Name: Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Leer neutrofielen isoleren uit menselijk bloed via dichtheidsgradiëntcentrifugatie om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor kankertherapie te onderzoeken. Deze methode maakt zuivere immuuncelpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Institut National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. neutrofielen Isolatie en co-cultuur met primaire leukemische cellen OPMERKING: Procedures werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van Lyon Hospital ethische commissie met alle patiënten ondertekenen informed consent. <ol><li> Isolatie van primaire leukemische cellen en neutrofielen <ol><li> Verzamel buizen perifeer bloed op EDTA (1,8 mg EDTA per milliliter bloed) uit patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL). </li><li> Voeg elk 15 ml bloed naar een steriele 50 ml buis en verdun met 15 ml RPMI (verdunning 1: 1), vervolgens voorzichtig en langzaam voeg 15 ml dichtheidsgradiënt oplossing naar de bodem van de buis zonder mengen van de fasen. Waarborgen dat de dichtheidsgradiënt oplossing bij kamertemperatuur voor het bereiden. </li><li> Centrifugeren bij 300 g gedurende 35 min bij kamertemperatuur en zonder rem. Laat het bloed te scheiden in vier afzonderlijke fasen zoals getoond in figuur 1A, van boven naar beneden: bloedplaatjes en plasma, mononucleaire cellen (white ring), dichtheidsgradiënt oplossing, granulocyten en erytrocyten. </li><li> Verzamel de witte ring die de primaire leukemische cellen met een plastic Pasteur pipet overgebracht naar een nieuwe 50 ml buis vertegenwoordigt. <ol><li> De buis met PBS (bevat calcium en magnesium) tot 50 ml in totaal en centrifugeer bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet met 5 ml PBS PBS vervolgens oplopen tot 50 ml in totaal en centrifugeer bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet met volledig RPMI medium (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine) voor het tellen gebruik cellevensvatbaarheid teller. </li></ol></li><li> Zuig het bovenste fasen laat de granulocyten en erytrocyten fase en oplopen tot 25 ml PBS voeg 3% dextraan in 0,9% NaClup tot 50 ml in totaal. Meng de buizen 10 keer en houd ze gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder mengen. </li><li> Verzamel de bovenste RBC-arme neutrofielen laag eend ze te plaatsen in een schone steriele 50 ml buis en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer elk pellet met 5 ml PBS voeg red cell lysis buffer tot 50 ml in totaal. </li><li> Houd de buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de pellets met PBS (PBS oplopen tot 50 ml in totaal) en centrifugeer bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellets met volledig RPMI medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller. Blijf 3 x 10 5 van elk celtype in 50 pi PBS-FBS (4%) in 5 ml plastic buizen om de zuiverheid van de isolatie met flowcytometrie bepaald. </li></ol></li><li> Analyseer de morfologische Optredens van de geïsoleerde cel Populaties <ol><li> Hiertoe resuspendeer elk 3 x 10 4 neutrofielen en 3 x 10 4 mononucleaire cellen in 150 ul volledig RPMI medium. Monteer de glasplaatjes, filter kaarten en monster kamers in de cytospin centrifuge, ervoor te zorgen dat tHij centrifuge is goed in balans. </li><li> Plaats elk celtype monsterkamer en cyto-centrifuge bij 750 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur Verwijder de glijbanen, filterkaarten en monsterkamers uit de centrifuge. Demonteren voorzichtig om te voorkomen dat de cellen beschadigen de dia. Gooi filter kaarten en monster kamers. </li><li> Vlekken op de cellen met behulp van Giemsa kleuring kit en houd de dia&#39;s voor 1 uur drogen. Onderzoek de cellen door microscoop met 100X vergroting. </li></ol></li><li> Test de zuiverheid van de geïsoleerde cellen door FACS <ol><li> Label de geïsoleerde primaire leukemische cellen met anti-humaan CD19 antilichaam geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Label de gezuiverde neutrofielen met mengsel van anti-humane antilichamen in tabel 1 (5 ul / 10 6 cellen) genoemd. Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C </li><li> Was de cellen met 500 pi PBS-FBS (4%) van de centrifuge de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li>Resuspendeer elk pellet in 200 pl PBS-FBS (4%). </li><li> Analyseren op een flowcytometer met behulp van de volgende optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (BP 575/26); 633 nm laser: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Zorg ervoor dat de kleur compensatie. </li></ol></li><li> Co-kweek van primaire leukemische cellen met autologe neutrofielen <ol><li> Zaad 2 x 10 5 cellen / ml alleen of met autologe neutrofielen tot 1:10 in volledig RPMI medium primaire leukemische cellen. Hiervoor celaantallen aanpassen door verdunnen celsuspensies en voeg 2 x 10 5 cellen / ml primair leukemische cellen tot 2 x 10 6 cellen / ml neutrofielen. Meng voorzichtig. </li><li> Voeg 25 uM Bruton&#39;s tyrosinekinase (Btk) remmer (ibrutinib) aan de cellen. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li><li> Cell Harvest en FACS-analyse <ol><li> Collect de cellen in 5 ml plastic buizen voor FACS-analyse en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de korrels met 1 ml PBS-FBS (4%) en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer pellets in Annexine V en PI behulp van commerciële kit en incubeer de cellen in donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Analyseren op een flowcytometer met de gating strategie van figuur 2A en de hieronder weergegeven optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI (610 / 20 BP). Zorg ervoor dat de kleur compensatie. </li></ol></li></ol> 2. Differentiatie van HL60 cellen langs de granulocytaire Pathway en hun Coculture met RL lymfoom B-cellen in 3D Model <ol><li> Differentiatie van Human Promyelocytic (HL60) cellen in neutrofielen-achtige cellen <ol><li> Pas HL60 celaantal tot 3 x 10 5 cellen / ml voeg 1 uM retinoïnezuur (RA) en 1,25% DMSO hun differentiatie induceren. Zaad elk 3 x 10 5 </sup&gt; HL60 cellen per putje in 48-well plaat vervolgens incubeer 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Later, het verzamelen van de cellen en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen met volledige RPMI-medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller. </li><li> Verdun cel suspensie in volledig RPMI medium om HL60 aantal cellen aan te passen aan 3 x 10 5 cellen / ml en induceren weer hun differentiatie door toevoeging van 1 uM retinoïnezuur (RA) en 1,25% DMSO. Zaad elk 3 x 10 5 HL60 cellen per putje in 48-well plaat en incubeer nog 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li><li> Analyse van HL60 differentiatie (HL60 diff) <ol><li> Verzamel de cellen en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met volledig RPMI medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller. </li><li> De veranderingen in celoppervlak markers expressie door flow cytometry analyse. Plaats elke 3 x 10 5 </sup&gt; ongedifferentieerde HL60 cellen (van celkweek) en 3 x 10 5 diff HL60 cellen in 5 ml plastic buizen voor FACS-analyse en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellets in 50 ul PBS-FBS (4%). Label de cellen met anti-humaan CD 11 geconjugeerd aan AF700 of anti-humaan CD38 geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C </li><li> Wassen met 500 pi PBS-FBS (4%) en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellets in 200 gl PBS-FBS (4%). </li><li> Analyseren op flowcytometer met de gating strategie van figuur 3A en de hieronder weergegeven optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (BP 660/20), Alexa Fluor 700 (BP 730/45). </li><li> Om de morfologische veranderingen in HL60 diff te testen, te immobiliseren van de cellen op glas dia&#39;s voor microscopisch onderzoek. <ol><li> Om dit te doen, resuspendeer elk 3 x 10 <sup&gt; 4 ongedifferentieerde HL60 cellen (van celkweek) en 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ul volledig RPMI medium. Monteer de glasplaatjes, filter kaarten en monster kamers in de cytospin centrifuge, ervoor te zorgen dat de centrifuge in balans is. </li><li> Plaats elk celtype monsterkamer en cyto-centrifuge bij 1500 rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de dia&#39;s, filter kaarten en monster kamers uit de centrifuge. Demonteren voorzichtig om te voorkomen dat de cellen beschadigen de dia. Gooi filter kaarten en monster kamers. </li><li> Vlekken op de cellen met behulp van Giemsa kleuring kit en houd de dia&#39;s voor 1 uur drogen. Onderzoek de cellen door microscoop met 100X vergroting. </li></ol></li></ol></li><li> 3-dimensionale (3D) cultuur LET OP: Zorg ervoor dat de in dit experiment gebruikte materialen zijn koud en het experiment vindt plaats op ijs. <ol><li> Resuspendeer elk 5 x 10 4 cellen RL, hetzij alleen of gemengd met HL60 diff </em&gt; In verhouding RL: HL60 diff 01:10, met 300 gl basaalmembraan matrix middels 1 ml pipetpunt gesneden met een steriele schaar om de opening 2 tot 3 mm verbreden. Vermijd bellen tijdens deze stap. </li><li> Zaad elk 300 pi celsuspensie / putje in 24-well plaat. Vermijd bellen tijdens deze stap. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2 voeg 1 ml compleet RPMI-medium per putje en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C met 5% CO2. Verander het medium elke twee dagen. Voeg 10 nM vincristine op dag 5. </li></ol></li><li> FACS-analyse <ol><li> Na 7 dagen van de cultuur, zuig het medium en was elk putje met 1 ml ijskoude PBS twee keer. Voeg 3 ml / putje ijskoude PBS-EDTA (5 mM). Maak de gel uit de bodem van de put door schrapen met de bodem van 200 ul pipetpunt. Schud de plaat voorzichtig op ijs gedurende 30 min. </li><li> Transfer celsuspensie in steriele 15 ml buis en schud de buizen zachtjes op ice nog eens 30 min. Controleer voor het verschijnen van homogene celsuspensie. (Als het niet het geval is, dan schud de cellen voor langere tijd of voeg meer PBS-EDTA). </li><li> Centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de pellets met PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer met PBS-FBS (4%) en label met anti-humaan CD19 antilichaam geconjugeerd aan PE-Cy7 en anti-humaan CD38 antilichaam geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C </li><li> Wassen met 500 pi PBS-FBS (4%) dan centrifugebuizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen met annexine V en PI via commerciële kit. </li><li> Analyseer op flowcytometer met behulp van de gating strategie van figuur 4A en de volgende optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm laser: APC (BP 660/20). Zorg ervoor dat de kleur compensatie. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem.+Z.+F%C3%BCrKlin.+Chem.+Klin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li>
<li>Aynaud, M. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li>
<li>Ziòłkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li>
<li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li>
<li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc%CE%B3RIIIB+and+Mac-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Baltim.Md+1950%22%5BJournal%5D)">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li>
<li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606(2012).</li>
<li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advance%3A+autofluorescence-based+sorting%3A+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586(2013).</li>
<li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li>
<li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22ActaHaematol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li>
<li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li>
<li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%3A+Their+contributions+to+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li>
<li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+Neutrophils%2C+and+Cancer%3A+A+Double+Edged+Sword%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940(2014).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li>
<li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment%3A+role+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res+Off+J+Am+Assoc+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li>
<li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer+Oxf.Engl+1990%22%5BJournal%5D)">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschreven een effectieve, eenvoudige, snelle en goedkope protocol voor de isolatie van neutrofielen uit humaan bloed met hoge zuiverheid via dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering en in dezelfde stap mononucleaire cellen worden ook afgescheiden en gewonnen. De geïsoleerde celpopulaties zijn ≥90% zuiver. Verscheidene werkwijzen zijn beschikbaar voor neutrofielen isolatie uit humaan bloed. Deze omvatten dergelijke wijze met behulp van discontinue gradiënten 11,12 of via c...

Aangeboren immuuncellen een essentieel deel van de cellen in de tumor micro-omgeving en zijn geassocieerd met tumor maligniteit bij patiënten en diermodellen van kanker 1. Onlangs is het uitgegroeid tot meer alom gewaardeerd dat chronische immuunrespons spelen cruciale rol bij het ​​bevorderen van progressie van de tumor, metastase en weerstand tegen chemokuren 2. Macrofagen zijn belangrijke aangeboren immuuncellen die zijn aangetoond om rechtstreeks de tumorcel respons op chemotherapie 3,4. Echter, de rol van neutrofielen, belangrijke spelers in het aangeboren immuunsysteem bij de regulering van tumor-respons op de behandeling tegen kanker niet bekend. Het doel van deze protocollen is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen uit bloedmonsters CLL patiënt scheiden en HL60 cellen differentiëren langs de granulocyten route om de rol te bestuderen in het reguleren van de gevoeligheid van de lymfoomcellen anti-lymfoom middelen. 5 en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen 6. Neutrofielen een essentiële rol bij stijgende aangeboren immuun responsen naast variabele effectorfuncties in verschillende pathologische aandoeningen 7. Daarom is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen van andere bloedcellen zoals dichtheidsgradiënt scheidingsmethode isoleren vereist voor in vitro studies. Deze methode voor neutrofielen isolatie verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunologische functies in vivo en ex vivo vergemakkelijken. Het vermogen om zuivere populaties van neutrofielen te verkrijgen is een belangrijke eerste stap bij het ​​onderzoek naar patiënten met immuunziekten 8. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze een ideale techniek waarbij een hoge opbrengst aan cellen is verkregen. de method bij de bereiding dichtheidsgradiënt oplossing in de bodem van een buis met verdunde humaan bloed gevolgd door centrifugatie bij 300 g gedurende 35 min zonder onderbreking. De ring van de mononucleaire cellen wordt in de interface en de neutrofielen bevinden onder het eerste. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van andere beschikbare werkwijzen zoals neutrofielen isolatie kits die veel duurder zijn 9. Bovendien isoleren neutrofielen uit menselijk bloed door commerciële kits behulp van antilichamen gericht op een oppervlak marker specifiek is voor humane neutrofielen, het risico van celactivering en differentiatie. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze maakt de isolatie van neutrofielen binnen een korte tijd. In dezelfde stap worden mononucleaire cellen ook afgescheiden en gewonnen. Het is een fundamentele techniek waarbij een hoge opbrengst aan zuivere cellen verkregen om functiebehoud bereiken. Om de tumor nabootsen microenvironment, 3D experimenten uitgevoerd. Gezien de korte halfwaardetijd van neutrofielen in vitro, 3D experimenten met verse menselijke neutrofielen niet overtuigend. Daarom worden promyelocytische (HL60) cellen geïnduceerd om te differentiëren tot neutrofiel-achtige cellen met de differentiatie inducerende dimethylsulfoxide (DMSO) en retinoïnezuur (RA). Gebruik gedifferentieerde HL60 cellen (HL60 diff) voorkomt met verschillende responsen van neutrofielen door isolatie van verschillende donoren. In vitro 3D cultuurmodellen vormen een tussenstap tussen in vitro 2D modellen en in vivo modellen. In 2D-cultuur, de cellen uitgespreid op plastic oppervlak vormen onnatuurlijk cel bijlagen bij afgezette eiwitten die gedenatureerd op deze synthetische ondergrond. Omgekeerd, de cellen in kweek 3D vorm natuurlijke cel- attachments omdat de cellen en de extracellulaire matrix ze synthetiseren zijn het natuurlijke materiaal waaraan zij gehecht.Daarom 3D co-cultuur modellen, met name tussen kankercellen en andere celtypes, zijn zeer nuttig voor het aanduiden van hun bijdrage aan tumorgroei, angiogenese en metastase is. Hierdoor 3D culturen maken de celkweek bootsen de fysiologische omstandigheden die bestaan ​​in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS bevat calcium en magnesium)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td><td>Life technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline streptomycine (Pen Strep)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bruton's tyrosine kinase (Btk) remmer (Ibrutinib)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristine&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel basement membrane matrix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Zet op 4 oC een nacht (O/N) voor de dag van het experiment</td></tr><tr><td>Rode cel lyse buffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Retinoïnezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Annexing V-FLOUS kleuringskit&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp;988&nbsp;549&nbsp;001</td><td></td></tr><tr><td>Kit RAL 555 Gewijzigde Giemsa kleuringskit</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII flowcytometrie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 Celviabiliteitsteller</td><td>Nexcelom&nbsp; Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrofielen isolatie en analyse van hun rol in de lymphoma cell gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type (40% tot 75%) witte bloedcellen en behoren tot de eerste ontstekingscellen die migreren naar de plaats van ontsteking. Ze spelen een sleutelrol in het aangeboren immuunsysteem en zijn belangrijk in de kankerbiologie. Neutrofielen zijn voorgesteld als belangrijke bemiddelaars van maligne transformatie, tumorprogressie, angiogenese en bij de modulatie van antitumorimmuniteit; door hun afgifte van oplosbare factoren of hun interactie met tumorcellen. Om de specifieke functies van neutrofielen te karakteriseren, is een snelle en betrouwbare methode gewild voor in vitro isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed. Hier wordt een dichtheidsgradiëntscheidingsmethode gedemonstreerd om neutrofielen evenals mononucleaire cellen uit het bloed te isoleren. De procedure bestaat uit het zorgvuldig plaatsen van de dichtheidsgradiëntoplossing zoals Ficoll boven het verdunde bloed verkregen van patiënten gediagnosticeerd met chronische lymfatische leukemie (CLL), gevolgd door centrifugatie, isolatie van de mononucleaire laag, scheiding van neutrofielen van RBC's door dextran en vervolgens lysis van resterende erytrocyten. Deze methode heeft aangetoond neutrofielen te isoleren met een zuiverheid van ≥ 90%. Om de tumormicro-omgeving na te bootsen, werden 3-dimensionale (3D) experimenten uitgevoerd met behulp van basale membraanmatrix zoals Matrigel. Gezien de korte halfwaardetijd van neutrofielen in vitro, kunnen 3D-experimenten met verse menselijke neutrofielen niet worden uitgevoerd. Om deze reden worden promyelocytische HL60-cellen gedifferentieerd langs de granulocytische weg met behulp van de differentiatie-inductoren dimethylsulfoxide (DMSO) en retinoïnezuur (RA). Het doel van onze experimenten is om de rol van neutrofielen op de gevoeligheid van lymfoomcellen voor anti-lymfoommiddelen te bestuderen. Deze methoden kunnen echter worden gegeneraliseerd om de interacties van neutrofielen of neutrofiel-achtige cellen met een groot aantal celtypen in verschillende situaties te bestuderen.

Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze hier beschreven is, primaire leukemische cellen en ongestimuleerde neutrofielen geïsoleerd uit het bloed van CLL patiënten Figuur 1A geeft de bloedgroepen lagen verkregen na dichtheidsgradiënt centrifugatie (van boven naar beneden. Bloedplaatjes en plasma, witte ring vertegenwoordigt de mononucleaire cellen, dichtheidsgradiënt oplossing, granulocyten en erytrocyten). Figuur 1B en 1C tonen de verschillen in morfologi...

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type witte bloedcellen. Hier worden de isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed door middel van dichtheidsgradiëntscheiding en de differentiatie van menselijke promyelocytische (HL60) cellen langs de granulocytische route beschreven; om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor anti-lymfoom middelen te testen.

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Het hoofddoel van deze procedures is om snel hooggezuiverde neutrofielen uit menselijke bloedmonsters te isoleren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie, om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor cancertherapie te onderzoeken met behulp van twee-dimensionale (2D) en drie-dimensionale (3D) celcultuurmodellen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de interacties tussen het aangeboren immuunsysteem en kanker, zoals welke rol neutrofiel-gemedieerde tumorcelresponsen spelen bij cancertherapie. Het belangrijkste voordeel van scheiding via dichtheidsgradiënt is de mogelijkheid om in korte tijd zuivere immuuncelpopulaties te isoleren zonder dat de cellen worden blootgesteld aan stimuli die hun functie kunnen beïnvloeden.Om de primaire leukemische cellen en neutrofielen te isoleren, begint u met het toevoegen van 15 milliliter EDTA-behandeld bloed van patiëntenstalen met chronische lymfatische leukemie aan individuele, steriele 50 milliliter buisjes. Verdun het bloed met 15 milliliter RPMI. Voeg vervolgens voorzichtig en langzaam 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing op kamertemperatuur onder het bloed toe, waarbij u er goed op let dat de lagen nie

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the isolation of cytotoxic high-density neutrophils and low-density neutrophils from the blood of a tumor-bearing mouse by discontinuous sucrose gradient centrifugation.

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood

This video demonstrates an assay investigating the role of neutrophil-like cells in safeguarding lymphoma cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic agents. A 3D co-culture, consisting of lymphoma and neutrophil-like cells, is established and exposed to vincristine—a chemotherapy drug. Direct contact with the neutrophil-like cells induces an upregulation of anti-apoptotic proteins in the lymphoma cells, thereby promoting their survival in the presence of vincristine.

Determining the Role of Neutrophil-Like Cells in Lymphoma Cell Sensitivity to a Test Drug

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare methode die gebruik maakt van omgekeerde fase hoge-prestatievloeistofchromatografie (RP-HPLC) om het purine metabolisme te meten op cellen van chronische lymfatische leukemie (CLL) die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt.

-HPLC gebaseerde test voor Monitor extracellulaire Nucleotide / Nucleoside Metabolism in Human Chronische Lymfatische Leukemie Cellen

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

Hier bieden we een betrouwbare benadering voor het isoleren van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed met behulp van magnetische isolatie (negatieve selectie) en een discontinu dichtheidsgradiëntmedium. Het zorgt voor ongerepte isolatie van cellen met een hoge zuiverheid (≥93%), waardoor een nauwkeurige stroomafwaartse analyse van neutrofielensubpopulaties mogelijk is, cruciaal voor het begrijpen van hun rol in gezondheid en ziekte.

De isolatie en karakterisering van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Leer neutrofielen isoleren uit menselijk bloed via dichtheidsgradiëntcentrifugatie om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor kankertherapie te onderzoeken. Deze methode maakt zuivere immuuncelpopulaties mogelijk.

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Meer video's verkennen