Name: Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer de geforceerde perfusiemethode voor het selectief oogsten van marginerend-pulmonale leukocyten uit longen van ratten en muizen. Deze techniek is essentieel voor immunologisch onderzoek naar longziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs en dit werk werd ondersteund door NIH / NCI subsidie ​​# R01CA172138 (tot SBE).

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Tel-Aviv University. 1. Protocol Rat <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Schik 2 vlinder 21 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 21 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald. </li><li> Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling. </li><li> Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) oplossing. Gebruik bij RT. 35 ml is de minimaal benodigde volume per dier. </li><li> Streamen gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen. </li></ol></li><li> Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten <ol><li> Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen. </li><li> Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus. </li><li> Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een ​​hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen. </li><li> Plaats een vlindernaald in de rechter ventrikel van het hart en binnen ongeveer een minuut verzamelen van de maximale hoeveelheid bloed in een spuit (~ 6 ml van een 250 g dier). </li><li> Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen. </li><li> Houd de vlinder naald binnen de rechter ventrikel, terwijl het vervangen van de spuit met het bloed met de uitstroom pijp van de peristaltic pomp. </li><li> Plaats een tweede vlinder naald aangesloten op een 5 ml oogsten spuit in de linker ventrikel, het vermijden van de penetratie van het septum interventriculare. </li><li> Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 5 ml / min en voorzichtig verzamelen in de spuit de eerste milliliters perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed. Ga door tot het perfusaat kleur verandert van donker tot licht rood. (Gooi de met bloed verontreinigde perfuste). </li><li> Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat 20 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 7 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm. </li><li> Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp. </li></ol></li><li> leukocyten Extraction <ol><li> Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg. </li><li> Zuig het medium. </li><li>Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap twee keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster. </li><li> Voeg 20 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. </li><li> Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Mouse Protocol <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Schik 2 vlinder 25 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 25 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald. </li><li> Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling. </li><li> Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml 1x PBS oplossing. Gebruik bij RT. 25 ml is de minimaal benodigde volume per dier. </li><li> Streben gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen. </li></ol></li><li> Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten <ol><li> Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen. </li><li> Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus. </li><li> Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een ​​hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen. </li><li> Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen. </li><li> Plaats een vlindernaald verbonden met de uitstroompijp van de peristaltische pomp naar rechts ventricle van het hart, en een tweede vlinder naald aangesloten op een 2 ml oogsten spuit in de linker ventrikel van het hart, avoidingpenetration van de interventriculare septum. </li><li> Schakel de pomp op een snelheid van ongeveer 2 ml / minuut; de eerste milliliters bloed besmet perfusaat in de oogst spuit totdat het perfusaat wordt van donker tot licht rood (Gooi het bloed verontreinigde perfuste). </li><li> Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 2 ml oogsten spuit met een 10 ml injectiespuit oogsten en laat 10 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm. </li><li> Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp. </li></ol></li><li> leukocyten Extraction <ol><li> Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg. </li><li> Zuig het medium. </li><li> Voeg 10 ml PBS of medium, centrifuge bij 400xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap drie keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster. </li><li> Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. </li><li> Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De werkwijze die hierin gepresenteerde maakt het selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van MP-leukocyten. Vergeleken met circulerende leukocyten of milt, de MP populatie karakteristiek met bijzondere samenstelling van leukocytsubpopulaties, hogere activeringsniveaus, hogere afgifte van verscheidene cytokinen en hogere mRNA niveaus van pro- en anti-inflammatoire cytokines 2,3. Specifiek hebben we aangetoond dat MP-NK-cellen zijn cytotoxischer dan bloedsomloop NK cellen tegen verschillende...

Leukocyten zich te houden aan de haarvaten van de longen (dat wil zeggen, marginating-pulmonaire (MP) leukocyten) 1 werd aangetoond dat verschillende leukocyten samenstelling en unieke activiteit vertonen in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten (bv, circulatie, milt, beenmerg) 2- 4. Bijvoorbeeld, MP-leukocyten vertonen hogere natural killer (NK) cellen cytotoxiciteit tegen verschillende tumorcellen, in vergelijking met circulerende en milt NK-cellen, evenals gedifferentieerde messenger RNA (mRNA) niveaus en verhoogde uitscheiding van pro- en anti-inflammatoire cytokines. De samenstelling van cellen is ook onderscheiden van circulerende leukocyten als MP-leukocyten een hogere verhouding van aangeboren / adaptieve immuniteit in vergelijking met circulerende leukocyten (50% vs. 30%, respectievelijk). Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MP-leukocyten activeren om deze belangrijke en unieke immuuncompartiment (celpopulatie) bestuderen en elucIDATE de impact van verschillende manipulaties (bijvoorbeeld activering van het immuunsysteem) op deze specifieke cellen. De betekenis van deze unieke populatie begrijpen, is het belangrijk op te merken dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residuele ziekte door in vivo functies van celgemedieerde immuniteit (CMI). Dit vermogen blijkt ondanks het precedent falen van het immuunsysteem om de primaire tumor te controleren, en ondersteund door ruime in vivo bewijs kankerpatiënten en diermodellen 5. Belangrijk, deze bevindingen vaak inconsistent met in vitro en ex vivo studies die aangeven dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten in bloedmonsters van mensen en dieren (gemeten cytotoxiciteit assays) 6,7. Dit verschil kan worden toegeschreven aan de in vivo aanwezigheid van verschillende leukocyt populaties, zoals de hiervoorgenoemde MP leukocytpopulatie en specifiek de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen 3. Inderdaad, syngene tumorcellen (MADB106), die bleken resistent tegen circulerende leukocyten en milt zijn, bleken worden gelyseerd door MP-NK-cellen 3,8. Zo is de zogenaamd &quot;NK-resistente &#39;MADB106 cellen die uitzaaien naar de longen van fischer344 (F344) ratten worden gecontroleerd door MP-NK-cellen, maar niet door het circuleren of milt NK-cellen, die gewoonlijk worden bestudeerd vanwege hun gemakkelijke toegang. Gezuiverde en actieve MP-leukocyten zijn toegankelijk via de standaard oogstmethodes leukocyten uit de longen, die gebaseerd zijn op longweefsel vermalen of biologische afbraak 9. Onze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van weefselverwerking benaderingen. Ten eerste, de perfusie aanpak oogst selectief MP-leukocyten, die hen scheidt van andere cellen die afkomstig zijn van de long parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire compartments. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit en de fysiologische milieu van MP-leukocyten, in tegenstelling tot het malen en biologische verwerking benaderingen die cellen beschadigen, verandering van hun morfologie, en induceren de productie en afgifte van verschillende factoren die het immuunsysteem moduleren en specifiek onderdrukken NK 10 cytotoxiciteit. De longen zijn een belangrijk doelorgaan voor kanker metastase en verschillende infectieziekten. Alle circulerende maligne cellen en geïnfecteerde cellen passeren de longen haarvaten, waar ze moeten vervormen en interactie met capillaire endotheelcellen en resident leukocyten. Onder deze omstandigheden kunnen circulerende cellen gemakkelijk worden gericht op resident MP-leukocyten. Het lijkt derhalve gunstig biologisch geactiveerde leukocyten in deze immuuncompartiment, en het is belangrijk om deze unieke MP-populatie studie in verschillende biologische, experimentele en klinische settings. Het is het waard om op te merken dat systemic immune activering door verschillende biologische-respons-modificatoren (bijvoorbeeld polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) Soort-C CpG oligonucleotiden (CpG-C ODN)) is aangetoond dat MP-leukocyten meer dan circulerende leukocyten 3 activeren 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4"</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selectief oogsten van marginating-pulmonaire leukocyten

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginerende-pulmonale (MP) leukocyten zijn leukocyten die zich hechten aan het binnenste endotheel van de longhaarvaten. MP-leukocyten bleken een unieke samenstelling en kenmerken te vertonen in vergelijking met leukocyten van andere immuuncompartimenten. Bewijs suggereert een hogere cytotoxiciteit van natuurlijke killercellen en een duidelijk pro- en anti-inflammatoir profiel van de MP-leukecytenpopulatie in vergelijking met circulerende of splenische immunocyten. De hier gepresenteerde methode maakt selectieve winning van MP-leukocyten mogelijk door gedwongen perfusie van de longen bij muizen of ratten. In tegenstelling tot andere methoden die worden gebruikt om longleukocyten te extraheren, zoals weefselvermaling en biologische afbraak, levert deze methode exclusief leukocyten op uit de longhaarvaten, onverantwoord met parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire cellen. Bovendien behoudt de perfusietechniek beter de integriteit en het fysiologische milieu van MP-leukocyten, zonder fysiologische reacties te veroorzaken als gevolg van weefselverwerking. Deze unieke MP-leukecytenpopulatie is strategisch gelegen om abnormale circulerende cellen te identificeren en hierop te reageren, aangezien alle circulerende kwaadaardige cellen en geïnfecteerde cellen worden tegengehouden tijdens het passeren van de longhaarvaten, fysiek in wisselwerking staan met endotheelcellen en residente leukocyten. Dus, selectieve winning van MP-leukocyten en hun studie onder verschillende omstandigheden kunnen ons begrip van hun biologische en klinische betekenis verbeteren, met name met betrekking tot het beheersen van circulerende afwijkende cellen en longgerelateerde ziekten.

De MP-compartiment vertonen een andere leukocyten deelverzameling samenstelling ten opzichte van circulerende leukocyten. Gebruikt flowcytometrie analyse werden leukocytsubpopulaties geïdentificeerd en gekwantificeerd aan de samenstelling van zowel circulerende leukocyten en MP karakteriseren. Granulocyten en lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooit. Binnen de lymfocyten werden NKRP-1 heldere cellen geïdentificeerd als NK-cellen CD3 <...

Marginale-pulmonale leukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we de selectieve oogst van deze subpopulatie van pulmonale leukocyten, door gedwongen perfusie van de longen bij ratten en muizen. Marginale-pulmonale leukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de gevoeligheid voor door bloed overgedragen en longgerelateerde ziekten.

Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Het algemene doel van deze procedure is de geforceerde perfusie van longen van muizen of ratten voor de selectieve oogst van marginerende pulmonale leukocyten, die hechten aan het binnenste endotheel van de longcapillairen. Deze methode maakt het mogelijk om deze specifieke leukocytenpopulatie te bestuderen, die unieke kenmerken en onderscheidende hematologische functies vertoont. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het uitsluitend leukocyten uit de longcapillairen oplevert, waarbij cellen uit de parenchymale, interstitiële en bronchoalveolaire compartimenten worden uitgesloten.Liat Sorski en Lee Shaashua, twee promovendi uit mijn laboratorium, zullen deze procedure demonstreren. Voordat u met de procedure begint, laat u gehepariniseerde PBS door de lijnen van de peristaltische pomp en de vlindernaaldjes stromen om eventuele luchtbellen te verwijderen. Gebruik vervolgens, onmiddellijk na het stoppen van de ademhaling, een steriele schaar en tandheelkundige pincetten om de peritoneale holte en de borstholte van de geëuthanaseerde rat te openen door een midline abdominale incisie te maken tot aan het xiphoïdeusproces.Gebruik vervolgens de pincet om het borstbeen op te tillen en snijd voorzichtig de borstkas aan beide zijden door. Zet een hemostat op het borstbeen en vouw de borstkas naar rostral om het cardiopulmonaal complex bloot te leggen. Steek daarna een vlindernaald in de rechterventrikel van het hart en verzamel de maximale hoeveelheid bloed.Zodra al het bloed is verzameld, wordt de vena cava met een hemostat afgeklemd om retrograde perfusie van de lever te voorkomen. Houd vervolgens de vlindernaald in de rechterventrikel, vervang de spuit met bloed door de uitlaatleiding van de peristaltische pomp en voer een tweede vlindernaald, verbonden met een oogstspuit van vijf milliliter, in de linkerventrikel in. Zet nu de peristaltische pomp aan op een snelheid van ongeveer vijf milliliter per minuut en verzamel voorzichtig de eerste milliliters van het met bloed verontreinigde perfusaat in de oogstspuit totdat het perfusaat van donker- naar lichtrood verandert.Vervang vervolgens, zonder de pomp te stoppen, snel de oogstspuit van 5 ml door een oogstspuit van 20 ml en verzamel 20 ml longperfusaat om de marginerende pulmonale leukocyten van de rat te oogsten met een snelheid van 7 ml per minuut. Let op de geleidelijke verkleuring van de longen van bleekrood naar helderwit, wat duidt op een succesvolle perfusie. Wanneer het volledige volume perfusaat is verzameld, stop dan de stroom van de peristaltische pomp en breng het verzamelde perfusaat over in een buis.Centrifuge vervolgens het perfusaat en aspireer het supernatant. Laat gehepariniseerde PBS door de slangen van de peristaltische pomp en de vlindernaalden stromen om eventuele luchtbellen te verwijderen. Om marginerende longleukocyten van de muis te verzamelen, worden direct na het stoppen van de ademhaling steriele scharen en tandheelkundige pincetten gebruikt om de peritoneale holte en de borstholte te openen door middel van een midline abdominale incisie tot aan het xiphoïdusproces.Gebruik vervolgens een pincet om het borstbeen op te tillen en snijd de ribbenkast aan beide zijden door. Klem een hemostat op het borstbeen en klap de ribbenkast rostral om het cardiopulmonaal complex bloot te leggen. Klem de vena cava af met een hemostat om retrograde perfusie van de lever te voorkomen en voer de butterfly-naald in de rechterventrikel van het hart in.Houd vervolgens de vlindernaald in de rechterventrikel, verbind deze met de uitstroomleiding van de peristaltische pomp en voer een tweede vlindernaald, verbonden met een oogstspuit van twee milliliter, in de linkerventrikel in. Zet de pomp aan op een snelheid van ongeveer twee milliliter per minuut. Verzamel voorzichtig de eerste milliliter met perfusaat verontreinigd bloed in de oogstspuit totdat het perfusaat verandert van donker- naar lichtrood.Vervang vervolgens, zonder de peristaltische pomp te stoppen, snel de oogstspuit van twee milliliter door een oogstspuit van 10 milliliter en verzamel 10 milliliter longperfusaat bij een perfusiesnelheid van vier milliliter per minuut. Let op de geleidelijke verkleuring van de longen van bleekrood naar helderwit, wat duidt op een succesvolle perfusie. Wanneer al het longperfusaat is verzameld, stop dan de stroom van de peristaltische pomp en breng het verzamelde perfusaat over naar een buis.Centrifuge vervolgens het perfusaat en aspireer het supernatant. Het marginerende longcompartiment vertoont een andere samenstelling van leukocyten-subsets dan die waargenomen bij circulerende leukocyten. Inderdaad vormen aangeboren immunocyten, waaronder granulocyten, monocyten en natural killer-cellen, meer dan 50% van de marginerende pulmonale leukocytenpopulatie.Vergeleken met minder dan 30% van het circulerende celcompartiment. In tegenstelling hiermee komen T-cel- en dendritische celpopulaties in lagere percentages voor in het marginerende longcompartiment vergeleken met de circulerende cellen. Er is een drievoudig hoger percentage grote natural killer-cellen aanwezig in het marginerende longcompartiment dan in het circulerende celcompartiment, hoewel het totale aantal natural killer-cellen over het algemeen vergelijkbaar is.Bovendien is het vermogen van natural killer-cellen uit het marginerende longcompartiment om tumorcellen te lyseren groter dan dat van circulerende natural killer-cellen, zoals gemeten met een standaard chroomrelease-assay tegen ten minste twee verschillende tumorcellijnen. Daarnaast heeft immuunstimulatie via in vivo toediening van Poly I:C een diepgaander effect op de cytotoxiciteit van marginerende long-natural killer-cellen dan op circulerende natural killer-cellen wanneer MADB106-targets worden gebruikt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele minuten worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast.Deze technieken maken de selectieve opvang van MP-leukocyten mogelijk. De studie van deze leukocyten zal ons begrip van de biologische en klinische betekenis vergroten, specifiek met betrekking tot het beheersen van circulerende aberrante cellen en longgerelateerde ziekten. Na deze procedure kunnen de cellen worden gekenmerkt en geanalyseerd via flowcytometrie, PCR of elke andere relevante assay.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u marginerende pulmonale leukocyten verzamelt.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

In this video, we demonstrate the isolation of marginating hepatic leukocytes from mouse liver by forced perfusion.

Isolation of Marginating Hepatic Leukocytes from a Mouse Liver

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

Marginerende leverleukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we een methode voor selectieve oogst van deze specifieke levercelpopulatie, door geforceerde perfusie van de lever van ratten of muizen. Marginerende leverleukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de vatbaarheid voor levergerelateerde ziekten en metastasen.

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Dit protocol beschrijft de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs), die aan de ballontips van Swan-Ganz katheters, voldoen terwijl ze worden ingeklemd in de longslagader tijdens het rechterdeel van het hart catheterisatie en blijven aanhangend aan de leeggelopen ballon na verwijdering van het lichaam van de patiënt.

Oogst van de endotheliale cellen van de ballontips van Swan-Ganz katheters na het rechterdeel van het hart catheterisatie

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's), een recent geïdentificeerd intracraniaal celtype, hebben slecht begrepen functies. Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het oogsten van LLC's van muizen en het opzetten van in vitro primaire culturen. Dit protocol is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen zich te verdiepen in de cellulaire functies en mogelijke klinische implicaties van LLC's.

Oogst en primaire kweek van leptomeningeale lymfatische endotheelcellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Leer de geforceerde perfusiemethode voor het selectief oogsten van marginerend-pulmonale leukocyten uit longen van ratten en muizen. Deze techniek is essentieel voor immunologisch onderzoek naar longziekten.

Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Meer video's verkennen