Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Het algemene doel van deze geminiaturiseerde glycaanarray is om de specificiteit en aviditeit van influenza A-virus hemagglutinines te analyseren. Deze assay kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de receptorbinding en aviditeit van het influenza A-virus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we binnen een enkele assay zowel de specificiteit als de relatieve bindingsaviditeit kunnen bepalen, wat normaal gesproken niet wordt bereikt met typische glycaanarrays en plaatgebaseerde assays.

Dit protocol begint met de voorbereidingen van de glycaanmonsters. De basisoplossing voor de glycanen is een voorraad printbuffer die, na bereiding, langzaam getitreerd moet worden tot een pH van 8.5, waarna er surfactant wordt toegevoegd. Verdun de PAA-geconjugeerde glycanen met de bereide printbuffer tot 100 micrograms per milliliter.

Verdun vervolgens de monovalente glycanen tot 100 micromolair, eveneens in de printbuffer. Maak tot slot werkvoorraden van de amine-gefunctionaliseerde kleurstoffen van één micromolair. Pipetteer nu tien microliter van elk glycaanmonster in een well van een 384-wells microtiterplaat.

Dit is voldoende oplossing om vijf slides te printen. Draag daarnaast tien µL van de kleurstofmarker over naar één putje van de printplaat. Bereid het printen van de arrays voor door eerst de arrayer-pinnen en de printkop te positioneren volgens de lay-out.

In dit geval kan één pin alle monsters printen. De glycaan-arrays worden geprint in blokken van zes, omringd door een lege plek aan alle zijden. Draag handschoenen bij het hanteren van de objectglazen.

Pak ze uit en blaas eventueel vuil van hun oppervlakken met ultra-zuiver stikstofgas. Plaats vervolgens de slides met de gecoate zijde naar boven op het plateau van de arrayer. Programmeer daarna de arrayer.

Programmeer in dit geval 27 spots per bezoek aan de bronplaat. Drie pre-spots, geplaatst op het niet-arraygedeelte van een met poly-L-lysine gecoate slide, worden gebruikt om overtollige vloeistof aan de punt van de pin te verwijderen. De overige 24 spots per pinbezoek worden gebruikt om zes spots in vier replica-arrays te plaatsen.

De details worden gegeven in het tekstprotocol. Plaats nu de multi-well platen in de printer en start met het printen van de arrays. Zorg er tijdens het printen voor dat de luchtvochtigheid tussen 55 en 65% blijft. Let op het uiterlijk van de pre-spots op de met poly-L-lysine gecoate objectglazen.

Inspecteer na het printen elke slide visueel. Controleer of de spots correct zijn uitgelijnd binnen de teflonranden, wat essentieel is, en controleer of het juiste aantal spots aanwezig is. Om de hechting van de dots te homogeniseren, plaatst u de geprinte slides onmiddellijk na het printen met de geprinte zijde naar boven in een kamer met een luchtvochtigheid van 100%.

Bekleed een bakje en een geïmproviseerd rekje met natte papieren handdoeken. Wikkel de kamer in plastic om het vocht vast te houden. Verwijder de coupes na een half uur.

Nummer de coupes vervolgens met een oplosmiddelbestendige marker en bewaar ze gedurende één nacht in een exsiccator. Bereid de volgende dag een nieuwe voorraad blokkeringsbuffer door krachtig te roeren. Stel de pH in op 9,2 met behulp van geconcentreerde natriumhydroxide.

Incubeer de coupes vervolgens een uur in de buffer. Om de blokkering te verwijderen, worden de coupes gespoeld met dubbel gedestilleerd water. Plaats de coupes vervolgens in glazen kleurhouders en plaats deze houders in een zwaaiende plaatcentrifuge om de coupes vijf minuten bij 10 G droog te centrifugeren.

Zodra ze droog zijn, kunnen de preparaten indien nodig worden bewaard bij min 20 graden celsius in afgesloten plastic zakken. Maak ter voorbereiding opnieuw een bevochtigingskamer zoals eerder beschreven. Om de geïmmobiliseerde glycanen te detecteren, bereidt u SNA- en ECA-biotinylectines voor in een concentratie van 10 micrograms per milliliter in probingbuffer en voegt u twee micrograms per milliliter streptavidine 555 toe aan elke verdunning.

Om te kleuren met de hemagglutinines, maak een oplossing van 20 µg/mL van het vooraf gecomplexeerde antilichaam in blokkeringsbuffer met een molaire verhouding van vier-op-twee-op-één, zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng 20 µL van de bereide oplossingen over in de putjes van een 384-well plaat. Verdun vervolgens de lectines en hemagglutinines één-op-één in hun respectievelijke buffers.

Maak acht verdunningen door elke well te vullen met 10 µL monster en 10 µL buffer. Incubeer de plaat vervolgens 30 minuten op ijs. Voeg nu acht µL van elke verdunning toe aan een van de 48 microwells op een geprinte slide.

Incubeer vervolgens de voorbereide slide gedurende 90 minuten in de bevochtigingskamer. Was na 90 minuten de slide terwijl u deze aan de rand vasthoudt; dompel hem vier keer in PBS-T, vervolgens vier keer in PBS en tot slot vier keer in gedeïoniseerd water. Centrifugeer de slide nu op dezelfde wijze als eerder.

Scan de slide onmiddellijk na het drogen door centrifugeren. Zorg ervoor dat de slide zorgvuldig in de juiste oriëntatie in de scanner wordt geplaatst. Scan de slides iteratief met een laag laservermogen van vijf milliwatts, waarbij de gain geleidelijk wordt verhoogd van 25 naar 75%. Houd bij het optimaliseren van de scaninstellingen er rekening mee dat de fluoroforen zullen bleken bij herhaalde scans.

Analyseer de opgeslagen afbeelding op bindingssignalen met behulp van de bijbehorende software. Er kan een arraylijst worden geladen waarin het spotpatroon staat. Leg deze over de scan heen om te helpen bij het navigeren naar de plaatsing van de rastermarkeringen.

Gebruik vervolgens de software om de spotintensiteiten te analyseren en sla de resultaten op als een tab-gescheiden tekstbestand voor export naar een spreadsheet of ander statistisch pakket. Analyseer de gegevens door de gemiddelde signaalintensiteit minus de achtergrond te berekenen. Neem het gemiddelde van vier van de zes replicate spots per monster, waarbij het hoogste en het laagste signaal worden weggelaten.

Maak vervolgens een lijngrafiek van het gemiddelde signaal minus de achtergrond tegenover de acht proteïneconcentraties. Maak de resulterende lijn glad met behulp van niet-lineaire regressie. De PAA-array werd gebruikt om de bindingsspecificiteit van influenza A-virus hemagglutininen voor de receptor te beoordelen.

De array bevatte niet-gesialyleerde controles in dezelfde microwells. Plantlectines met bekende specificiteiten voor de geprinte verbindingen werden als positieve controles gebruikt. Het ECA-lectine bond aan terminaal galactose bèta 1-4 gekoppeld aan n-acetylglucosamine en bond niet aan dezelfde verbinding als het terminale galactose was afgeschermd met sialinezuur.

Om alfa 2-6 gekoppeld sialinezuur te testen, werd het SNA-lectine gebruikt. Zoals verwacht bond SNA alleen aan alfa 2-6 gekoppelde sialinezuren, maar met opmerkelijke verschillen in affiniteit voor PAA-gekoppelde versus niet-PAA-gekoppelde dye lacNAc-herhalingen. Vervolgens werd een H5-hemagglutinine getest, afgeleid van een Vietnam/1203/04-virus, dat uitsluitend alfa 2-3 gekoppelde sialinezuren herkent.

Het bindingsprofiel van het H5-hemagglutinine vertoonde de verwachte specificiteit met een hogere aviditeit voor de PAA-gekoppelde structuren. Ten slotte werd het H1-hemagglutinine van een menselijke seizoensgebonden H1N1-stam getest. Zoals verwacht bond dit hemagglutinine alleen aan alpha 2-6 gekoppelde sialinezuurhoudende structuren.

Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen de bindingsspecificiteiten en relatieve aviditeiten van influenzavirussen binnen één enkele assay worden onthuld. Deze techniek zal de efficiëntie van influenza-bindingsassays aanzienlijk verhogen en tegelijkertijd het verbruik van kostbare biologische materialen verminderen.