Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement

Het algemene doel van de Functionele Complementatie Essay is om de activiteit van een enzym te verduidelijken door een functionele kopie van het corresponderende gen in een mutante cel te introduceren om te zien of het een wildtype fenotype herstelt in de mutante achtergrond. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in verschillende vakgebieden, zoals biochemie, microbiologie, genetica, plantenbiologie, evolutie en andere. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de functie, activiteit en/of rol van een enzym beoordeelt, onder in vivo-omstandigheden, die normaal fysiologisch van aard zijn, in tegenstelling tot in vitro-omstandigheden, die normaal artificieel van aard zijn.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de identificatie en/of de verduidelijking van de functie van niet-gekarakteriseerde enzymen, en die welke nog putatieve of voorspelde functies hebben. Het demonstreren van deze procedure van functionele complementatie is biotechnologie en moleculaire biowetenschappen-major, Taylor Harkness, een student in mijn laboratorium. Na het klonen van de DapL, TarB, MurE en RSH-genen volgens het tekstprotocol, inoculeer 50 milliliter vloeibaar medium met een enkele kolonie van mutante bacteriecellen om te worden getransformeerd met een gen van belang en kweek overnacht.

Op dag twee, gebruik de 50 milliliter overnachtcultuur om 1 liter van het juiste medium te inoculeren en kweek bij 30 graden Celsius tot lock-fase, of tot een OD600 van 0,4 tot 0,6. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 5.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en gebruik 500 milliliter steriele, ijskoude, gedistilleerd water om de pellet te resuspenderen.

Centrifugeer de cellen opnieuw, en na het weggooien van de supernatant, gebruik 250 milliliter steriele, ijskoude 10% glycerol om de pellet te resuspenderen. Na het eindcentrifugeren, gebruik twee milliliter 10% glycerol om de cellen te resuspenderen. Breng 50 microliter aliquoten over in microcentrifugebuisjes en vries onmiddellijk in door de buisjes in een dry ice ethanol-bad te plaatsen.

Bewaar de cellen bij min 80 graden Celsius voor elektroporatie. Om elektroporatie uit te voeren, voeg 1 microliter recombinant plasmide toe aan een 50 microliter aliquot van competente cellen en plaats op ijs gedurende vijf minuten. Breng de cellen over naar een elektroporatie cuvet en stel de elektroporatieapparatuur in op de volgende instellingen: 25 graden Fahrenheit capaciteit, 2,5 kilovolt en 200 ohm weerstand.

Vervolgens, met de cuvet in het apparaat, geef een puls. Voeg 1 milliliter herstelvloeistof toe aan de cuvet en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Laat de cellen herstellen door de cultuur gedurende 60 minuten in een schudende incubator met zachte rotatie te incuberen bij de juiste temperatuur die door de mutant wordt vereist.

Om transformanten te selecteren, pipet 100 microliters van de cultuur op medium met agar platen en gebruik een steriele verspreider om de oplossing te verspreiden. Incubeer vervolgens overnacht bij de juiste temperatuur. Raadpleeg het tekstprotocol voor verdere details.

Om complementatie-analyse uit te voeren, transformeer AOH1 met de lege vector pBAD33 of met dapL-expressievectoren met behulp van elektroporatie, zoals zojuist is aangetoond. Plateer de transformatiemix op LB agarmedium, aangevuld met 50 microgram per milliliter Dap, 34 microgram per milliliter chlooramfenicol en 50 microgram per milliliter kanamycine. Incubeer de platen 24 uur bij 30 graden Celsius voordat u de resultaten observeert.

Met de lege vector pBAD33 of met de murE-expressievector, transformeer de TKL-11 mutant met behulp van elektroporatie zoals eerder in deze video is aangetoond. Plateer de transformanten op LB agar, aangevuld met 50 microgram per milliliter thiamine, en 34 microgram per milliliter chlooramfenicol, en incubeer de platen 24 uur bij 30 graden Celsius voordat u controleert op transformanten. Test voor complementatie door kolonies van zowel de controle als experimentele transformaties uit te strepen of te plateren op twee platen LB-medium, plus 0,2%arabinose en 50 microgram per milliliter thiamine.

Incubeer één plaat bij 30 graden Celsius en de andere bij 42 graden Celsius gedurende 24 uur voordat u het groeifenotypeer beoordeelt. Transformeer de mutante Hx699-stam en de wilde type Rr217-stam van novosphingobium-soorten met de lege pRK290-vector, of een vector die het native rshNsp-gen bevat in twee afzonderlijke transformatiegebeurtenissen elk, zoals eerder in deze video is aangetoond. Plateer de transformanten op aardappeldextrose of PD-agar aangevuld met 10 microgram per milliliter tetracycline en incubeer gedurende ten minste 72 uur, of tot transformanten verschijnen.

Streek vervolgens de transformanten in een X-patroon op verse PD-agar platen met tetracycline. Na incubatie bij 30 graden Celsius gedurende ten minste vier dagen, bekijk visueel het groeifenotypeer van beide platen. De E.coli dubbele mutant AOH1 heeft een mutatie in het DapE-gen en een deletie van het DapD-gen, en zal niet groeien tenzij Dap wordt geleverd.

Zoals hier te zien is, is de AOH1-mutant die DapLs tot expressie brengt in staat om te groeien op LLDap-vrij medium door THDP om te zetten in LLDap in de Dap lyse-route. Het MurE-enzym faciliteert de toevoeging van m-DAP aan het peptidoglycaan van gram-negatieve bacteriën. De E.coli MurE-mutant, TKL-11, kan niet groeien bij 42 graden Celsius.

In dit experiment groeien alleen TKL-11 cellen getransformeerd met MurE bij 42 graden Celsius. Een mutatie in het TyrB-gen voorkomt de synthese van tyrosine en fenylalanine. Echter, zoals hier getoond, wanneer de TyrB-mutante DL39-stam het A.thaliana At5g36160-gen tot expressie brengt, groeit het op M9-medium, dat tyrosine en fenylalanine mist, waardoor wordt aangetoond dat het enzym tyrosine kan synthetiseren.

De Hx699-mutant in novosphingobium-soorten heeft een niet-functionele RSH-eiwit en produceert een hypomucoïde fenotype. Echter, transformatie met het native RSH-gen produceert meer oplos