste onzuiverheden worden uitgewassen uit een SEC-kolom met 320 ml bed volume. DeP domein wordt gewoonlijk geëlueerd als een dimeer. Elutietijd / volume van de P domein dimeer is afhankelijk van de graad prep (pg) van de kolom SEC. </li></ol> 6. Kristallisatie van het P Domein <ol><li> Gebruik de P domein aan ~ 3 mg / ml en 8 mg / ml voor de initiële kristallisatie screening. Maak minstens 100 ul P domein per concentratie voor de eerste schermen met 384 in de handel verkrijgbare screening omstandigheden. Gevolgd door screening bij 18 ° C in een 96-well plaat formaat, waarbij het reservoir bevat 100 ul moederoplossing en een druppel uit 0,2 pi moederoplossing en 0,2 ul eiwit. </li><li> Herhaal en optimaliseren succesvolle kristallisatie omstandigheden. Gebruik daarom 15-well platen die 3 rijen bevatten. Het opzetten van de eerste rij met 100% moeder oplossing, de tweede rij met 90% moeder-oplossing en 10% water, en de derde rij met 80% moeder-oplossing en 20% water. Gebruik een druppelgrootte van 2 pl (1 ul eiwit + 1 gl moederoplossing) en 50081; l van de moeder oplossing als reservoir volume. </li><li> Gebruik geoptimaliseerd kristal voorwaarden voor co-kristalliseren van het P domein liganden. Bereid platen zoals beschreven in 6.2. In plaats van 2 pl druppelgrootte ingestelde druppels bevattende 1 pi moederoplossing, 1 ul eiwit, en 1 ul van ligand bij een concentratie van 1 mg / ml. </li><li> Verzamel data sets van enkele kristallen met behulp van synchrotronstraling. Voer moleculaire vervanging met behulp van gepubliceerde P-domein structuren met een hoge sequentie-overeenkomst als initiële zoekopdracht model 6,10-13. Opmerking: De aanwezigheid van een ligand te zien als-un gemodelleerd blob van elektronendichtheid. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een protocol voor de expressie en zuivering van norovirus P domeinen in hoge kwaliteit en kwantiteit. Norovirussen zijn niet goed bestudeerd en structurele gegevens worden voortdurend nodig. Voor zover wij weten, heeft P domein productie met behulp van andere protocollen (bv-GST gelabeld P domeinen) problematisch geweest, tot nu toe, en voldoende structurele gegevens over norovirus-gastheer interactie hebt gemist. Met de hier beschreven methode, hebben we onlangs aanzienlijk bijgedragen aan ...

Human noroviruses zijn de belangrijkste oorzaak van acute gastro-enteritis in de wereld 1. Deze virussen behoren tot de familie Caliciviridae, waarvan er ten minste vijf geslachten, met inbegrip van Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus en Nebovirus. Ondanks hun grote impact op de gezondheidszorg en de brede verspreiding, is de studie van de menselijke norovirussen gehinderd door het ontbreken van een robuust celcultuur systeem. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of antivirale strategieën beschikbaar. Norovirus belangrijkste capside eiwit VP1 genoemd, kan worden verdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein 2. De P-domein is verbonden met het S domein een flexibel scharnier (H) gebied. De S-domein vormt een steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormt de buitenste deel van het virale capside. P domein verzamelt in biologisch relevante dimeren bij expressie in bacteriën. De Pdimer interageert met koolhydraten structuren, genaamd histo-bloedgroep antigenen (HBGAs), die aanwezig is als oplosbare antigenen in het speeksel en te vinden op bepaalde gastheercellen 3 zijn. De P-domein HBGA interactie gedacht belangrijk voor infectie 4 te zijn. Inderdaad, een recent rapport bleek het belang van synthetische HBGAs of HBGA expressie bacteriën voor menselijke norovirus infectie in vitro 5. Huidige studies over de gastheercel hechting van noroviruses hoofdzakelijk uitgevoerd met virusachtige deeltjes (VLP&#39;s) die kunnen worden uitgedrukt in insectencellen of recombinant P-domeinen tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli). Om de P-domein-HBGA interacties op atomaire resolutie te begrijpen, kan P domein HBGA complexe structuren worden opgelost met behulp van X-ray kristallografie. We beschrijven hier een protocol P domein expressie en zuivering waarmee de productie van P-domein in hoge hoeveelheid en kwaliteit te gebruiken voor X-ray CrystallOGRAFIE. Bovendien kan deze methode worden toegepast voor andere calicivirus P domeinen en niet-structurele proteïnen. De P domein codon-geoptimaliseerd voor E. coli expressie en gekloond in een standaard overdracht vector. De P domein wordt vervolgens opnieuw gekloneerd in een expressievector die een polyhistidine (His) tag en een mannose-bindend eiwit (MBP) die gevolgd worden door een protease-splitsingsplaats codeert. De MBP-His-P domein fusieproteïne wordt tot expressie gebracht in E. coli, gevolgd door drie zuiveringsstappen. De MBP-His-P-domein fusieproteïne gezuiverd met geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC). Vervolgens wordt het fusie-eiwit geknipt met humaan rhinovirus (HRV) -3C protease en de P-domein wordt van het MBP-His met een extra IMAC zuiveringsstap. Tenslotte wordt de P domein gezuiverd met size exclusion chromatografie (SEC). Het gezuiverde P domein kan dan worden gebruikt voor röntgenkristallografie. Screening van eiwit kristallisatie voorwaarden performed met commercieel verkrijgbare screening kits met behulp van verschillende P-domein eiwit concentraties. Kristalgroei wordt waargenomen en de meest veelbelovende omstandigheden worden geoptimaliseerd. Met de hier beschreven methoden, is het mogelijk om van gen eiwit te structureren in minder dan vier weken. Daarom is onze werkwijze P domein expressie, zuivering en kristallisatie geschikt norovirus-gastheer interacties op moleculair niveau verschaffen belangrijke gegevens helpt bij up-to-date vaccinontwerp en drug discovery.

<table><tbody><tr><td>P domein DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthese</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; vector</td><td>Op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatografie Kolom</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 cm, mogelijk om andere grootte te gebruiken</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>various</td><td>cutoff van 10 kDa, 30 kDa en 50 kDa gebruikt</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competente Cellen</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemisch Competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC kolom</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>various</td><td>4 screens met elk 96 putjes</td></tr><tr><td>Koolhydraten</td><td>Dextra Laboratories, UK</td><td>various</td><td>Bloedgroep producten</td></tr></tbody></table>

de productie van de mens norovirus uitstekende domeinen in<em&gt; e. coli</em&gt; voor röntgenkristallografie

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Norovirus capside is samengesteld uit een enkele belangrijke structurele eiwit VP1 genoemd. VP1 is onderverdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein. De S-domein vormt een aaneengesloten steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormen virale spikes op de S domein en bevat determinanten voor antigeniciteit en gastheer-cel interacties. De P-domein bindt koolhydraatstructuren, dwz., Histo-bloedgroep antigenen, die vermoedelijk belangrijk norovirus infecties. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het produceren van hoogwaardige norovirus P domeinen in hoge opbrengsten. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden gebruikt voor röntgenkristallografie en ELISA om antigeniciteit en gastheer-cel interacties te bestuderen. De P domein wordt eerst gekloneerd in een expressievector en tot expressie gebracht in bacteriën. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van drie stappen die gepaard geïmmobiliseerde metaalion-affiniteitschromatografie en gelpermeatiechromatografie. Inprincipe is het mogelijk om te klonen, express, zuiveren en kristalliseren eiwitten in minder dan vier weken, die dit protocol een snel systeem voor het analyseren van opkomende norovirus stammen maakt.

Het schema van de beschreven protocol is in Figuur 1. Het protocol omvat 6 belangrijke delen die klonering van het doelwitgen, expressie, een drie-staps zuivering en kristallisatie omvatten. Figuur 2 illustreert het ontwerp van het expressieconstruct (EC) en kenmerken van de pMalc2x expressievector. De volgorde van de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de pMalc2x vector toont restrictie en protease splitsingsplaatsen. Figuur 3 toont ...

Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em&gt; E. coli</em&gt; Voor röntgenkristallografie

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Het algemene doel van het protocol is de productie en zuivering van het uitstekende domein van het menselijk norovirus in E.coli om extreem zuiver eiwit te verkrijgen voor röntgendiffractie. Ons protocol voor eiwitexpressie, zuivering en kristallisatie is snel, robuust en kan worden gebruikt voor structurele en niet-structurele eiwitten. Het voordeel van dit protocol is dat onze eiwitten zeer zuiver zijn en kristallen kunnen vormen die diffractie tot een hoge resolutie vertonen.Op basis van onze ervaring kan het protocol mogelijk worden aangepast voor minder oplosbare eiwitten. Zo kunnen het groeimedium of de groeitemperatuur tijdens de eiwitexpressie worden gewijzigd. Begin met het transformeren van één µL van de pMalc2x-vector, die codeert voor het MBP-His-P-domeinfusie-eiwit, in 15 µL competente E.coli BL21-cellen met behulp van een standaard transformatieprotocol.Voeg 600 µL SOC-medium toe aan de cellen. Laat deze gedurende één uur groeien bij 37 °C. Subcultiveer de getransformeerde cellen overnacht in 120 mL LB-ampicilline bij 160 rpm en 37 °C.Inoculeer negen liter LB-ampicilline met de subcultuur. Kweek de cellen in de incubator bij 37 °C met een schudspeed van 160 rpm tot de optische dichtheid bij 600 nm een waarde van 0,4 tot 0,6 bereikt. Verlaag vervolgens de temperatuur gedurende ongeveer één uur naar 22 °C.Het is belangrijk om te wachten tot de temperatuur 22 °C bereikt voordat er met een lage hoeveelheid IPTG wordt geïnduceerd om oplosbare proteïne-expressie mogelijk te maken. Induceer de proteïne-expressie met 0,66 millimolar IPTG. Kweek de cellen na inductie gedurende de nacht bij 22 °C.Oogst de cellen door middel van centrifugatie. Verwijder het supernatant en vries de celpellet in bij -20 °C. Bereid de buffers die worden gebruikt voor de eiwitzuiveringsstappen uit stokoplossingen zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Ontdooi het celpellet van de cultuur van negen liter en los dit op in 150 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing bij vier graden Celsius. Soniciseer de celsuspensie drie keer gedurende twee minuten om de cellen te lyseren. Centrifugeer de gesoniciseerde celsuspensie om celresten te scheiden van het supernatant dat het tot expressie gebrachte MBP-His-P domein-fusieprotein bevat.Verzamel de supernatant en gooi het pellet weg. Was en equilibreer een slurry van 10 milliliter nikkel-NTA agarose beads met 10 millimolar imidazolbuffer in een chromatografiekolom. Voeg de geequilibreerde nikkelbeads toe aan de supernatant die het tot expressie gebrachte MBP-His-P domein fusie-eiwit bevat en incubeer dit gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius onder langzame rotatie.Breng na incubatie het volledige mengsel van nikkelbeads en eiwit aan op een chromatografiekolom. Was de kolom langzaam met telkens vijf CV's van 10 millimolair, 20 millimolair en 50 millimolair imidazolbuffer bij vier graden Celsius. Elueer het MBP-His-P-domeinfusie-eiwit met 250 millimolair imidazolbuffer bij vier graden Celsius.Controleer tijdens de elutie de optische dichtheid bij 280 nanometer om de elutie van het fusie-eiwit te verifiëren. Ga door met de elutie totdat de optische dichtheid bij 280 nanometer daalt tot ongeveer 0,1. Was de beads bij vier graden Celsius met een overmaat aan 250 millimol imidazolbuffer, gevolgd door 10 millimol imidazolbuffer.Bewaar de beads voor de tweede zuiveringsstap. Verifieer de aanwezigheid van het MBP-His-P domein-fusie-eiwit met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, of SDS-PAGE, met gebruik van een 12% SDS-polyacrylamidegel. Concentreer vervolgens het geëlueerde MBP-His-P domein-fusie-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer drie mg/mL.De hoeveelheid protease die nodig is om het MBP-His-P-domein effectief te splitsen, moet zorgvuldig worden berekend. Dit is afhankelijk van de totale hoeveelheid geëlueerd fusie-eiwit en van het SDS-PAGE-resultaat. Splits het MBP-His-P-domeinfusie-eiwit met HRV 3C-protease tijdens dialyse tegen twee liter 10 millimolair imidazolbuffer gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Afhankelijk van het uiteindelijke volume van het geconcentreerde eiwit, wordt de dialyse uitgevoerd in een dialyse cassette of dialysebuisjes. Equilibreer de apart gezette nikkelbeads in 10 millilmolar imidazolbuffer. Incubeer het gedialyseerde eiwit dat het afgesplitste P-domein, MBP-eiwit en HRV-protease bevat gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met langzame rotatie samen met de geéquilibreerde nikkelbeads.Breng het mengsel met nikkelkraaltjes aan op een kolom en vang de doorstroom op bij vier graden Celsius. Dit is het gesplitste P-domein. Meet de eiwitconcentratie terwijl deze van de kolom komt, totdat de optische dichtheid bij 280 nanometer ongeveer 0,1 bereikt.Het MBP-His moet gebonden blijven aan de nikkelbeads en het afgesplitste P-domein wordt geëlueerd in de doorstroomfractie. Controleer de aanwezigheid van het afgesplitste P-domein met SDS-PAGE met een 12%gel zoals voorheen. Nadat het geëlueerde P-domein is geconcentreerd tot ongeveer drie milligram per milliliter, wordt dit gedialyseerd gedurende de nacht bij vier graden Celsius tegen gelfiltratiebuffer voor daaropvolgende zuivering via grootte-uitsluitingschromatografie.Spoel de pompen en leidingen van het HPLC-zuiveringssysteem (high performance liquid chromatography) door en pre-equilibreer de size-exclusion chromatografiekolom met gelfiltratiebuffer. Injecteer het P-domein op de kolom met een stroomsnelheid van 1 mL per minuut, gebruikmakend van een superloop of loop, afhankelijk van het volume van het geconcentreerde monster. Verhoog na voltooiing van de injectie de stroomsnelheid naar 2,5 mL per minuut.Terwijl de optische dichtheid toeneemt en het P-domein van de kolom elueert, worden fracties van 1,5 milliliters verzameld. Het P-domein elueert gewoonlijk als een dimeer. Na controle van de fracties via SDS-PAGE met een 12%gel, worden alleen de zuiverste fracties samengevoegd en geconcentreerd tot ongeveer drie milligram per milliliter en ongeveer acht milligram per milliliter.Gebruik het P-domein bij ongeveer drie milligram per milliliter en acht milligram per milliliter voor de initiële crystallisatiescreening. Bereid ten minste 100 microliters P-domein per concentratie voor de initiële screens met 384 commercieel beschikbare screeningcondities. Voer de screening uit bij 18 graden Celsius in een 96-wells plaatformaat waarbij het reservoir 100 microliters moederoplossing bevat en een druppel bestaat uit 0,2 microliters moederoplossing en 0,2 microliters eiwit.Optimaliseer de succesvolle crystallisatiecondities met behulp van 15-wells platen die drie rijen bevatten. Gebruik 500 microliters moederloog als reservoirvolume. Stel de eerste rij in met 100% moederloog.De tweede rij bevat 90% moedersolution en 10% water. De derde rij bevat 80% moedersolution en 20% water. Stel de hanging drop op met een druppelgrootte van twee microliters door een gelijk volume eiwit en moedersolution te mengen.Gebruik de geoptimaliseerde kristallisatiecondities voor de co-kristallisatie van het P-domein met liganden. Bereid de platen zoals voorheen, maar stel in plaats van een druppelgrootte van twee microliter druppels samen met één microliter moedersolution, één microliter eiwit en één microliter ligand bij een concentratie van één milligram per milliliter. Hier wordt een representatief SDS-PAGE resultaat getoond, waarin de hoeveelheid geëlueerd MBP-His-P-domein fusie-eiwit na de eerste zuiveringsstap zichtbaar is, waarbij het MBP-His-P-domein fusie-eiwit is gezuiverd met behulp van nikkel-NTA agarose beads.Na scheiding van het MBP-His van het gesplitste P-domein wordt de hoeveelheid geëlueerd gesplitst P-domein eveneens geanalyseerd met SDS-PAGE. Na de laatste zuiveringsstap met grootte-uitsluitingschromatografie leidde kristalscreening tot geoptimaliseerde kristalcondities. Hier wordt het diffractiepatroon van een uitstekend domein getoond.In principe is het mogelijk om proteïnen in minder dan vier weken te klonen, te tot expressie te brengen, te zuiveren en te kristalliseren, wat dit protocol een snel systeem maakt voor het analyseren van nieuw opkomende norovirusstammen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat kwaliteit belangrijker is dan kwantiteit. Dankzij de hoge kwaliteit van de gezuiverde P-domeinen zijn aanvullende studies geschikt, waaronder immunisatie voor antilichaamproductie, NMR-experimenten en ELISA-gebaseerde studies.Bovendien kan het gezuiverde P-domein worden gebruikt voor complexvorming met antilichaamfragmenten en nanobodies. Na het bekijken van dit protocol zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hoogwaardige norovirus P-domeinen kunt tot expressie brengen en zuiveren.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Source: Leuthold, M. M., et al. Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the purification of recombinant human norovirus P domain using size exclusion chromatography, highlighting the separation of the target protein from higher and lower molecular weight impurities based on differential pore accessibility. The process is monitored by UV absorbance and confirmed through SDS-PAGE analysis of eluted...

Purification of Bacteria-Derived Recombinant P Domain Proteins of Human Norovirus

This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Leer de productie en zuivering van het norovirus P-domein in E. coli voor röntgenkristallografie. Dit protocol levert hoogzuiver eiwit geschikt voor structurele en functionele studies van norovirus antigeniteit.

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in

Meer video's verkennen