Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy
16 maart 2016
Hoewel de structuur van ribosomen uitgebreid is gekarakteriseerd, is de organisatie van polysomen nog onvoldoende bestudeerd. Om dit kennisgebrek te overwinnen, presenteren we hier een gedetailleerd voorbereidingsprotocol voor nauwkeurige beeldvorming van polysomen van zoogdieren door atomaire krachtmicroscopie (AFM) in lucht en vloeistof.
Het algemene doel van dit protocol is om een gedetailleerde pijplijn te bieden voor de nauwkeurige zuivering en depositie van hersenpolyribosomalen op mica en om duizenden beelden op nanoschaalresolutie te verkrijgen zonder de noodzaak van zware post-verwerking of 3D-reconstructieanalyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van translatie en translationele controle, zoals het begrijpen van de impact van ribosoomorganisatie binnen polysomen tijdens het herprogrammeren van genexpressie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er geen monsterfixatie of labeling vereist is, en metingen kunnen worden uitgevoerd onder bijna fysiologische omstandigheden om de ribosomen en naakte RNA-strengen gemakkelijk te identificeren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de organisatie van zoogdierpolyribosomen, kan deze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals gist, bacteriën en insecten, evenals status die betrekking heeft op translationele controle van genexpressie. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het hanteren van polysomale monsters voor absorptie van mica en de wasstappen vrij lastig zijn en vaardigheden en ervaring vereisen. De procedure wordt gedemonstreerd door Paola Bernabo en Lorenzo Lunelli.
Begin met het verzamelen en invriezen van hersenweefsel zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Trek vervolgens het bevroren weefsel uit de vriezer en breng het naar de werkbank. Plaats het bevroren hersenweefsel en vloeibare stikstof in een voorgekoelde mortel en verpulver het met een stamper tot het een poeder vormt.
Breng ongeveer 25 milligram van het hersenpoeder over naar een koude microcentrifugebuis en voeg onmiddellijk 0,8 milliliter lysbufer toe. Pipetteer het mengsel 25 keer snel op en neer om de cellen te verstoren. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende één minuut bij 12.000 x g en vier graden Celsius om het cellulaire debris te bezinken.
Breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis en houd de buis gedurende 15 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende vijf minuten om kernen en mitochondriën te bezinken. Vervolgens zorgvuldig één milliliter verwijderen vanaf de bovenkant van een eerder bereide sucrosegradiënt.
Leg de sucrose druppel voor druppel bovenop de gradiënt met het supernatant van het cytosolische lysate. Met het monster nu bovenop de gradiënt, laat de buis en een tegengewichtbuis voorzichtig zakken in de emmers van een zwevende emmer rotor. Centrifugeer de gradiënt gedurende 100 minuten.
Laat de buizen na ultracentrifugatie 20 minuten in hun emmers staan bij vier graden Celsius om de gradiënt te laten stabiliseren. Verwijder vervolgens voorzichtig de monsterbuis en monteer deze op het verzamelapparaat van een dichtheidsgradiënt fractieringssysteem. Verzamel een milliliterfracties terwijl u de absorptie van nucleïnezuren bij 260 nanometer monitort met een UV zichtbaar lichtdetector en zet ze op ijs.
Bereid vervolgens 30-40 microliter aliquoten van de interessante fracties en bewaar ze op ijs. Als de monsters niet meteen worden gebruikt, bewaar ze dan bij 80 graden Celsius en neem maatregelen om het aantal bevriezing-ontdooicycli te beperken. Om monsters voor AFM-beeldvorming voor te bereiden, bedek eerst een gewassen micaplaat met 200 microliter één millimolair nikkel II-sulfaat en incubeer de plaat drie minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens de oplossing, droog het oppervlak af met perslucht en plaats de petrischaal op ijs. Voeg vervolgens voorzichtig het hele aliquot van de interessante fractie druppel voor druppel toe op de mica. Verspreid met een 100 of 200 microliter tip het monster over het hele oppervlak van de mica en incubeer het monster gedurende drie minuten op ijs.
Bedek vervolgens de micaplaat druppel voor druppel met 200 microliter koude buffer AFM en incubeer het monster gedurende één uur op ijs. Het belangrijkste is om het monster op 40 graden te houden en koude buffer te gebruiken die in RNase-vrij water is bereid om de organisatie van polyribosomalen te behouden. Na incubatie verwijdert u voorzichtig de buffer en wast u de mica drie tot vier keer met 200 microliter koude buffer AFM om eventuele overtollige sucrose te verwijderen.
Was vervolgens de mica drie keer met koude wasoplossing en laat het overtollige water uit de mica lopen met papier. De volledige verwijdering van sucrose uit de absorberende monsters is cruciaal nu u zowel het ribosoom als naakt RNA in het polysoom hebt afgesneden. Laat het monster onder de chemische kap drogen met de bovenkant van de petrischaal gedeeltelijk geopend.
Na twee uur sluit u de petrischaal. Het monster kan nu bij kamertemperatuur worden bewaard. Bevestig het voorbereide monster aan de monsterhouder van de AFM met dubbelzijdig plakband.
Plaats vervolgens de monsterhouder in de AFM-fase volgens de instructies van de fabrikant. Na calibratie nadert u het monster totdat de cantilevertip in contact komt met het oppervlak. Selecteer een scangebied van twee bij twee micrometer, een resolutie van minimaal 512 x 512 pixels, kies de modus voor live achtergrondafschrijving en selecteer een Z-schaal van 20-25 nanometer.
Begin vervolgens met beeldacquisitie. Inspecteer het beeld en kijk naar de aanwezigheid van ronde objecten die worden gekenmerkt door een hoogte tussen de 10 en 15 nanometer bij het maken van beelden in de lucht. Pas vervolgens de setpoint en feedbackparameters aan totdat scherpe objecten worden gevisualiseerd.
De achtergrond zou relatief vlak moeten zijn in goede monsters met enkele objecten van twee tot vier nanometer hoog. Zodra het beeld er goed uitziet, verwerft u verschillende twee bij twee micrometer scans op verschillende monstergebieden. Na de depositie van sucrose-aliquots op mica, biedt AFM nauwkeurige groottebeschrijvingen van enkele polysomen die verschijnen als clusters van strak gepakte ribosomen.
Een nadere blik op een van de ribosoompieken met behulp van dwarsdoorsnedeanalyse onthult dat de hoogte van de ribosoompieken ongeveer 14 nanometer is. Dit komt overeen met wat eerder we
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het beeldvormen van polysomen van zoogdieren met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). De methode maakt beeldvorming met hoge resolutie mogelijk zonder dat er monsterfixatie of labelen nodig is.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Polysoom-organisatie is onvoldoende onderzocht ondanks uitgebreide karakterisering van de ribosoomstructuur.
- Het begrijpen van de ribosoom-organisatie is cruciaal voor inzichten in de regulatie van genexpressie.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende organismen, inclusief gist en bacteriën.
- Visuele demonstratie is essentieel vanwege de complexiteit van het omgaan met polysomale monsters.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor de zuivering en beeldvorming van hersenpolyribosomen.
- Om de studie van translationele controle en genexpressie te vergemakkelijken.
- Om beeldvorming onder bijna-fysiologische omstandigheden mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Atomaire krachtmicroscopie (AFM) voor beeldvorming.
- Zuivering van hersenpolyribosomen op mica.
- Beeldvorming zonder zware nabewerking of 3D-reconstructie.
- Behandelingstechnieken voor monsterabsorptie en wassen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van polyribosomen met nanoschaalresolutie.
- Identificatie van ribosomen en naakte RNA-strengen in monsters.
- Inzichten in de organisatie van polyribosomen van zoogdieren.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van translationele controles bij verschillende organismen.
Conclusies
- Het protocol verbetert het begrip van de ribosoom-organisatie in polysomen.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die genexpressie bestuderen.
- De toepasbaarheid van de methode op verschillende organismen vergroot de impact.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding polysome organization provides mechanistic insights into translational control, a critical layer of gene expression regulation relevant to target validation in neuroscience and metabolic disease programs. The ability to image polysomes in near-physiological conditions without fixation or labeling enables reproducible, quantitative analysis of ribosome dynamics, supporting early-stage hypothesis testing and biological de-risking. This approach offers a complementary, label-free method to assess translational states in disease-relevant systems, aiding in the prioritization of targets with strong mechanistic rationale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of ribosome organization to interrogate translational hypotheses and clarify pathway-level effects of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Provides a reproducible, label-free imaging readout that reduces variability associated with fixation or staining artifacts.
- Predictive Value: Supports assessment of translational state changes as a functional biomarker for target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative polysome imaging data suitable for high-content analysis of ribosome number and distribution.
- Reproducibility: Allows thousands of nanoscale-resolution images to be acquired under consistent conditions, enabling statistical robustness.
- Scalability: Compatible with fractionation workflows that can be adapted to multi-sample screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to brain tissue, enabling direct study of polysome organization in neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo brain systems, supporting mechanistic de-risking before in vivo validation.
- Cross-Species Utility: Can be extended to yeast, bacteria, and insects, allowing conservation studies and target validation across model organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis validation through mechanistic de-risking, providing biophysical data on translational machinery organization that complements genomic and proteomic approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in polysome structure to translational control during gene expression rewiring.
- Analytics: Enables extraction of quantitative metrics such as ribosome count per polysome and spatial distribution, facilitating comparative analysis across conditions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for studying translational dynamics in diverse disease-relevant systems without reagent-dependent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in translational control by providing direct nanoscale observation of polysome architecture.
- Operational Value: Eliminates need for fixation, labeling, or heavy post-processing, streamlining workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by offering early, structure-function insights into target-mediated translational effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated translational mechanism in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polysome purification, density gradient fractionation, and AFM operation.
- Depends on access to ultracentrifugation, AFM instrumentation, and RNase-free buffer preparation.
- Necessitates standardized sample handling to ensure consistent deposition on mica and preservation of native polysome structure.
- Must account for tissue-specific variability in polysome yield and stability, particularly in post-mortem or frozen brain samples.
- Limited by the need for specialized training in sample preparation and AFM imaging techniques, as noted in the procedural demonstration requirement.
