Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van dit protocol is om een gedetailleerde pijplijn te bieden voor de nauwkeurige zuivering en depositie van hersenpolyribosomen op mica, om duizenden beelden met nanometerschaalresolutie te verkrijgen zonder dat zware post-processing of 3D-reconstructieanalyses nodig zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van translatie en translationele controle, zoals het begrijpen van de impact van ribosoomorganisatie binnen polysomen tijdens de herprogrammering van genexpressie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er geen fixatie of labeling van monsters vereist is en dat metingen kunnen worden uitgevoerd onder bijna fysiologische omstandigheden om ribosomen en naakte RNA-strengen gemakkelijk te identificeren.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de organisatie van het polyribosoom bij zoogdieren, kan deze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals gist, bacteriën en insecten, evenals op toestanden waarbij translationele controles van genexpressie betrokken zijn. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het hanteren van polysomale monsters voor adsorptie aan mica en de wasstappen zeer complex zijn en vaardigheid en ervaring vereisen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Paola Bernabo en Lorenzo Lunelli.

Begin met het verzamelen en invriezen van hersenweefsel zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Haal vervolgens het bevroren weefsel uit de vriezer en breng het naar de werkbank. Plaats het bevroren hersenweefsel en vloeibare stikstof in een vooraf gekoelde vijzel en vermalen het met een stamper tot er een poeder ontstaat.

Breng ongeveer 25 milligram van het hersenpoeder over naar een koude microcentrifugebuis en voeg onmiddellijk 0,8 milliliter lysisbuffer toe. Pipetteer het mengsel 25 keer snel op en neer om de cellen te lyseren. Centrifugeer de buis vervolgens 1 minuut bij 12 000 x g bij vier graden Celsius om het celdebris te pelletteren.

Breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar de buis 15 minuten op ijs. Centrifugeer de buis vervolgens vijf minuten om de kernen en mitochondriën te pelletteren. Verwijder daarna voorzichtig één milliliter van de bovenkant van een eerder bereide sucrosegradiënt.

Voeg het supernatant van het cytosolisch lysaat druppel voor druppel toe bovenop de sucrose. Nu het monster bovenop de gradiënt is geladen, plaatst u de buis en een tegenwichtbuis voorzichtig in de emmers van een swing-out rotor. Centrifugeer de gradiënt gedurende 100 minuten.

Laat de buisjes na ultracentrifugatie 20 minuten in hun houders staan bij vier graden Celsius om de gradiënt te laten stabiliseren. Verwijder vervolgens voorzichtig de monsterbuis en plaats deze in het opvangapparaat van een dichtheidsgradiënt-fractioneringssysteem. Verzamel fracties van één milliliter terwijl de absorptie van nucleïnezuren bij 260 nanometer wordt gemonitord met een UV-vis-detector en plaats deze op ijs.

Bereid vervolgens aliquots van 30-40 µL van de fracties van belang voor en bewaar deze op ijs. Als de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt, bewaar ze dan bij -80 °C en neem maatregelen om het aantal vries-dooi-cycli te beperken. Om monsters voor AFM-imaging voor te bereiden, bedek eerst een gewassen mica-plaat met 200 µL van 1 mM nikkelsulfaat(II) en incubeer de plaat gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de oplossing, droog het oppervlak met perslucht en plaats de petrischaal op ijs. Voeg daarna voorzichtig de volledige aliquot van de fractie van belang druppel voor druppel toe op de mica. Verspreid het monster over het gehele oppervlak van de mica met een tip van 100 of 200 µL en incubeer het monster gedurende drie minuten op ijs.

Bedek vervolgens het mica-plaatje druppel voor druppel met 200 µL koude AFM-buffer en incubeer het monster gedurende één uur op ijs. Het is belangrijk om het monster op 40 graden te houden en een koude buffer te gebruiken die is bereid in RNase-vrij water om de organisatie van de polyribosomen te behouden. Verwijder na incubatie voorzichtig de buffer en was het mica drie tot vier keer met 200 µL koude AFM-buffer om eventueel overtollig sucrose te verwijderen.

Was daarna de mica drie keer met koude wasoplossing en dep het overtollige water van de mica met papier. De volledige verwijdering van sucrose uit de absorberende monsters is nu cruciaal, aangezien zowel de ribosomen als het vrije RNA in het polysoom zijn gescheiden. Laat het monster drogen onder de zuurkast met het deksel van de petrischaal gedeeltelijk geopend.

Sluit na twee uur de petrischaal. Het monster kan nu bij kamertemperatuur worden bewaard. Bevestig het voorbereide monster met dubbelzijdige tape aan de monsterhouder van de AFM.

Plaats vervolgens de monsterhouder in de AFM-houder volgens de instructies van de fabrikant. Benader na kalibratie het monster totdat de tip van de cantilever het oppervlak raakt. Selecteer een scangebied van twee bij twee micron, een resolutie van ten minste 512 x 512 pixels, kies de modus voor live achtergrondsubtractie en selecteer een Z-schaal van 20-25 nanometer.

Begin vervolgens met de beeldacquisitie. Inspecteer het beeld op de aanwezigheid van ronde objecten met een hoogte tussen 10 en 15 nanometer bij het maken van beelden in lucht. Pas daarna het setpoint en de feedbackparameters aan totdat scherpe objecten zichtbaar zijn.

Bij goede monsters moet de achtergrond er relatief vlak uitzien, met enkele objecten van twee tot vier nanometer hoog. Zodra het beeld goed is, worden meerdere scans van twee bij twee micron gemaakt op verschillende monstergebieden. Na de depositie van sucrose-aliquoten op mica biedt AFM nauwkeurige beschrijvingen van de grootte van individuele polysomen, die verschijnen als clusters van dicht opeengepakte ribosomen.

Een nadere bestudering van een van de ribosomale pieken met behulp van dwarsdoorsnede-analyse onthult dat de hoogte van de ribosomale pieken ongeveer 14 nanometers is. Dit komt overeen met wat eerder is waargenomen voor menselijke ribosomen en polysomen na luchtdrogen. In de afbeelding rechts is een macro gebruikt om de locatie van ribosomen te identificeren en elk ribosoom te markeren met een rode cirkel.

Met deze informatie kan de frequentieverdeling van het aantal ribosomen per polysoom worden geanalyseerd. Deze experimentele verdeling is gefit met een Gaussische curve die gecentreerd was op 5,8 ribosomen per polysoom, met een standaarddeviatie van 1,3. Zodra deze techniek is beheerst, kan het gehele proces van hersenpulverisatie tot de acquisitie van polyribosoombeelden in minder dan acht uur worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het monster op ijs moet blijven en dat koude buffers moeten worden gebruikt voor de depositie van het monster op de mica. Door deze procedure te volgen en het ImageJ-plugin van een ontwikkelaar te gebruiken dat in uw artikel beschikbaar wordt gesteld, kunt u nauwkeurig het aantal ribosomen per polysoom tellen. Na elke ontwikkeling zal deze techniek de weg vrijmaken voor het begrijpen van de kinetiek van polysoomvorming en het identificeren van veranderingen in de organisatie van polysomen onder verschillende cellulaire omstandigheden of weefselcondities.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u duizenden polysoombeelden verkrijgt voor het systematisch analyseren en bestuderen van hun organisatie.