Name: Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door In Ovo Micro-elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Leer een gemodificeerde in ovo micro-elektroporatiemethode voor genetische manipulatie in het ontwikkelende gehoororgaan van de kip vanaf embryonaal dag vier. Deze techniek vereenvoudigt het bestuderen van proliferatie en differentiatie van auditieve progenitorcellen zonder complexe chirurgie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Doris K. Wu voor expressie plasmiden en in situ sondes, de Johns Hopkins University Center for Sensory Biologie imaging faciliteit en het Centrum voor gehoor en evenwicht. Dit werk werd ondersteund door NIDCD Grant T32 DC000023 LE

De eieren en unhatched embryo&#39;s worden verzorgd en ethisch en humaan behandeld. Alle protocollen voor unhatched embryo gebruik werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland. 1. Eieren en Voorbereiding van de expressieconstructen <ol><li> eieren: <ol><li> Incubeer 3-4 dozijn bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) plat op hun zij bij 37 ° C. <ol><li> Na 24 uur incubatie, trekken 3 cc eiwit met een spuit uit de ronde achterkant van het ei en het boorgat afdicht met doorzichtige tape. Hierdoor ontstaat een luchtkamer tussen de embryo en de eierschaal, waardoor gemakkelijke toegang tot de embryo zonder embryo kleven aan de schaal bij het ​​snijden van het venster om toegang bovenop het ei 19. </li><li> Bij 117 uur van de incubatietijd, stadium de embryo volgens Hamburger en Hamilton 20 ontwikkelingsstadiabij E4 (HH24-25) (zie figuur 1D). </li></ol></li></ol></li><li> Expressieconstructen: <ol><li> Bereid het plasmide DNA met behulp van reagentia en het protocol van de fabrikant van een commercieel verkrijgbare kit preparaat. Bij de laatste stap van de bereiding, elueren de DNA in 500 ui TE (Tris-EDTA) buffer die in de kit in een 1,5 ml buis. </li><li> Ethanol precipiteren van het DNA te concentreren door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat en 1 ml 100% ethanol aan de buis. Plaats de buis bij -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 14.000 rpm bij 4 ° C. De bovenstaande vloeistof en lucht-droog de pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Los het pellet in 15 ui TE-buffer, waarbij een concentratie van ~ 4 ug / ul moet opleveren. Noot: De expressieconstructen hier gebruikte PME-IRES-GFP 10, die wordt aangedreven door een kip β-actine promoter of pCI-H2B-IRES-RFP <sup&gt; 10, die wordt aangedreven door de CMV promoter. </li></ol></li></ol> 2. Kip In Ovo Micro-elektroporatie en In Ovo Cell Proliferation Assay <ol><li> In Ovo Micro-injectie van Expression Construct en Micro-elektroporatie: <ol><li> Trek de glazen capillaire buizen in fijne naalden met behulp van een micro-pipet trekker met de volgende geoptimaliseerde parameters voor een 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Verwarming Filament: Druk = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, en Time = 150 msec (zie tabel 1). </li><li> Stel de linker- en rechter-handed micro-manipulator stadia aan weerszijden van de microscoop (zie figuur 1A). The Right-handed micro-manipulator houdt het glas capillaire naald en de linkshandige micro-manipulator houdt de elektroden (Figuur 1A). </li><li> Bereid de fijn getrokken glazen capillaire naald voor micro-injectie door te snijdende punt van de naald met een tang tijdens het werken onder de microscoop. </li><li> handmatig vullen van de naald met de hand met het micro-manipulator met 2,5 pi plasmide-DNA gekleurd met 0,1% Fast Green tijdens het werken onder de microscoop. </li><li> Leg het ei liggend op zijn kant in een mal / ei vasthoudinrichting (zie figuur 1A). Snijd een rond venster bovenop het ei met een schaar 19 (Figuur 1A). </li><li> Tijdens het werken onder de microscoop, voorzichtig openen de twee membranen overlappen het embryo met behulp van een tang. </li><li> Tijdens het werken onder de microscoop, levert ongeveer ~ 0,5 pi plasmide-DNA naar rechts otische vesikel lumen door micro-injectie handmatig met de rechterhand met de micro-manipulator en door micro-elektroporatie. <ol><li> Hiertoe, micro-injecteren rechts otic vesicle lumen met het DNA met de rechterhand micro-manipulator (Figuur 1B-D), terwijl tegelijkertijd met de linkerhand holdinga pincet aan het hoofd van het embryo te stabiliseren, omdat het hoofd van het embryo dips in fase E4. Niet micro-injecteren langs de otic blaasje lumen, omdat dit de otic blaasje zal beschadigen. </li><li> Onmiddellijk na micro-injectie, terwijl het werken onder de microscoop, gebruik dan de linkerhand micro-manipulator met de positieve (anode) 2 mm platina-elektrode anterior-ventrale naar rechts otic blaasje en de negatieve 2 mm elektrode (kathode) in parallel te plaatsen 1 mm van elkaar (zie Figuur 1 C). Lever 4 pulsen op 12 V met 100 msec duur en 200 msec afstand. De linker otische vesikel dient als interne onbehandelde controle. LET OP: Maak de elektroden tussen electroporations met een wattenstaafje gedoopt in 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li> In Ovo Cell Proliferation Assay: <ol><li> Onmiddellijk na elektroporatie voeg 50 ul van 0,25 mg / ml Edu in 1x PBS door de 50 ul EDE oplossing handmatig laten vallen op de heleembryo in ovo met een pipet. Verzegel de eieren met tape en terug naar de incubator gedurende 18-96 uur. </li><li> Verwijder voorzichtig de tape en controleer de embryo&#39;s voor fluorescentie GFP of RFP signaal binnen de otic blaasje na 18-24 uur met behulp van een standaard fluorescentie microscoop (zie figuur 1 EE &#39;). Als fluorescent signaal aanwezig is, op dit moment de oogst van de embryo&#39;s voor analyses en verzegelt met tape en terug te sturen naar de incubator voor het oogsten en analyses in een later stadium (zie figuur 1 FP &#39;&#39;). OPMERKING: Expressie van GFP signaal met het PME-IRES-GFP-construct blijkt 6-7 uur na elektroporatie 10. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Oogsten en Tissue Processing voor RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie <ol><li> Oogst de embryo behulp van een tang. Spoel de embryo in koude 1x PBS. Verwijder de hoofden van de embryo&#39;s, door te snijden het hoofd van zijn nekbehulp van een tang en plaats de koppen in 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C. Doorboord hersenen met behulp van een tang om de penetratie van de 4% paraformaldehyde in het hoofd toe. </li><li> Dehydrateer de koppen in 30% sucrose (in 1x PBS) O / N bij 4 ° C. </li><li> Monteer de hoofden in cryobeschermende medium door snel invriezen in een suspensie van droog ijs en methylbutaan (2-methylbutaan). U kunt ook een snelle bevriezing van de hoofden in cryobeschermende medium met vloeibare stikstof. Bewaar de gemonteerde koppen bij -80 ° C. </li><li> Cryosectie de koppen in 12 pm dikke coupes en het verzamelen van alle innerlijke-ear die weefsel secties op superfrosted microscoop glasplaatjes. </li><li> Voeren standaard RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie zoals hierboven beschreven 4,21 en analyseren EDU celproliferatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit. LET OP: Haar cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van konijnen polyklonaal α-MyosinVIIa (Myo7a) eentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) en fluorescentie-gemerkt secundair antilichaam (1: 250, geit anti-konijn AlexaFluor 488, Invitrogen). </li></ol> 4. Fotolader en Verwerking <ol><li> Neem beelden met digitale imaging apparatuur. Afbeelding immunohistochemie resultaten met een standaard fluorescentiemicroscoop en de resultaten van de in situ met een standaard wide-field microscoop (van 5x tot 40x in vergroting). </li><li> Verwerk de beelden met behulp van software voor beeldverwerking. </li></ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li>
<li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li>
<li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+production+in+the+chicken+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li>
<li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li>
<li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050(2008).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li>
<li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode%3A+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li>
<li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear%3A+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li>
<li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li>
<li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871(2012).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li>
<li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li>
<li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li>
<li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven werkwijze in ovo micro-elektroporatie is geoptimaliseerd voor genoverdracht naar de ontwikkeling auditieve orgaan. Het is compatibel met plasmide-DNA-expressievectoren doorgaans gebruikt om genfunctie / expressie manipuleren. De timing van elektroporatie op E4 optimaal voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. De meest kritische stappen worden micro-injecteren van de DNA in de otic vesicle lumen zonder te diep met de naald en beschadiging van de otic blaasj...

Ondanks verschillen in morfologie en cellulaire patroonvorming tussen de zoogdieren en vogels auditieve zintuig, worden de moleculaire factoren en routes die verantwoordelijk zijn voor de sensorische HC ontwikkeling gedacht evolutionair geconserveerd 1-3. De basilaire papilla, die de auditieve HK&#39;s en hun omgeving SC huizen, ontwikkelt zich als een outpocketing van het binnenoor otocyst. Vroeg op een pool van HC en SC voorlopers wordt opgegeven binnen de otic placode / otic cup neurale-zintuiglijke bevoegde domein (NSD). Fate-kaartgegevens leveren het bewijs dat de neuronale en sensorische lijnen zijn met elkaar verbonden en komen voort uit de NSD in de antero-ventrale regio van de otic beker of otocyst bij muizen en kippen 4,5. Eerst, neuroblasts delamineren van de NSD invloed kunnen uitoefenen neuronen van de auditieve-vestibulaire ganglion, die uiteindelijk verdeeld auditieve en vestibulaire ganglia geven. Deze neuronen innerveren sensorische HC van het binnenoor en kernen in de hersenstam. De cellen thten blijven in de NSD wordt gedacht dat ze ontstaan ​​verschillende sensorische patches, waaronder de auditieve zintuig geven, bestaande uit de in mechanisch sensorische transductie HK&#39;s en de bijbehorende SC. In zowel het kuiken en muizen, gehoororgaan sensorisch voorlopercellen celcyclus exit en HC differentiatie komen in tegengestelde gradiënten. In kuiken, auditieve progenitor celcyclus exit begint rond ~ E5 en vordert van de basis naar de top en van het centrum naar de periferie 6. Eén dag later, HC differentiatie begint de apex en zich ontwikkelt tot de basis 7. Het bestuderen van de ontwikkeling van het binnenoor van kip heeft vele technische voordelen als functionele mechanismen kunnen worden onderzocht met relatief gemak in ovo tegenover manipuleren van embryo&#39;s in de baarmoeder in andere modelsystemen die complexe operaties vereist. De hier beschreven methode gebruikt in ovo micro-elektroporatie genen van belang richten in de vermoedelijke basilar papilla gebied anterior-ventraal in de otic blaasje specifiek op E4. Elektroporatie in ovo is een techniek die goed ingeburgerd en veelgebruikte 8-14. Het principe van de electroporatie techniek is gebaseerd op het feit dat nucleotiden (bijvoorbeeld plasmide-DNA, synthetisch DNA of RNA oligonucleotiden) negatief geladen zijn. Het DNA wordt geïnjecteerd in het weefsel van belang. Wanneer een elektrische stroom wordt geplaatst in het weefsel, de huidige opent tijdelijke poriën in de celwanden en maakt de opname van het DNA, als negatief geladen DNA stroomt naar de positieve elektrode (anode). Voor gain-of-function experimenten worden genen van belang gewoonlijk gekloneerd in expressieplasmiden die geschikt expressiecassettes voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) bevatten. Voor loss-of-function experimenten plasmide gebaseerde dominant negatief repressor constructen, of RNAi, of morfolino constructen commonly gebruikt 15,16. Om microRNA (miRNA) functie miRNAs spons constructen, die typisch gebaseerd plasmide remmen, kan worden gebruikt 17. De hier beschreven werkwijze maakt het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de proliferatie en differentiatie regelen in het auditieve orgaan, zoals de in ovo micro-elektroporatiewerkwijze gemakkelijk met in ovo celproliferatie assay kan worden gecombineerd door toevoeging EDE het hele embryo. De elektroporatie en toevoeging van EDU wordt uitgevoerd bij E4 in het otische vesikel, één dag voor het begin van celcyclus exit in het auditieve orgaan. Analyse van het gehoororgaan is meestal uitgevoerd 18-96 uur na elektroporatie bij E5 (aanvang van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus exit), E6 (begin van de HC differentiatie), en E7 (bij HC differentiatie); en later tot ~ E9 (einde van HC differentiatie). Dit elektroporatie methode van genoverdracht is van voorbijgaande aard blijvende ongeveer ~ 4 dagen, because de genen van belang niet integreren in het genoom, maar de methode is toepasbaar voor gebruik met geschikte plasmide-DNA-expressievectoren, die wel de mogelijkheid om te integreren in het genoom, zoals Tol2 gemedieerde genoverdracht 11. Met deze methode robuuste GFP of RFP expressie duurt ~ 4 dagen in het slakkenhuis, waarna wijzen de signalen vervagen, maar toch zorgen voor een ruime tijd venster naar de ingewikkelde ontwikkeling van het gehoororgaan te bestuderen. Dit in ovo genoverdracht werkwijze is nieuw en maakt specifiek te richten de vermoedelijke gehoororgaan in E4, die optimaal is voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. Het is een goede aanvulling op alternatieve werkwijzen die elektroporatie bij veel jongere ontwikkelingsstadia 11,12 of vergelijking met het gebruik van in vitro basilaire papillae explantkweken 18.

<table><tbody><tr><td>Sterile 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Rechtshandige &amp; Linkshandige Micromanipulators</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R &amp; M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Twee 12 mm Magnetische Houder Stages met 7 inch verticale poten</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metalen stalen bodemplaat 12x24 inch</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Scharen voor Eieren 12 cm lang gebogen, 12 mm extrafijne messen; Veerscharen</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropijptrekmachine voor het trekken van naalden</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Box Platina Verwarmingsdraad</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen Capillaire Buizen/Naalden/Zonder Vezel/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glazen Spuit 100 &mu;l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineraal Olie (Zwaar) voor Hamilton Glazen Spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen Slang voor het verbinden van de Glazen Spuit en Glazen Capillaire Naalden/ Niet-Toxisch</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Wegwerpspuiten</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp 21 Gauge Naalden</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Eén paar 2 mm Platina Elektroden</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Elektrode Houder</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Eén paar Dumont fijne pincetten nummer 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mat finish onzichtbaar plakband voor het afdichten van eieren</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes met katoen</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Steriele filtertips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; in ovo</em&gt; micro-elektroporatie

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Kippenembryo&#39;s zijn ideaal modelsystemen voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling manipulaties genfunctie kan worden uitgevoerd met relatief gemak in ovo. Het binnenoor auditieve zintuig is van cruciaal belang voor ons vermogen om te horen. Het herbergt een zeer gespecialiseerde sensorische epitheel, dat bestaat uit-mechanisch transduceren haarcellen (HC) en de omliggende glia-achtige ondersteunende cellen (SCS). Ondanks structurele verschillen in de auditieve organen worden moleculaire mechanismen reguleren van de ontwikkeling van het auditieve orgaan evolutionair geconserveerd tussen zoogdieren en Aves In ovo elektroporatie grotendeels beperkt tot beginfase E1 -. E3. Door de relatieve late ontwikkeling van het auditieve orgaan E5, manipulaties van het auditieve orgaan van in ovo elektroporatie verleden E3 moeilijk vanwege de gevorderde ontwikkeling van het kippenembryo in latere stadia. De hier gepresenteerde methode is een voorbijgaande genoverdracht methode voor het richten van genen van belang bijstadium E4 - E4.5 in de ontwikkelingslanden kip auditieve zintuig via in ovo micro-elektroporatie. Deze methode is toepasbaar voor gain en verlies-van-functie met conventionele plasmide-DNA-expressievectoren en kan worden gecombineerd met in ovo celproliferatie assay door toevoeging EDU (5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine) om het hele embryo in de tijdstip van elektroporatie. De toepassing van groen of rood fluorescerend eiwit (GFP of RFP) expressieplasmiden kan de experimentator om snel te bepalen of de elektroporatie succes het auditieve gedeelte van het binnenoor ontwikkeling gericht. Bij deze werkwijze document, zijn representatieve voorbeelden van GFP geëlektroporeerd specimens geïllustreerd; embryo&#39;s werden geoogst 18-96 uur na elektroporatie en targeting van GFP aan de pro-sensorische gebied van het auditieve orgaan werd bevestigd door RNA in situ hybridisatie. De werkwijze papier verschaft ook een geoptimaliseerd protocol voor het gebruik van de thymidine analoog EDE cel Prolif analyserenking; Een voorbeeld van een EDU gebaseerd celproliferatie assay die immuno-labeling combineert en klik EDU chemie verschaft.

Bij deze werkwijze paper plasmide-DNA bestaat uit groene fluorescent eiwit (GFP) expressiecassettes werd gericht in de ontwikkelende kippenembryo basilaire papilla (BP) met geoptimaliseerde parameters van 12 V en 4 pulsen van 100 msec pulsduur en intervallen van 200 msec, hetgeen een ~ 50% embryo overleving en de efficiëntie van plasmide-DNA te richten in het BP. Fluorescente beeldvorming van natief GFP expressie in ontwikkelende embryo&#39;s vertoonden deze wijze van elektroporatie voor...

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Het algemene doel van deze methode is om genetische manipulaties uit te voeren in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip vanaf embryonale dag vier. Dit is van groot belang vanwege de moeilijkheid om te werken met het gevorderde ontwikkelingsstadium van het kippenembryo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het specifiek en met relatieve eenvoud het zich ontwikkelende gehoororgaan in ovo target, in vergelijking met andere technieken die complexe in utero chirurgie vereisen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de auditieve sensorische ontwikkeling, waaronder hoe het ruimtelijke en temporele patroon van proliferatie van sensorische progenitorcellen en erfelijk differentiatie zijn gecoördineerd. Om deze procedure te starten, bevestigt u de glazen capillaire naald met de slang die is verbonden met de glazen spuit, welke op de rechter micromanipulator is geplaatst, en plaatst u de elektroden op de linker micromanipulator.Snijd onder de microscoop de naaldpunt af met een pincet. Plaats vervolgens 2,5 µL plasma-DNA, gekleurd met 0,1% fast green, in een schaaltje. Vul de naald met plasma-DNA met behulp van de zuiger van de spuit die aan de rechter micromanipulator is bevestigd.Plaats een ei op zijn zijkant in een klemhulpmiddel. Knip vervolgens met een schaar een rond venster in de bovenkant van het ei. Plaats daarna het ei in het klemhulpmiddel onder de microscoop.Open voorzichtig de twee membranen die over het embryo liggen met een pincet om de rechter otische blaas bloot te leggen. Terwijl de kop van het embryo met een pincet in de linkerhand wordt gestabiliseerd, wordt met de micromanipulator in de rechterhand ongeveer 0,5 µL plasma-DNA toegediend. Wees voorzichtig om niet voorbij het lumen van de otische blaas te injecteren, omdat dit de otische blaas beschadigt.Het micro-injecteren van DNA in het lumen van de otische blaas zonder deze te beschadigen is cruciaal en vereist het gebruik van beide handen. Gebruik direct na de micro-injectie de micromanipulator van de linkerhand om de twee millimeter platina positieve en negatieve elektrode-set anteroventraal ten opzichte van de rechter otische blaas te plaatsen, en lever vier pulsen van 12 volt af door de electroporador te bedienen. De nauwkeurige plaatsing van de elektroden op het anteroventrale presumptieve gehoororgaangebied is belangrijk en zorgt ervoor dat het ontwikkelende gehoororgaan wordt getarget.Voeg direct na electroporatie 50 µL EdU toe aan het gehele embryo in ovo. Verzegel vervolgens het ei met plakband. Plaats alle gemanipuleerde en verzegelde eieren voor 18 tot 96 uur terug in de incubator.Verwijder na 18 tot 24 uur voorzichtig de tape. Controleer de embryo's met een standaard fluorescentiemicroscoop op een fluorescent GFP- of RFP-signaal binnen de otische vesikel. Als er een fluorescent signaal aanwezig is, oogst dan de embryo's voor analyses of verzegel ze opnieuw met tape en plaats ze terug in de incubator om ze in latere stadia te oogsten en te analyseren.RNA in situ hybridisatie werd gebruikt om vast te stellen of electroporatie succesvol was gericht op het auditieve gedeelte van het ontwikkelende binnenoor. Binnen de ontwikkelende BP werden sensorische progenitorcellen geïdentificeerd aan de hand van hun expressie van Sox2 en Lunatic Fringe. Deze afbeeldingen tonen aan dat sensorische progenitorcellen in de gehele ontwikkelende BP bij de basis en de apex succesvol waren getarget en GFP tot expressie brachten na 68 uur electroporatie.Daarnaast werd GFP tot expressie gebracht buiten het sensorische domein in niet-sensorische epitheelcellen en in het auditieve ganglion, aangemerkt door Neurod1-expressie. Om het proliferatieve gedrag van sensorische progenitorcellen te bepalen, werd EdU, een thymidine-analogon, toegevoegd op het moment van electroporatie op E vier, en vier dagen later werd de EdU-incorporatie in de ontwikkelende BP geanalyseerd in weefselcoupes. Immunolabeling voor het haarcel-specifieke eiwit, Myosin7a, werd gebruikt om differentiërende haarcellen in de ontwikkelende BP te identificeren. In het apicale gedeelte van de BP waren Myo7a-positieve haarcellen frequent EdU-positief.Terwijl in de basis slechts enkele Myo7a-positieve haarcellen EdU hadden ingebouwd, wat suggereert dat de sensorische progenitorcellen in de basis op het moment van de EdU-toevoeging bij E4 al grotendeels postmitotisch zijn. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vijf tot acht minuten per ei worden voltooid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vers bereide en steriele reagentia te gebruiken om het overleven van de embryo's te waarborgen.Na deze procedure kunnen de parameters van de methode worden aangepast om andere fenomenen in het ontwikkelende binnenoor te bestuderen, zoals de ontwikkeling van de vestibulaire organen en de neurogenese van het binnenoor. Deze techniek maakt het voor onderzoekers in het vakgebied van het binnenoor mogelijk om specifiek het relatief laat ontwikkelende gehoororgaan van de kip te bestuderen vanaf embryonale dag vier en daarna. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het kiजembryo correct hanteert, micro-injectie en electroporatie uitvoert, en de in ovo celproliferatie-assay uitvoert.

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo's. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Werkwijze voor genoverdracht in kippenembryo's bij later stadium incubatie (ouder dan Hamburger Hamilton fase (HH) 22) beschreven. Deze methode overwint...

Gentransfer in Oudere kippenembryo&#39;s door<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporatie

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Leer een gemodificeerde in ovo micro-elektroporatiemethode voor genetische manipulatie in het ontwikkelende gehoororgaan van de kip vanaf embryonaal dag vier. Deze techniek vereenvoudigt het bestuderen van proliferatie en differentiatie van auditieve progenitorcellen zonder complexe chirurgie.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door

Meer video's verkennen