Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine
29 mei 2016
Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.
Het algemene doel van deze geminiaturiseerde glycanarray is om de specificiteit en aviditeit van influenza A-virus hemagglutininen te analyseren. Deze test kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de binding en aviditeit van influenza A-virusreceptoren. Het grote voordeel van deze techniek is dat we binnen een enkele test zowel de specificiteit als de relatieve bindingsaviditeit kunnen bepalen, iets wat normaal niet mogelijk is met typische glycanarray- en plaatgebaseerde tests.
Dit protocol begint met de voorbereiding van de glycamonsters. De basisoplossing voor de glycanen is een stock-afdrukbuffer die, wanneer gemaakt, langzaam getitreerd moet worden tot een pH van 8,5 en vervolgens een toevoeging van oppervlakteactieve stof moet krijgen. Gebruik de bereide afdrukbuffer om de PAA-geconjugeerde glycanen te verdunnen tot 100 microgram per milliliter.
Verdun vervolgens de monovalente glycanen tot 100 micromolar ook in de afdrukbuffer. Maak ten slotte werkoplossingen van de amine-gefunctionaliseerde kleurstoffen op één micromolar. Laad nu tien microliter van elk glycamonster in een putje van een 384-wel-microtiterplaat.
Dit is genoeg oplossing om vijf slides af te drukken. Draag ook tien microliter van de kleurmarker af naar een putje van de afdrukplaat. Bereid de afdruk van de arrays voor door eerst de arrayer-pinnen en de afdrukkop te positioneren volgens het lay-out.
In dit geval kan één pen alle monsters afdrukken. De arrays van glycanen worden afgedrukt in blokken van zes, omgeven door een lege plek aan alle kanten. Trek handschoenen aan om de slides te hanteren.
Pak ze uit en blaas eventueel puin van hun oppervlakken met ultra-zuiver stikstofgas. Plaats vervolgens de slides met de beklede kant omhoog op de arrayer-stage. Programmeer vervolgens de arrayer.
Programmeer in dit geval 27 spots per bezoek aan de bronplaat. Drie vooraf geplaatste spots op het niet-arraygebied van een poly-L-lysine gecoate slide worden gebruikt om overtollig vocht aan de punt van de pen te verwijderen. De andere 24 spots per penbezoek worden gebruikt om zes spots in vier replicaatarrays te plaatsen.
Details worden gegeven in het tekstprotocol. Laad nu de multi-well platen in de printer en begin met het afdrukken van de arrays. Zorg er tijdens het afdrukken voor dat de luchtvochtigheid tussen 55 en 65% blijft. Let op het uiterlijk van de pre spots op de poly-L-lysine gecoate slides.
Inspecteer na het afdrukken elke slide visueel. Controleer op correcte uitlijning van de spots binnen de teflon randen, wat essentieel is, en controleer op het correcte aantal gespotde functies. Om de hechting van de stippen te homogeniseren, plaats de afgedrukte slides direct na het maken in een 100% vochtigheidskamer met hun bedrukte kant omhoog.
Gebruik natte papieren handdoeken om een container en een geïmproviseerd rek te bekleden. Wikkel de kamer in plastic om de vochtin te vangen. Verwijder na een half uur de slides.
Nummereer vervolgens de slides met een oplosmiddelbestendige marker en bewaar ze 's nachts in een droogkast. Bereid de volgende dag een verse voorraad blokkeerbuffer voor met krachtig roeren. Pas de pH aan op 9,2 met geconcentreerd natriumhydroxide.
Incubeer vervolgens de slides in de buffer gedurende een uur. Om de blokkering te verwijderen, spoel de slides af in twee keer gedistilleerd water. Draag vervolgens de slides over naar glazen kleurhouders en laad de houders in een draaiende plaathouder om de slides bij 10 G's gedurende vijf minuten droog te draaien.
Na het drogen, bewaar de slides indien nodig bij min 20 graden Celsius in verzegelde plastic zakken. Bereid ter voorbereiding een andere bevochtigingskamer zoals eerder. Bereid om de geïmmobiliseerde glycanen te detecteren, SNA en ECA gebiotineerde lectinen voor bij 10 microgram per milliliter in sondeverdunningsbuffer en voeg aan elke verdunning twee microgram per milliliter streptavidin 555 toe.
Maak een 20 microgram per milliliter oplossing van voorcomplex antilichaam in blokkeerbuffer in een vier-op-twee-op-een molaire verhouding zoals beschreven in het tekstprotocol om met de hemagglutininen te kleuren. Draag 20 microliter van de bereide oplossingen over naar putjes van een 384-wel plaat. Verdun vervolgens de lectinen en hemagglutininen serieel een-op-een in hun geschikte buffers.
Maak acht verdunningen, vul elk putje met 10 microliter monster en 10 microliter buffer. Bewaar vervolgens de plaat 30 minuten op ijs. Voeg nu acht microliter van elke verdunning toe aan één van de 48 microputjes op een afgedrukte slide.
Bewaar vervolgens de bereide slide gedurende 90 minuten in de bevochtigingskamer. Was na 90 minuten de slide terwijl u deze van de rand vasthoudt; dompel het vier keer onder in PBS-T, dompel het vervolgens vier keer onder in PBS en tenslotte vier keer onder in gedeïoniseerd water. Droog de slide vervolgens opnieuw op zoals eerder.
Scan de slide onmiddellijk na het drogen. Zorg ervoor dat u de slide voorzichtig in de juiste oriëntatie in de scanner laadt. Gebruik een lage laservermogen van vijf milliwatt en scan de slides iteratief, waarbij u geleidelijk het vermogen verhoogt van 25 tot 75% Terwijl u de scaninstellingen optimaliseert, houd er rekening mee dat de fluoroforen bij herhaalde scans verbleken.
Analyseer de opgeslagen afbeelding voor bindingssignalen met behulp van de bijbehorende software. Een arraylijst kan worden geladen die het afdrukpatroon heeft. Leg deze over de scan om de plaatsing van de rastermarkeringen te helpen navigeren.
Gebruik vervolgens de software om de spotintensiteiten te analyseren en sla de resultaten op als een tab-gescheiden tekstbestand om te exporteren naar een spreadsheet of ander statistisch pakket. Analyseer de gegevens door de gemiddelde signaalintensiteit min de achtergrond te berekenen. Neem een gemiddelde van vier van de zes replicaatspots voor elk monster, waarbij u het hoogste signaal en het laagste signaal weg laat.
Maak vervolgens een lijngrafiek van de gemiddelde gemiddelde signaal min de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een geminiaturiseerde glycan-array die is ontworpen om de specificiteit en aviditeit van influenza A-virus hemagglutinines te analyseren. De methode maakt simultane beoordeling van receptorbinding en aviditeit mogelijk, wat doorgaans niet haalbaar is in standaard assays.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Glycobiologie
- Assayontwikkeling
Achtergrond
- Hemagglutinine van het influenza A-virus speelt een cruciale rol bij receptorbinding.
- Begrip van receptorspecificiteit is essentieel voor vaccinontwikkeling.
- Traditionele assays hebben vaak niet de mogelijkheid om zowel aviditeit als specificiteit gelijktijdig te meten.
- Miniaturisatie van assays kan de doorvoer verhogen en reagentiakosten verlagen.
Doel van de studie
- Om een geminiaturiseerde glycan-array te ontwikkelen voor influenza A-virusanalyse.
- Om de aviditeit en specificiteit van hemagglutinines voor sialic acid-receptoren te evalueren.
- Om de efficiëntie van glycan-array assays te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van glycanmonsters met behulp van een stock printing buffer.
- Titratie van de printing buffer tot een pH van 8,5.
- Verdunning van PAA-geconjugeerde glycanen tot 100 microgram per milliliter.
- Gebruik van een 96-well plate formaat voor de assay.
Belangrijkste resultaten
- De geminiaturiseerde assay meet succesvol de hemagglutinine aviditeit.
- Specificiteit voor sialic acid-bevattende receptoren werd effectief geanalyseerd.
- Resultaten wijzen op verbeterde efficiëntie vergeleken met traditionele methoden.
- De techniek maakt een uitgebreide analyse binnen een enkele assay mogelijk.
Conclusies
- De geminiaturiseerde glycan-array is een waardevol hulpmiddel voor influenza-onderzoek.
- Deze methode kan een beter begrip van receptorinteracties faciliteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen vaccinontwikkelingsstrategieën verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This miniaturized glycan microarray enables simultaneous assessment of influenza A virus hemagglutinin specificity and avidity, addressing a critical gap in receptor-binding analysis. By reducing reagent consumption and increasing throughput, the assay supports early-stage antiviral and vaccine development with improved predictive confidence. The format allows for efficient screening of hemagglutinin variants across sialic acid linkages, informing target validation and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates hemagglutinin binding to α2-3 and α2-6 sialic acid receptors to clarify receptor specificity and host range potential.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of PAA-linked and non-PAA-linked glycans to assess avidity differences within a single assay.
- Scientific Value: Uses plant lectins (SNA, ECA) as positive controls to validate array functionality and ensure reliable readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports serial dilution of hemagglutinins across eight concentrations to generate binding curves for avidity estimation.
- Operational Value: Miniaturized format prints 48 arrays per slide, equivalent to 18 conventional 96-well plates, significantly reducing sample and reagent use.
- Scientific Value: Allows simultaneous testing of six glycan-binding proteins at eight dilutions across six different glycans, including non-sialylated controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses binding profiles of hemagglutinins from avian (H5) and human seasonal (H1N1) strains to evaluate receptor adaptation trends.
- Operational Value: Enables rapid comparison of binding specificity and relative avidity between viral strains to inform preclinical risk assessment.
- Scientific Value: Includes non-sialylated controls in each microwell to distinguish specific from nonspecific binding, improving data interpretability.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, providing quantitative binding data that supports go/no-go decisions in influenza therapeutic and vaccine programs.
- Discovery Biology: Tests hemagglutinin-receptor interactions to clarify mechanistic basis of viral entry and host specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts after blocking, incubation, washing, and scanning steps.
- Analytics: Generates signal intensity data averaged from replicate spots, enabling nonlinear regression and avidity modeling.
- Translational Research: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes such as receptor adaptation and cross-species transmission potential.
- Enterprise Reuse: The printed slide format allows for storage, batch processing, and reuse across multiple hemagglutinin screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides dual readouts of specificity and avidity, reducing mechanistic ambiguity in hemagglutinin-receptor interactions.
- Operational Value: Standardizes glycan presentation via PAA conjugation and controlled printing, enhancing assay reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates screening timelines and reduces costs, improving capital efficiency in early influenza research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of hemagglutinin targets based on receptor binding profiles and avidity metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in glycan chemistry, microarray printing, and fluorescence detection.
- Dependent on arrayer precision, humidity control (55–65% during printing), and proper slide handling to ensure spot integrity.
- Necessitates standardized blocking, probing, and washing protocols to minimize background and ensure specific signal detection.
- Requires calibration of scanning settings (low laser power, incremental gain) to avoid fluorophore bleaching while maximizing sensitivity.
- Limited to soluble glycan-binding proteins; not suitable for intact virions or membrane-bound complexes without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Glycan Preparation and Plate Setup
1:56
Printing the Arrays
3:49
Humidifying, Numbering, and Blocking the Arrays
5:10
Analyzing Glycan Binding Proteins
6:55
Slide Scanning and Analysis
8:21
Results: Polyacrylamide (PAA) Array Specificity and Discrimination
10:00
Conclusion
