Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Het algemene doel van deze procedures is om snel hoog gezuiverde neutrofielen te isoleren uit menselijke bloedmonsters door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor kankertherapie te onderzoeken met behulp van twee D en drie D celkweekmodellen. Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de interacties tussen het aangeboren immuunsysteem en kanker, zoals welke rol een neutrofielengemedieerde tumorcelrespons speelt bij kankertherapie. Het belangrijkste voordeel van dichtheidsgradiëntscheiding is de mogelijkheid om pure immuuncelpopulaties in een korte periode te isoleren zonder de cellen bloot te stellen aan functie-veranderende stimuli.

Om de primaire leukemiecellen en neutrofielen te isoleren, begint u door 15 milliliter EDTA-behandeld bloed van chronische lymfatische leukemiepatiëntmonsters toe te voegen aan individuele, steriele 50 milliliter buizen. Verdun het bloed met 15 milliliter RPMI. Voeg vervolgens voorzichtig en langzaam 15 milliliter kamertemperatuur dichtheidsgradiëntoplossing onder het bloed toe, zorg ervoor dat de lagen niet worden gemengd.

Na het scheiden van de cellen door centrifugatie, zullen vier verschillende fasen zichtbaar zijn. De bloedplaatjes en plasma bovenaan, een witte ring van mononucleaire cellen, de dichtheidsgradiëntoplossing en de granulocyten en erytrocyten onderaan. Gebruik een plastic weidepijp om eerst de witte ring van primaire leukemiecellen in een nieuwe 50 milliliter buis over te brengen.

Was de cellen met maximaal 50 milliliter PBS met calcium en magnesium. En re-suspendeer het palet in vijf milliliter vers PBS. Voeg vervolgens 45 milliliter meer PBS toe aan de cellen en centrifugeer de cellen opnieuw.

Na de tweede wasbeurt re-suspendeer het palet in volledig RPMI-medium. En tel het aantal levensvatbare primaire leukemiecellen. Vervolgens verwijdert u het bloedplaatjesplasma en de dichtheidsgradiëntlagen en voegt u 25 milliliter PBS en 25 milliliter Dextrin in natriumchloride toe aan de granulociete erytrocyt fase.

Meng de buizen tien keer door inversie. Laat vervolgens de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bezinken. Aan het einde van de gelijkmaking, brengt u de bovenste rode bloedcelarme neutrofielenlaag over in een steriele 50 milliliter buis en centrifugeer de cellen opnieuw.

Resuspendeer het palet in vijf milliliter PBS en lyseer de rode bloedcellen met 45 milliliter rode cel lysisbuffer. Na 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur, centrifugeer de cellen opnieuw en was het palet in 50 milliliter PBS. Aan het einde van de wasbeurt, re-suspendeer de cellen in het volledige RPMI-medium en tel het aantal levensvatbare neutrofielen.

Verdun beide groepen cellen tot een concentratie van 300.000 cellen per 50 microliters RPMI en verdeel de monsters over het juiste aantal vijf milliliter faxbuisjes. Na centrifugatie, resuspendeer de pellets in 50 microliters PBS aangevuld met FBS. Om de zuiverheid van de geïsoleerde celsubpopulaties te bepalen, labelt u het aliquont van primaire leukemiecellen met anti-humanCD19 antilichaam geconjugeerd aan APC en het aliquont van de gezuiverde neutrofielen met een mengsel van anti-human antilichamen zoals vermeld in de tabel gedurende 30 minuten in het donker bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen in 500 microliters FBS-aangesteld PBS en resuspendeer de palets in 200 microliters vers FBS PBS. Analyseer vervolgens de zuiverheid van de celpopulaties door middel van flowcytometrie, waarbij u de monsters zorgvuldig kleurcompenseerd. Om de primaire leukemiecellen te co-cultiveren met de autoloog neutrofielen, zie 200.000 cellen per milliliter leukemiecellen alleen of met autoloog neutrofielen in een 24-putsplaat in compleet RPMI-medium.

Meng de cellen voorzichtig. Behandel vervolgens de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2 met Brutton's Tyrosine Kinase Inhibitor. De volgende dag verzamelt u een aliquont van de cellen in een vijf milliliter plastic faxbuis.

Spin vervolgens de cellen neer en was de pellets in één milliliter FBS PBS. Na de tweede centrifugatie, labelt u de cellen aninexine vijf en propidiumjodide volgens de instructies van de fabrikant gedurende tien minuten bij kamertemperatuur in het donker. Analyseer vervolgens de neutrofielen en primaire leukemiecellen door middel van flowcytometrie met behulp van de geïllustreerde gatingstrategie.

Om een drie D co-cultuur op te zetten, voegt u 50.000 RL lymfoomb-cellen toe of mengt u deze met HL60 gedifferentieerde cellen in steriele 15 milliliterbuisjes. Centrifugeert u de monsters neer en resuspendeert u de pellets in 300 microliters basement membraanmatrix, met behulp van een pipettip van één millimeter waarvan de opening is afgesneden tot twee tot drie millimeter. Incubeer vervolgens 300 microliters van de cellen in elk putje van een 24-putsplaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2.

Aan het einde van de incubatie, voegt u één milliliter compleet RPMI-medium toe aan elk putje en brengt u de drieD-culturen terug naar de incubator voor nog eens zeven dagen met mediumverversingen om de twee dagen. Op dag vijf, voegt u tien nanomolar incristine toe aan de culturen. Na een week van cultivering, aspireert u het medium en was elk putje twee keer met één milliliter ijskoud PBS.

Voeg vervolgens drie milliliter ijskoud PBS met EDTA toe aan elk putje en schraap de bodem van de putjes met een 200 microliter pipettip om de gels los te maken. Schud de plaat zachtjes op ijs gedurende 30 minuten. Breng vervolgens de celsuspensies over naar individuele steriele 15 milliliterbuisjes voor zachtjes schudden op ijs gedurende nog eens 30 minuten.

Bevestig de verschijning van een homogene celsuspensie. Spin vervolgens de cellen neer, gevolgd door een PBS-was en resuspendeer de pellets in vers PBS met FBS. Label ten slotte de cellen met de juiste antilichamen en levensvatbaarheidskleurstoffen zoals zojuist is aangetoond en analyseer de RL en HL